洪偉勇，王金明，王海英，周雪峰，郭鈁元，楊根生*

·藥劑與工藝·

載姜黃素兩親性星狀聚酯納米粒的制備、表征及體外抗腫瘤研究

洪偉勇1, 2，王金明1，王海英1，周雪峰1，郭鈁元2，楊根生2*

1. 臺(tái)州市立醫(yī)院 藥劑科，浙江 臺(tái)州 318000 2. 浙江工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310032

制備載姜黃素兩親性星狀聚酯納米粒（Cur-NPs），以解決其穩(wěn)定性差、生物利用度低等問題。通過開環(huán)聚合反應(yīng)和酯化反應(yīng)合成兩親性星狀聚酯（DPE-PCL-mPEG）作為納米粒的載體材料，傅立葉變換顯微紅外光譜（FT-IR）、1H-NMR和凝膠滲透色譜（GPC）表征確定其結(jié)構(gòu)和相對(duì)分子質(zhì)量。溶劑揮發(fā)法制備Cur-NPs，考察其粒徑、ξ電位、載藥量、包封率。對(duì)Cur-NPs進(jìn)行穩(wěn)定性、體外釋放、材料安全性、體外抗腫瘤和細(xì)胞攝取能力考察。成功合成DPE-PCL- mPEG，制備的Cur-NPs平均粒徑為（86.00±2.01）nm，ξ電位為（?9.40±0.09）mV，包封率為（95.51±1.23）%，載藥量為（5.52±0.54）%。Cur-NPs具有良好的穩(wěn)定性和緩釋能力。細(xì)胞毒性、細(xì)胞攝取和體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，空白納米粒（blank- NPs）具有良好的生物安全性；相對(duì)于姜黃素溶液，Cur-NPs對(duì)人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的生長抑制作用更明顯，并且具有更強(qiáng)的入胞能力。Cur-NPs理化性質(zhì)理想，能有效提高藥物體外生物活性，為姜黃素的臨床應(yīng)用提供了新的解決方案。

兩親性星狀聚酯；納米粒；姜黃素；體外釋放；人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞；抗腫瘤；穩(wěn)定性；開環(huán)聚合反應(yīng)；生物利用度；酯化反應(yīng)；溶劑揮發(fā)法；緩釋；細(xì)胞毒性；細(xì)胞攝取；生物安全性

目前，癌癥是全球第2大致死疾病，每年超過1000萬人被確診為癌癥[1]，90%以上的癌癥在潛伏期沒有明顯癥狀，直到中晚期才被發(fā)現(xiàn)?；熓桥R床上治療中晚期癌癥的主要方式之一，可以延緩癌癥的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移；但缺乏靶向性，對(duì)正常組織有明顯的毒副作用[2]，容易導(dǎo)致多藥耐藥和變態(tài)反應(yīng)。姜黃素（curcumin，Cur）是從姜黃根莖中提取的天然產(chǎn)物[3]，經(jīng)FDA認(rèn)證具有很好的安全性，可以通過多種分子機(jī)制抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移[4-5]，還可以逆轉(zhuǎn)多藥耐藥性[5]。但姜黃素難溶于水、易降解、體內(nèi)生物利用度低等特點(diǎn)[6]嚴(yán)重限制其臨床應(yīng)用。因此，急需研究新劑型以解決藥物遞送的一系列問題。

近年來，隨著納米技術(shù)[7-8]的發(fā)展，納米給藥體系可以有效地改變藥物在體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征，從而實(shí)現(xiàn)藥物的緩釋及靶向遞送，減輕毒副作用、提高療效[9-11]。星狀聚合物因其具有獨(dú)特的空間形態(tài)，自組裝成粒后，內(nèi)部可形成巨大的空腔；相比直鏈聚合物，星狀聚合物制備的納米粒具有更高的載藥量和包封率[12-13]，是一種良好的納米載體。聚乙二醇是廣泛使用的親水性材料[14]，常與其他載體材料共價(jià)連接[15-17]，以增加納米粒的穩(wěn)定性和體內(nèi)循環(huán)時(shí)間[17]。結(jié)合星狀聚合物與聚乙二醇特性，將兩者通過共價(jià)鍵連接成為一種新型兩親性星狀聚酯，不僅可以實(shí)現(xiàn)姜黃素的高效包載，還可以有效避免網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對(duì)納米粒的清除，延長體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。此外，納米?？梢酝ㄟ^實(shí)體瘤的高通透性和滯留效應(yīng)（EPR效應(yīng)），使藥物在腫瘤部位富集，增加藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞幾率，從而提高藥物生物利用度實(shí)現(xiàn)治療腫瘤目的。

