魏祎

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南 新鄉(xiāng) 453000

近年來，2型糖尿病的發(fā)病率逐年升高，發(fā)病人群也逐漸趨向年輕化。2型糖尿病發(fā)病的主要機制之一就是胰島素抵抗。緩解胰島素抵抗是治療2型糖尿病及其并發(fā)癥極為重要方法之一。流行病學(xué)已證實，胰島素抵抗是糖尿病的獨立危險因素之一[1]。采用基因敲除等技術(shù)，敲除磷脂酰肌醇3激酶(P13K)調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110的基因均可導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，說明P13K對調(diào)節(jié)糖脂代謝具有重要作用。生長激素、短期超量攝食、肥胖及2型糖尿病均可增加P13Kp85的表達，從而使胰島素敏感性降低。黃芪多糖是黃芪中最重要的有效成分，研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗可明顯降低大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激水平，緩解糖尿病的發(fā)展[2]。本實驗擬通過研究高脂飼料誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠骨骼肌PI3K及其p85調(diào)節(jié)亞基水平的變化，以期闡明代謝綜合征患者胰島素抵抗發(fā)生的分子機制，旨在觀察黃芪多糖改善胰島素抵抗的作用及其對肥胖大鼠骨骼肌PI3K表達的影響，探討其治療胰島素抵抗的作用。

1 材料

1.1 動物雄性SPF級SD大鼠48只，8周齡，體質(zhì)量220～240 g，購于河南省實驗動物中心，許可證號：SCXK(豫)2017-0001，飼養(yǎng)于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實驗動物室，室溫保持在22～24 ℃，相對濕度為50%～55%，明暗周期12 h，自由飲水和攝食。

1.2 藥品與試劑黃芪多糖(含量：90%，方晟生物開發(fā)有限公司)；吡格列酮片(北京太洋藥業(yè)有限公司，批號：180702)；大鼠胰島素(insulin，INS)試劑盒(上海滬峰生物科技有限公司，貨號：F4431-A)；PrimeScript?RT-PCR 試劑盒(日本Takara公司，貨號 RR014A)；PVDF膜(法國Merk公司，貨號：ISEQ00010)；十二烷基磺酸鈉(加拿大Wisent公司，貨號：800-100-EG)；DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：ZLI-9018)；PI3Kp85α抗體(北京博奧森公司，貨號：bsm-33219M)；辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG(北京博奧森公司，貨號：bs-0295G-HRP)；引物由英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 儀器7020型全自動生化分析儀(日立公司)；752型紫外可見分光光度儀(上海菁華科技儀器有限公司)；AllegraTMX-22R型低溫高速離心機(美國Bechman公司)；DYCZ-22A型垂直電泳(北京市六一儀器廠)；Gene Genius型凝膠成象系統(tǒng)(美國SYNOPTICS公司)；PE-460型基因擴增儀(美國Perkin Elmer TM Corporation)。

2 方法

2.1 模型制備與動物分組將大鼠按隨機數(shù)字表法分為對照組和模型組，模型組大鼠給予高脂飼料(高脂飼料組成分為：普通飼料78%+10%熟牛油+10%蛋黃粉+1%膽固醇+1%膽酸鈉)，空白組給予普通飼料。飼養(yǎng)動物6周，將高脂模型組再次分為模型組、黃芪多糖組(400 mg·kg-1)、吡格列酮組(20 mg·kg-1)，每組12只，每日1次，連續(xù)干預(yù)4周。

2.2 生化指標的檢測心臟采血，離心，使用全自動生化分析儀檢測血清空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、三酰甘油(triglyceride，TG)、膽固醇(total cholesterol，TC)；酶聯(lián)免疫吸附法測定胰島素(insulin，INS)水平；同時計算胰島素敏感指數(shù)(ISI)。

ISI= Ln[1/(FBG×INS)]

2.3 內(nèi)臟脂肪相對含量(VM/W)取附睪脂肪墊、雙腎周脂肪墊、大網(wǎng)膜膜脂肪量，并稱其質(zhì)量，及大鼠的體質(zhì)量，計算大鼠內(nèi)臟脂肪相對含量。

VM/W=(附睪脂肪墊+雙腎周脂肪墊+大網(wǎng)膜膜脂肪量)/大鼠體質(zhì)量

2.4 RT-PCR法檢測大鼠骨骼肌PI3KmRNA表達取大鼠骨骼肌，提取總RNA，測定吸光度(A)值及A260/A280值并標化。每20 μL體系各取 1 μL 總RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃反應(yīng)60 min，95 ℃ 5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶，-20 ℃ 冰箱中保存。取2 μL 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做 RT-PCR，β-actin做內(nèi)參，共50 μL反應(yīng)體系。擴增條件：95 ℃預(yù)變性2 min后，94 ℃ 30 s，62 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

2.5 免疫印跡法檢測大鼠骨骼肌PI3Kp855α蛋白的表達大鼠骨骼肌加入蛋白裂解液勻漿后，取上清，測定蛋白濃度。取蛋白樣品行凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗抗體、內(nèi)參照 β-actin 和顯色底物，4 ℃ 孵育過夜，加二抗。β-actin、PI3Kp85α和辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗稀釋倍數(shù)11 000、1500和15 000。顯色、顯影，掃描。應(yīng)用分析軟件對條帶進行灰度值分析。

