李碧軍，郭瑞霞，劉媛媛，馬迪蒙，來天驕，毛 萌，白 晶，趙孟玲

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，鄭州 450052)

宮頸癌(cervical cancer，CC)與人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)(尤其是HPV16和HPV18)高感染率密切相關(guān)，占婦科惡性腫瘤的第4位，占女性相關(guān)癌癥死亡的第2位[1]。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)道，2018年宮頸癌新增病例570000例[2]。因此,盡早發(fā)現(xiàn)宮頸病變對預(yù)防宮頸癌的發(fā)生有重要意義。細(xì)胞學(xué)檢查(thinprep cytology test，TCT)是目前最常用的宮頸癌篩查技術(shù)，但其敏感度較低，對于一些意義不明的非典型鱗狀細(xì)胞(atypical squamous cells of undetermined significance,ASCUS)、不除外高度鱗狀上皮內(nèi)病變(atypical squamous cells cannot exclude high grade intraepithelial lesion,ASC-H)或低度鱗狀上皮內(nèi)病變(low-grade squamous intraepithelial lesion,LSIL)的細(xì)胞學(xué)異常的患者,仍需進(jìn)一步檢查,以防止漏診高度鱗狀上皮內(nèi)病變(high-grade squamous intraepithelial lesion,HSIL)及宮頸癌。HPV檢測用于分流ASCUS患者，而細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果為LSIL或ASC-H則建議直接轉(zhuǎn)診陰道鏡下活檢[3]。HPV檢測靈敏度高，但HPV的一過性感染降低了特異性，增加了陰道鏡轉(zhuǎn)診率。最新研究發(fā)現(xiàn),表觀遺傳學(xué)與宮頸癌的發(fā)展和進(jìn)程之間有相關(guān)性[4-6]。在表觀遺傳修飾中，關(guān)于候選基因DNA甲基化在宮頸癌中作用的研究最多。DNA甲基化與CC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。有數(shù)據(jù)表明，PAX1甲基化作為宮頸癌篩查的生物標(biāo)記物的有效性，在組織學(xué)結(jié)果為LSIL、HSIL和CC患者的分診管理中起著指導(dǎo)作用[5,7-9]。本研究旨在探討細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASCUS、LSIL及ASC-H時，PAX1甲基化檢測的分流作用可否提高對組織學(xué)HSIL及CC的檢出率及降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率。

1 資料與方法

1.1 資料來源 收集2019年3月至2019年9月在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科門診行宮頸癌篩查的212例患者的宮頸脫落細(xì)胞學(xué)標(biāo)本?；颊咂骄挲g42.12歲(20～69歲)，經(jīng)病理檢查診斷為正常子宮頸者72例、LSIL 66例、HSIL 50例、子宮頸鱗癌(squamous cell carcinoma,SCC)24例。入選標(biāo)準(zhǔn)：(1)細(xì)胞學(xué)診斷為ASCUS、LSIL、ASC-H；(2)有細(xì)胞學(xué)、高危型HPV、PAX1甲基化及陰道鏡下活檢檢測結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往或正在接種HPV疫苗；(2)既往有宮頸癌或其他惡性腫瘤病史；(3)有宮頸手術(shù)史；(4)既往患生殖器疣；(5)處于免疫低下或抑制狀態(tài)。轉(zhuǎn)診陰道鏡指征：(1)高危HPV陽性，同時TCT≥ASCUS；(2)高危HPV陰性，TCT為LSIL或ASC-H；(3)高危HPV陰性，TCT為ASCUS持續(xù)大于12個月；(4)高危HPV陰性，TCT為ASCUS，但婦科檢查時肉眼觀察疑似宮頸癌。

1.2 檢測方法

1.2.1 高危型HPV檢測 采用Cobas 4800檢測系統(tǒng)(瑞士羅氏公司產(chǎn)品)對子宮頸脫落細(xì)胞進(jìn)行高危HPV DNA檢測，包括HPV16、HPV18、其他高危型，具體操作參考說明書。機(jī)器判讀任一型別的HPV陽性即判斷HR-HPV陽性。

1.2.2 宮頸TCT檢查 采用ThinPrep 2000全自動細(xì)胞制片機(jī)(美國豪洛捷公司)進(jìn)行。細(xì)胞學(xué)診斷報(bào)告采用2014年修訂的TBS(The Bethesda System)分類法，由專業(yè)細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)師閱片診斷。結(jié)果選取為ASCUS、ASC-H、LSIL。