基于此，本實(shí)驗(yàn)選用雙季戊四醇（dipentaerythritol，DPE）、?-環(huán)己內(nèi)酯（?-cyclocaprolactone，?-CL）和聚乙二醇單甲醚（polyethylene glycol monomethyl ether，mPEG，相對(duì)分子質(zhì)量5000）通過開環(huán)聚合和酯化反應(yīng)合成兩親性星狀聚酯DPE-PCL-mPEG，以姜黃素為模型藥物，采用溶劑揮發(fā)法[18]制備載姜黃素納米粒（Cur- NPs），對(duì)其物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征。選取人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞為模型細(xì)胞，進(jìn)一步考察該納米粒的細(xì)胞毒性、體外抗腫瘤活性和入胞能力。以期得到一種粒徑小、安全性高、穩(wěn)定性好、抗腫瘤活性良好的納米給藥體系，為姜黃素的臨床應(yīng)用提供新的解決途徑。

1 材料與儀器

1.1 材料

姜黃素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，杭州廣林生物醫(yī)藥有限公司；異辛酸亞錫［Sn(Oct)2］，化學(xué)純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；?-CL，分析純，阿拉丁公司；DPE、mPEG、,′-二環(huán)已基碳二亞胺（,′- dicyclohexylcarbodiimide，DCC）、4-二甲氨基吡啶（4-dimethylaminopyridine，DMAP）、聚山梨酯80（化學(xué)純），阿拉丁公司；丁二酸酐、三乙胺，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；四氫呋喃、乙腈為色譜純；人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，中國科學(xué)院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，浙江天杭生物科技股份有限公司；0.25%胰蛋白酶，Gibco公司；96孔板、細(xì)胞培養(yǎng)皿，耐思生物科技有限公司；MTT，索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器

Malvern ZS90激光納米粒徑測(cè)定儀，英國馬爾文儀器有限公司；UV-2102紫外可見分光光度計(jì)，美國尤尼柯公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī)，杭州諾丁科學(xué)器材有限公司；傅立葉變換顯微紅外光譜儀（FT- IR）、XIR高速冷凍離心機(jī)、超凈臺(tái)，Thermo Fisher公司；IL-161CT二氧化碳培養(yǎng)箱，施都凱儀器設(shè)備上海有限公司；酶標(biāo)儀，Biotek公司；熒光顯微鏡，Olympus公司；核磁共振波譜儀，Bruker公司；X射線衍射儀，PNAlytical公司；透射電鏡，日本電子株式會(huì)社。

2 方法與結(jié)果

2.1 DPE-PCL和DPE-PCL-mPEG的合成

DPE-PCL-mPEG合成分成3個(gè)步驟：首先，通過開環(huán)聚合反應(yīng)生成DPE-PCL。其次，用丁二酸酐修飾mPEG生成mPEG-COOH。最后，通過酯化反應(yīng)，生成DPE-PCL-mPEG。具體步驟如圖1所示。

2.1.1 DPE-PCL的合成 1 mmol的DPE、60 mmol的?-CL和0.06 mmol的Sn(Oct)2（催化劑）置于50 mL的三口瓶中，N2保護(hù)下，450 r/min磁力攪拌，120 ℃反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，冷卻至室溫，加入10 mL二氯甲烷溶解，再逐滴加至冰乙醚中，沉淀純化，抽濾收集粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物經(jīng)二次沉淀純化后于真空干燥箱干燥至恒定質(zhì)量，稱定質(zhì)量計(jì)算DPE- PCL產(chǎn)率。