3 結(jié)果

3.1 黃芪多糖對肥胖模型大鼠血漿生物指標和VM/W的影響高脂飼養(yǎng)6周可致大鼠明顯肥胖，高脂模型組體重顯著增加(P<0.05，且高脂模型組較陰性對照組體重>20%)，并持續(xù)到造模第10周末；與空白組比較，模型組大鼠血清TG、TC、FINS、VF/W水平明顯升高(P<0.05)，ISI明顯下降(P<0.05)，提示高脂組大鼠骨骼肌存在胰島素抵抗和血脂異常。與模型組比較，黃芪多糖組及吡格列酮組的TG、TC、FINS、VF/W水平明顯降低(P<0.05)，ISI水平升高(P<0.05)。各組大鼠FBG的水平無明顯差別(P>0.05)。見表2。

表2 黃芪多糖對肥胖模型大鼠血漿生物指標和VM/W的影響

3.2 黃芪多糖對肥胖模型大鼠骨骼肌PI3KmRNA和PI3Kp85α表達的影響與空白組比較，模型組大鼠骨骼肌的PI3KmRNA明顯降低(P<0.05)，PI3Kp85α的蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，黃芪多糖組和吡格列酮組鼠骨骼肌的PI3KmRNA明顯升高(P<0.05)，PI3Kp85α的蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見表3，圖1。

表3 黃芪多糖對肥胖模型大鼠骨骼肌PI3KmRNA和PI3Kp85α表達的影響

注：A：空白組；B：模型組；C吡格列酮組；D黃芪多糖組圖1 黃芪多糖對肥胖模型大鼠骨骼肌PI3Kp85α表達的影響

4 討論

黃芪多糖是豆科植物中藥黃芪的提取物，具有調(diào)節(jié)機節(jié)免疫功能、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗應(yīng)激及抗氧化等作用[3-4]。黃芪多糖可降低糖尿病大鼠血清白細胞介素-1及白細胞介素-6，可改善糖尿病心肌脂肪酸代謝紊亂及脂毒性[5]；可通過SIRT1-PGC-1α/PPARα-FGF21信號通路改善糖脂代謝，改善胰島素抵抗[6]。更為重要的是黃芪多糖具有雙向調(diào)控血糖的作用[7]，對正常小鼠的血糖無明顯影響，但卻使葡萄糖負荷后小鼠血糖明顯下降。PI3K途徑是胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的主要途徑之一[8]，脂質(zhì)代謝紊亂對PI3K的活性產(chǎn)生重要影響。肥胖、高脂飲食或脂質(zhì)灌注等均可明顯抑制骨骼肌組織PI3K的活化。胰島素受體底物-1、胰島素受體底物-2在肥胖的Zucker大鼠肌肉和肝贓中顯著降低，與PI3K的結(jié)合減少，引起PI3K活性減低[9]。骨骼肌和脂肪細胞中PI3K的基因表達的調(diào)控在2型糖尿病患者中存在缺陷[10]。在肥胖癥及2型糖尿病患者的骨骼肌及脂肪細胞中PI3K活性隨胰島素受體底物蛋白的酪氨酸磷酸化程度降低而下降。游離脂肪酸、腫瘤壞死因子-α等致胰島素受體底物減少，從而影響PI3K活性，說明PI3K是胰島素受體底物的中介分子之一[11]。即PI3K活性降低，胰島素信號無法通過PI3K通路，導(dǎo)致胰島素抵抗，引起血糖升高，最終導(dǎo)致2型糖尿病的發(fā)生。

PI3K可分3類，結(jié)構(gòu)與功能上各不相同，其中研究最廣泛的為I類PI3K由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成。PI3K的p85調(diào)節(jié)亞單位是胰島素受體底物-1/PI3K通路的重要組成部分，PI3K的p85亞單位在調(diào)節(jié)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著獨立負反饋的作用[12-13]。經(jīng)地塞米松處理過的骨骼肌細胞，過量的p85以及p85與p110之間的失衡可以改變PI3K的活性[14]。研究發(fā)現(xiàn)，p85-p110二聚體與p85單體比值越高，機體對胰島素就越敏感[15-16]。機體缺少PI3Kp85α或者是PI3Kp85β都可使胰島素敏感性增加[17-18]。細胞培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，PI3Kp85α表達增加造成PI3K亞基間數(shù)量的平衡被破壞，PI3Kp85α過度表達可明顯抑制P13K活性[19]。使用反義核苷酸干擾p85α的表達，能夠提高肥胖小鼠及(ob/ob)鼠的胰島素敏感性[20]。因此，PI3Kp85α表達的變化將改變骨骼肌等組織對葡萄糖的利用，進而影響胰島素的敏感性。

本研究通過用黃芪多糖干預(yù)胰島素抵抗模型大鼠發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖能調(diào)節(jié)肥胖大鼠脂代謝紊亂，改善肥胖大鼠胰島素抵抗，可能是通過降低血清中膽固醇、三酰甘油及上調(diào)骨骼肌中PI3K來實現(xiàn)的。黃芪多糖改善胰島素抵抗效果明顯，有望應(yīng)用于臨床成為新的胰島素增敏劑。