圖1 DPE-PCL-mPEG的合成路線

2.1.2 mPEG-COOH的合成 2 mmol mPEG、3 mmol的丁二酸酐和15 mL的吡啶在100 mL三口瓶內(nèi)攪拌溶解。加入0.002 mmol DMAP（催化劑）和0.02 mmol三乙胺（縛酸劑），N2保護(hù)下，450 r/min磁力攪拌，室溫反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后，逐滴加至冰乙醚中，沉淀純化，抽濾收集粗產(chǎn)物。10 mL二氯甲烷溶解粗產(chǎn)物后逐滴加至冰乙醚中，再次沉淀純化，抽濾收集產(chǎn)物，于真空干燥箱干燥至恒定質(zhì)量，稱定質(zhì)量計(jì)算mPEG-COOH產(chǎn)率。

2.1.3 DPE-PCL-mPEG的合成 稱取1 mmol的DPE-PCL和1 mmol的mPEG-COOH于50 mL的三口瓶中，加入1 mL乙腈攪拌溶解。再加入1 mmol的DCC（催化劑）和0.1 mmol的DMAP（催化劑），N2保護(hù)下，450 r/min磁力攪拌，室溫反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后收集產(chǎn)物，方法同“2.1.2”項(xiàng)。

2.2 DPE-PCL和DPE-PCL-mPEG的表征

通過FT-IR和1H-NMR確定DPE-PCL和DPE- PCL-mPEG結(jié)構(gòu)；凝膠滲透色譜（GPC）[16]和1H- NMR分別計(jì)算DPE-PCL和DPE-PCL-mPEG相對(duì)分子質(zhì)量。

DPE-PCL的FT-IR結(jié)果如圖2所示，其酯鍵中C＝O的伸縮振動(dòng)峰出現(xiàn)在1 726.3 cm?1，-C-O-C-的不對(duì)稱振動(dòng)峰和對(duì)稱振動(dòng)峰分別出現(xiàn)在1 295.5、1 191.5 cm?1。而2 945.3、2 866.3、1 471.0、732.5 cm?1這4個(gè)吸收峰歸屬于PCL片段上的亞甲基中C-H的特征峰。DPE-PCL的1H-NMR分析結(jié)果如圖3-A所示。圖中-O-CH2-、-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-、-CH2- CH2-CH2-CH2-CH2-和-CH2-COO-均為PCL片段上的特征峰，其化學(xué)位移分別為2.32（a）、1.39（b）、1.66（d）、4.06（c）。而PCL的末端亞甲基質(zhì)子峰（-CH2-OH），由于受末端羥基的影響其化學(xué)位移向低場移至3.65（e）。此外其相對(duì)分子質(zhì)量可以通過c與e之間的峰面積積分比計(jì)算，結(jié)果見表1。FT-IR和1H-NMR的結(jié)果表明DPE-PCL已成功合成。

圖2 DPE-PCL和DPE-PCL-mPEG的FT-IR圖

圖3 DPE-PCL (A) 和DPE-PCL-mPEG (B) 的核磁圖

DPE-PCL-mPEG的FT-IR結(jié)果如圖2所示，與DPE-PCL的FT-IR結(jié)果相比較，DPE-PCL-mPEG除了PCL片段中出現(xiàn)的酯鍵和亞甲基的特征峰，還出現(xiàn)了mPEG中醚鍵（-C-O-C-）的特征峰，分別位于1 140.0、1 061.7 cm?1。DPE-PCL-mPEG的1H- NMR分析結(jié)果如圖3-B所示，3.65（g）、3.39（f）為mPEG中-CH2-CH2O-和-OCH3的特征峰。而2.32（a）、1.39（b）、1.66（d）、4.07（c）為DPE-PCL- mPEG中PCL片段中亞甲基的特征峰。此外，通過f與g之間的峰面積積分比計(jì)算其相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)果見表1。FT-IR和1H-NMR的結(jié)果表明已成功合成DPE-PCL-mPEG。

表1 DPE-PCL和DPE-PCL-mPEG的相對(duì)分子質(zhì)量、PDI與產(chǎn)率

na為GPC中測(cè)得的數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量，PDI為GPC中測(cè)得的多分散指數(shù)，nb為1H-NMR中計(jì)算得出的相對(duì)分子質(zhì)量

nais the number average molecular weight measured by GPC, PDI is the polydispersion index measured by GPC, andnbis the relative molecular weight calculated by1H-NMR

DPE-PCL和DPE-PCL-mPEG的GPC分析結(jié)果如圖4和表1所示，2個(gè)化合物的GPC曲線均是單峰且基本對(duì)稱，多分散指數(shù)（PDI）分別為1.08和1.14，相對(duì)分子質(zhì)量分布均比較集中。另外GPC中測(cè)得的數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量與1H-NMR中計(jì)算得到的相近，表明該聚合物聚合度較均勻。

圖4 DPE-PCL和DPE-PCL-mPEG的GPC數(shù)據(jù)

2.3 姜黃素分析方法的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱為Axxlaim?Polar Advantage II-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-0.6%乙酸水溶液（60∶40）；體積流量1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長420 nm；柱溫30 ℃。

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取姜黃素對(duì)照品2.0 mg，用乙腈溶解并定容至10 mL，配制成姜黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.3.3 專屬性實(shí)驗(yàn) 取適量的姜黃素和納米粒，乙腈溶解，配制成姜黃素溶液、空白納米粒溶液（blank-NPs）、載藥納米粒溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)。HPLC檢測(cè)圖譜如圖5所示，姜黃素保留時(shí)間為6.9 min，峰形較好，姜黃素與雜峰分離較好，載體材料對(duì)檢測(cè)無干擾，方法專屬性好，適用于納米粒的包封率和載藥量測(cè)定。

2.3.4 線性關(guān)系考察 取適量對(duì)照品溶液，用流動(dòng)相稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，0.22 μm微孔濾過，檢測(cè)姜黃素含量。以姜黃素的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積積分值為縱坐標(biāo)（）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程＝1.566 9＋0.008 6，2＝0.999 8，結(jié)果表明姜黃素在0.1～8.0 μg/mL線性關(guān)系良好，該方法適用于姜黃素的含量測(cè)定。

圖5 姜黃素(A)、blank-NPs (B) 和Cur-NPs (C) 的HPLC的圖譜

2.3.5 精密度試驗(yàn) 在線性范圍內(nèi)，精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別配制質(zhì)量濃度為0.5、2.0、6.0 μg/mL的對(duì)照品溶液，HPLC測(cè)定質(zhì)量濃度并計(jì)算RSD分別為0.10%、0.20%、0.07%、RSD均＜2%，該方法精密度良好，方法可行。

2.3.6 回收率試驗(yàn) 分別取質(zhì)量濃度為6.0 μg/mL的姜黃素對(duì)照品溶液2、3、4 mL置于10 mL量瓶中，取0.5 mL空白納米粒溶液加入樣品中，流動(dòng)相定容，制得質(zhì)量濃度分別為1.2、1.8、2.4 μg/mL的溶液，0.22 μm微孔濾過，按“2.3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，每個(gè)質(zhì)量濃度平行操作3次，計(jì)算回收率。回收率試驗(yàn)結(jié)果顯示，1.2、1.8、2.4 μg/mL的回收率分別為98.56%、99.25%、99.12%，RSD分別為1.79%、1.21%、0.98%，回收率均在95%～105%，RSD均＜2%，符合方法學(xué)要求。

2.4 Cur-NPs的制備

2.4.1 制備方法 溶劑揮發(fā)法制備Cur-NPs混懸液，精密稱取姜黃素和DPE-PCL-mPEG，丙酮溶解后緩慢滴加入純水中，450 r/min磁力攪拌30 min。40 ℃下真空干燥3 h，4 ℃下低速離心10 min （6000 r/min）以除去游離姜黃素，得到Cur-NPs?？瞻准{米粒（blank-NPs）的制備除不加藥物，其余步驟相同。

2.4.2 包封率和載藥量考察 取Cur-NPs在15 000 r/min的轉(zhuǎn)速下高速離心60 min，收集并干燥沉淀，精密稱定質(zhì)量，加丙酮溶解定容，測(cè)定姜黃素含量，根據(jù)公式計(jì)算納米粒的載藥量和包封率。

包封率＝姜黃素/投藥量

載藥量＝姜黃素/Cur-NPs

姜黃素為Cur-NPs中姜黃素的質(zhì)量，投藥量為投入姜黃素的質(zhì)量，Cur-NPs為Cur-NPs的質(zhì)量

2.4.3 單因素考察 分別考察姜黃素與DPE-PCL- mPEG的質(zhì)量比（藥材比，1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）、有機(jī)相與水相的體積比（脂水比，1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7）及姜黃素的質(zhì)量濃度（1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mg/mL）這3個(gè)因素對(duì)制備Cur-NPs的影響。以平均粒徑、PDI、包封率和載藥量為指標(biāo)，優(yōu)化制備Cur-NPs的處方。

單因素考察結(jié)果見表2，姜黃素與DPE-PCL- mPEG的質(zhì)量比、姜黃素的質(zhì)量濃度、有機(jī)相與水相的體積比對(duì)納米粒的大小、載藥量和包封率均有影響，對(duì)PDI幾乎沒有影響。其中在姜黃素與DPE-PCL-mPEG的質(zhì)量比為1∶20，有機(jī)相與水相的體積比為1∶5，姜黃素的質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL的條件下，Cur-NPs的平均粒徑理想，載藥量和包封率最高。

2.4.4 Box-Behnken效應(yīng)面優(yōu)化Cur-NPs處方 使用軟件Design Expert 10中的Box-Behnken效應(yīng)面，設(shè)置因素1（姜黃素與DPE-PCL-mPEG的質(zhì)量比）、2（有機(jī)相與水相的體積比）和3（姜黃素的質(zhì)量濃度），輸入相應(yīng)的平均粒徑、PDI、包封率和載藥量。根據(jù)Hassan方法將粒徑和PDI結(jié)果用公式max處理，包封率和載藥量結(jié)果用公式min處理。最后根據(jù)公式計(jì)算總評(píng)歸一值（OD），優(yōu)化制備處方。

表2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

max＝(Y－min)/(max－min)

min＝(min－Y)/(max－min)

OD＝(12…d)1/k

根據(jù)單因素結(jié)果確定1、2和33個(gè)因素的考察范圍分別為11∶10～1∶30、21∶3～1∶7和31.5～3.5，每個(gè)因素設(shè)置5個(gè)水平，OD值和方差分析結(jié)果見表3、4，通過擬合得到方程：OD＝ 0.825 7－0.082 101－0.017 852＋0.073 583＋0.030 7312＋0.059 4313－0.038 8323－ 0.029 2612－0.223 5022－0.563 4032。其三維曲線圖見圖6。最終得到最優(yōu)處方：姜黃素與DPE- PCL-mPEG的質(zhì)量比為1∶17.8，有機(jī)相與水相的體積比為1∶4.9，姜黃素的質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL。

表3 Box-Behnken效應(yīng)面制備處方和結(jié)果

表4 OD值方差分析

圖6 OD值與X1、X2、X3 3個(gè)因素的三維曲面圖

表5 Cur-NPs的物理化學(xué)表征(, n = 3)

2.5 Cur-NPs的表征

2.5.1 納米粒的平均粒徑、ξ電位、包封率和載藥量 取Cur-NPs，在25 ℃下，馬爾文粒徑儀測(cè)定其平均粒徑和ξ電位；包封率和載藥量計(jì)算方法同“2.4.2”項(xiàng)。結(jié)果見表5，Cur-NPs呈負(fù)電荷，可有效減少血漿蛋白在粒子表面吸附[19]和被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除[20]，增加其體內(nèi)穩(wěn)定性和循環(huán)能力；Cur- NPs具有較理想的包封率和載藥量。

2.5.2 Cur-NPs的形態(tài) 取1滴blank-NPs或Cur- NPs置于銅網(wǎng)（200目）上，2%磷鎢酸鈉染色，濾紙吸去過量的染色劑，將樣品在室溫下干燥，在透射電子顯微鏡下觀察納米粒形態(tài)（圖7），blank-NPs和Cur-NPs呈較規(guī)整的球形，呈單分散狀態(tài)，平均粒徑約為80 nm與激光粒度儀測(cè)定結(jié)果相符。

圖7 Blank-NPs (A) 和Cur-NPs (B) 的透射電鏡圖

2.6 Cur-NPs的穩(wěn)定性考察

取2 mL Cur-NPs分別加入8 mL 0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4）和含10%血清（FBS）的0.01 mol/L PBS（pH 7.4），37 ℃下靜置保存，在0、1、4、8、12、24 h取樣并測(cè)定其平均粒徑和ξ電位。

Cur-NPs在PBS（pH 7.4）和PBS＋10% FBS（pH 7.4）中的穩(wěn)定性結(jié)果如圖8所示。24 h內(nèi)Cur- NPs在PBS中平均粒徑從86.5 nm增大至88 nm，沒有明顯波動(dòng)；但在PBS＋10% FBS中粒徑從86.5 nm增大至93 nm，可能是由于血清中的蛋白在Cur- NPs表面少量附著導(dǎo)致粒徑略有增大，但10 h后粒徑不再有明顯的波動(dòng)，表明Cur-NPs處于穩(wěn)定狀態(tài)。此外，Cur-NPs在PBS和PBS＋10% FBS中ξ電位變化均在1 mV以內(nèi)，沒有明顯改變。結(jié)果表明Cur- NPs穩(wěn)定性良好。

圖8 Cur-NPs在PBS和PBS＋10% FBS中24 h中的平均粒徑(A) 和ξ電位(B) 的變化曲線圖 (n = 3)

2.7 X-射線衍射（X-ray diffraction，XRD）表征

取4 mL Cur-NPs和blank-NPs冷凍干燥，將凍干的Cur-NPs和blank-NPs，以及姜黃素粉末，用XRD進(jìn)行表征，觀察其表面結(jié)構(gòu)特征。姜黃素、Cur-NPs和blank-NPs粉末的XRD結(jié)果如圖9所示，其中，姜黃素具有明顯的特征峰；Cur-NPs和blank- NPs的圖譜比較相似，姜黃素特征峰基本消失；由此可證明姜黃素被包裹在納米粒中，而非吸附在納米粒表面。

圖9 姜黃素、Cur-NPs和blank-NPs粉末的XRD

2.8 體外釋放研究

將姜黃素溶液（Cur-DMSO，姜黃素用1% DMSO水溶液溶解）和Cur-NPs分別用純化水稀釋至姜黃素質(zhì)量濃度為60 μg/mL，取1 mL溶液至透析袋（截留相對(duì)分子質(zhì)量為14 000）中，加入200 mL 0.01 mol/L PBS（pH 7.4，含0.5%聚山梨酯80）為釋放介質(zhì)，置于37 ℃、100 r/min的恒溫震蕩箱內(nèi)，在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)取出5 mL釋放介質(zhì)，并補(bǔ)充相同體積的新鮮介質(zhì)，測(cè)定并計(jì)算藥物的累積釋放率，每組平行3份。

C為釋放各時(shí)間點(diǎn)測(cè)得釋放介質(zhì)中的姜黃素的質(zhì)量濃度，為釋放介質(zhì)的總體積，0為每次取樣的體積，姜黃素為透析袋中姜黃素的總質(zhì)量

以PBS（pH 7.4）模擬體內(nèi)循環(huán)環(huán)境，Cur-DMSO為對(duì)照，研究Cur-NPs中姜黃素的釋放行為，結(jié)果如圖10所示。Cur-DMSO在0～12 h內(nèi)姜黃素快速釋放，在12 h累積釋放率達(dá)到78%，其平均釋放速率約為6.50%/h；12 h后釋放趨于平緩，48 h時(shí)基本完全釋放，累積釋放率達(dá)到94.44%。Cur-NPs的釋放過程分3個(gè)階段：在第1階段（0～4 h）姜黃素基本沒有釋放，可能由于Cur-NPs表面無姜黃素附著，姜黃素需從Cur-NPs內(nèi)向外擴(kuò)散才能釋放，這一現(xiàn)象與XRD結(jié)果相符；在第2階段（5～48 h），隨著Cur-NPs向外擴(kuò)散通道的形成，姜黃素平緩釋放，累積釋放率從0.3%增加到69.9%，平均釋放速率為每小時(shí)1.62%，遠(yuǎn)低于Cur-DMSO釋放速率，說明Cur-NPs具有良好的緩釋能力；第3階段（48 h后），Cur-NPs的釋放速率趨于平緩，72 h時(shí)累積釋放率達(dá)到80.88%。

圖10 Cur-DMSO和Cur-NPs在PBS中的體外釋放曲線 (n = 3)

2.9 細(xì)胞毒性考察

用MTT法檢測(cè)blank-NPs對(duì)U251細(xì)胞的細(xì)胞毒性，將處于對(duì)數(shù)生長期的U251細(xì)胞以每孔8×103個(gè)接種于96孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。將blank-NPs用新鮮培養(yǎng)基稀釋至50～ 800 μg/mL，棄去原有的培養(yǎng)基，每孔分別加入100 μL含blank-NPs的不同濃度培養(yǎng)基和新鮮培養(yǎng)基（對(duì)照組，細(xì)胞存活率為100%），各組平行5份，另設(shè)無細(xì)胞孔為空白組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入10 μL MTT（5 mg/mL）。37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄去舊培養(yǎng)基，加入150 μL的DMSO，并在酶標(biāo)儀上于波長490 nm處測(cè)定吸光度（），計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(實(shí)驗(yàn)－空白)/(對(duì)照－空白)

實(shí)驗(yàn)為實(shí)驗(yàn)組測(cè)得的值，對(duì)照為對(duì)照組測(cè)得的值，空白為空白組測(cè)得的值

Blank-NPs的細(xì)胞毒性結(jié)果如表6所示。Blank- NPs對(duì)U251細(xì)胞的生長抑制與blank-NPs濃度呈正相關(guān)，當(dāng)blank-NPs質(zhì)量濃度高達(dá)800 μg/mL時(shí)U251細(xì)胞的存活率依舊保持在80%以上。表明NPs體系生物安全性良好。

表6 Blank-NPs在U251細(xì)胞中的細(xì)胞毒性(n = 5)

2.10 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長期的U251細(xì)胞以每孔1×105個(gè)接種于6孔板，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去培養(yǎng)基，將Cur-DMSO、Cur-NPs用新鮮培養(yǎng)基稀釋至20 μg/mL后，加至6孔板中，每孔加入1 mL。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)3 h后，棄去含藥培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，熒光顯微鏡觀察U251細(xì)胞的藥物攝取情況。熒光顯微鏡觀察U251細(xì)胞對(duì)Cur-DMSO和Cur-NPs的攝取結(jié)果如圖11所示，在相同條件下培養(yǎng)4 h后，可以觀察到Cur-NPs組細(xì)胞中的綠色熒光明顯要強(qiáng)于Cur- DMSO組；由此可知，相比Cur-DMSO，Cur-NPs具有更強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞侵襲能力。

2.11 體外抗腫瘤細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

MTT法測(cè)定Cur-DMSO和Cur-NPs對(duì)U251細(xì)胞的抗增殖效果，細(xì)胞培養(yǎng)方法同“2.9”項(xiàng)。將Cur-DMSO、Cur-NPs用新鮮培養(yǎng)基稀釋至藥物質(zhì)量濃度為2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 μg/mL，分別加入含U251細(xì)胞的96孔板中，每孔100 μL，各濃度平行5份。另設(shè)新鮮培養(yǎng)基為對(duì)照組（細(xì)胞存活率為100%），無細(xì)胞孔為空白組。培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，加入含10% MTT的培養(yǎng)基100 μL。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去舊培養(yǎng)基，加入150 μL的DMSO，酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm處值。按“2.9”項(xiàng)下公式計(jì)算細(xì)胞存活率，并用SPSS計(jì)算Cur- DMSO和Cur-NPs的半數(shù)抑制濃度（IC50）。

圖11 Cur-DMSO和Cur-NPs在U251細(xì)胞中的細(xì)胞攝取情況

在證實(shí)納米載體良好的生物安全性基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究Cur-DMSO和Cur-NPs對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗增殖能力，結(jié)果如表7所示。Cur-DMSO和Cur-NPs對(duì)U251細(xì)胞抗增殖能力均隨著藥物濃度的升高而上升。經(jīng)計(jì)算Cur-DMSO和Cur-NPs對(duì)U251細(xì)胞的IC50分別為20.92、14.74 μg/mL，表明Cur-NPs的體外抗腫瘤活性更強(qiáng)。其可能原因：在相同藥物質(zhì)量濃度下，Cur-NPs可以更好地被攝取進(jìn)入細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)胞內(nèi)釋放，使得腫瘤細(xì)胞內(nèi)具有更高的姜黃素質(zhì)量濃度，因而具有更強(qiáng)的抗增殖能力。

表7 Cur-DMSO和Cur-NPs在U251細(xì)胞中的抗增殖實(shí)驗(yàn)(n = 5)

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過開環(huán)聚合和酯化反應(yīng)成功合成了DPE-PCL-mPEG，采用溶劑揮發(fā)法制備了Cur-NPs，經(jīng)單因素考察和Box-Behnken效應(yīng)面選擇最優(yōu)處方，得到粒徑較小，分布均勻，理化特性理想的納米粒。體外釋放和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，Cur-NPs具有緩釋能力，且在PBS和PBS＋10% FBS中穩(wěn)定性良好。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)證實(shí)，blank-NPs具有較好的生物安全性。而細(xì)胞攝取和體外抗腫瘤實(shí)驗(yàn)表明，針對(duì)U251細(xì)胞，相比Cur-DMSO，Cur-NPs具有更強(qiáng)的抗腫瘤活性和入胞能力?？傊珼PE-PCL- mPEG是理想的載體材料，Cur-NPs能有效提高姜黃素生物利用度，是具有臨床應(yīng)用潛力的納米給藥系統(tǒng)；此外，該制劑的體內(nèi)藥學(xué)特性仍需進(jìn)行更系統(tǒng)、深入的研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation, characterization andanti-tumor evaluation of curcumin- loaded star-shaped polyester nanoparticles

HONG Wei-yong1, 2, WANG Jin-ming1, WANG Hai-ying1, ZHOU Xue-feng1, GUO Fang-yuan2, YANG Gen- sheng2

1. Department of Pharmcy, Taizhou Municipal Hospital, Taizhou 318000, China 2. College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China

Curcumin loaded amphiphilic star-shaped polyester nanoparticles (Cur-NPs) were prepared to improve the bioavailability of curcumin.Amphiphilic star-shaped polymers (DPE-PCL-mPEG) were synthesized by ring-opening polymerization and esterification and used as the polymer precursor of nanoscale drug carrier. The structures of polymers were characterized by FT-IR spectroscopy and1H-NMR. The molecular weights of polymers were determined viaGPC. Cur-NPs were prepared by solvent evaporation. The physicochemical properties such as particle size, zeta potential, drug loading, encapsulation efficiency, stability,drug release behavior andcytotoxicity, anti-proliferation efficacy and cellular uptake of Cur-NPs were studied.DPE-PCL-mPEG was successfully synthesized. The particle size, ξ potential, encapsulation efficiency and drug loading of Cur-NPs was (86.00 ± 2.01) nm, ξ potential (?9.40 ± 0.09) mV, (95.51 ± 1.23)% and (5.52 ± 0.54)%, respectively. In addition, the nanoparticles exhibited good stability and sustained release ability.cytotoxicity demonstrated that blank nanoparticles (blank-NPs) had favorable biosafety. Cur-NPs exhibited stronger anti-proliferation efficacy and better cellular uptake ability against U251 cell.Cur-NPs with ideal physicochemical properties were successfully prepared. This novel nanocarrier system can effectively improve the bioavailability of curcumin and have potential applications in drug delivery.

amphiphilic star-shaped polymers; nanoparticle; curcumin;release; U251 cell; anti-tumor; stability; ring-opening polymerization; bioavailability; esterification; solvent evaporation; sustained release; cytotoxicity; cellular uptake; biosafety

R283.6

A

0253 - 2670(2021)08 - 2237 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.006

2021-01-15

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（22078297）；浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY19B060012）；浙江省藥學(xué)會(huì)醫(yī)院藥學(xué)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（2017ZYY28）；浙江省藥學(xué)會(huì)醫(yī)院藥學(xué)專項(xiàng)科研基金項(xiàng)目（2016ZYY35）；臺(tái)州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（1901ky49）

洪偉勇（1985—），男，主管藥師，博士研究生，從事藥物新劑型與臨床藥學(xué)研究。Tel: (0576)88858266 E-mail: weiyongh@126.com

楊根生，男，教授，博士生導(dǎo)師，從事藥物新劑型與新技術(shù)研究。Tel: (0571)88871077 E-mail: yanggs@zjut.edu.cn

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]