1.2.3 PAX1甲基化檢測 利用細(xì)胞學(xué)檢查的剩余細(xì)胞液(4℃冰箱保存)在1周內(nèi)進(jìn)行PAX1甲基化檢測，利用DNA提取試劑盒(湖南宏雅基因技術(shù)有限公司產(chǎn))提取細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中DNA，按試劑盒說明書操作。提取的DNA使用Quawell Q5000紫外分光光度計(jì)進(jìn)行濃度測量，-20℃冰箱保存。應(yīng)用PAX1甲基化試劑盒(湖南宏雅基因技術(shù)有限公司產(chǎn))，按產(chǎn)品說明書進(jìn)行甲基化檢測，結(jié)果判定VIC CT≤35可進(jìn)行判定:(1)ΔCT≤11，PAX1基因甲基化陽性；(2)ΔCT>11，F(xiàn)AM CT無法測定(undetermined)，儀器噪音干擾導(dǎo)致軟件判讀錯誤，實(shí)際并無擴(kuò)增；PAX1基因甲基化陰性。VIC CT>35無法進(jìn)行判定，需重新采樣，或重新做實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 陰道鏡檢查及活檢病理 由專門婦科陰道鏡室醫(yī)師進(jìn)行陰道鏡檢查(歐普C5陰道鏡)，并對可疑病變部位進(jìn)行多點(diǎn)活檢，由2位病理醫(yī)師獨(dú)立閱片。將慢性炎癥、LSIL判為陰性，以下統(tǒng)稱為LSIL組；將HSIL及SCC判為陽性，以下統(tǒng)稱為HSIL+組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 以活檢病理結(jié)果HSIL+為金標(biāo)準(zhǔn)，比較HR-HPV、PAX1基因甲基化的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確性、受試者工作特征曲線下面積(area under the curve，AUC)。采用ROC曲線分析HR-HPV檢測、PAX1基因甲基化檢測識別ASCUS、LSIL和ASC-H患者中HSIL+的能力。計(jì)數(shù)資料比較使用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用Kruskal-Wallis分析。統(tǒng)計(jì)分析軟件使用MedCalc、SPSS 25.0，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 患者的一般資料 以活檢病理為“金標(biāo)準(zhǔn)”，212例患者的平均年齡42.12歲，LSIL組的平均年齡(42.31歲)與HSIL+組(41.73歲)比較無顯著差異(P=0.161)。

2.2 高危HPV和PAX1診斷HSIL+的比較 34.91%(74/212)患者呈PAX1陽性，76.42%(162/212)患者呈高危HPV陽性，其中HPV16(39.51%)、HPV18(6.17%)、HPV其他高危型(54.32%)。以活檢病理為金標(biāo)準(zhǔn)，CT組、LSIL組、HSIL組、SCC組的PAX1陽性率分別為5.56%(4/72)、9.09%(6/66)、80.00%(40/50)、100.00%(24/24)，LSIL組(CT和LSIL)的PAX1陽性率[7.25%(10/138)]顯著低于HSIL+(HSIL和SCC)組[86.49%(64/74)](P<0.05)；HPV陽性率分別為63.89%(46/72)、75.76%(50/66)、92.00%(46/50)、83.33%(20/24)，LSIL組HPV陽性率[69.57%(96/138)]顯著低于HSIL+組[89.19%(66/74)](P=0.001)。見表1。PAX1診斷HSIL+的敏感性(86.49%)與高危HPV(89.19%)相比，無顯著差異(P=0.588)；特異性、準(zhǔn)確性和AUC(92.75%、90.56%、0.896)均顯著高于高危HPV(30.43%，50.94%和0.598)(P均<0.05)。見表2、圖1。使用高危HPV陽性進(jìn)行分流時陰道鏡轉(zhuǎn)診率為76.41%(162/212)，而PAX1陽性進(jìn)行分流時陰道鏡轉(zhuǎn)診率為34.91%(74/212)。與高危HPV相比，PAX1陽性進(jìn)行分流時陰道鏡轉(zhuǎn)診將減少41.5%，且PAX1能診斷出所有的SCC，不會漏診。見表1。

圖1 高危HPV和PAX1診斷HSIL+ROC曲線對比

表1 高危HPV和PAX1陽性率對比

表2 高危HPV和PAX1診斷HSIL+指標(biāo)對比

2.3 PAX1和高危HPV在細(xì)胞學(xué)分別為ASCUS、ASC-H、LSIL時診斷HSIL+效能分析

2.3.1 在ASCUS中診斷HSIL+效能分析 在ASCUS人群中，34.21%(26/76)診斷出HSIL+；PAX1診斷HSIL+的AUC(0.806)與高危HPV(0.702)相比，無顯著差異(P=0.1218)；PAX1敏感性(69.23%)顯著低于高危HPV(92.31%)(P=0.00)；特異性和準(zhǔn)確性(92.00%、84.21%)均顯著高于高危HPV(48.00%和63.15%)(P均<0.05)。見圖2A及表3、4。

圖2 在ASCUS人群、LSIL人群、ASC-H人群中診斷HSIL+ ROC曲線對比A:在ASCUS人群中診斷HSIL+ ROC曲線;B:在LSIL人群中診斷HSIL+ ROC曲線；C：在ASC-H人群中診斷HSIL+ROC曲線

2.3.2 在LSIL中診斷HSIL+效能分析 在LSIL人群中，17.39%(16/92)診斷出HSIL+；PAX1診斷HSIL+的敏感性(87.50%)與高危HPV(87.50%)相比，無顯著差異(P=1.00)；特異性、準(zhǔn)確性和AUC(92.11%、91.30%、0.898)均顯著高于高危HPV(23.68%、34.78%、0.556)，P均<0.05。見表3、4及圖2B。

2.3.3 在ASC-H中診斷HSIL+效能分析 在ASC-H人群中，72.73%(32/42)診斷出HSIL+；PAX1診斷HSIL+的特異性(100%)與高危HPV(100%)相比，無顯著差異(P=1.00)；敏感性、準(zhǔn)確性和AUC(100%、100%、1.00)均顯著高于高危HPV(12.5%、63.64%、0.563)，P均<0.05。見表3、4及圖2C。

表3 不同細(xì)胞學(xué)診斷HSIL+對比

表4 不同細(xì)胞學(xué)結(jié)果中高危HPV和PAX1診斷HSIL+指標(biāo)對比

3 討 論

3.1 DNA甲基化與宮頸癌的關(guān)系及PAX1基因的功能介紹 高危型HPV感染是宮頸癌及其癌前病變的主要致病原因。高危HPV持續(xù)感染能誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生表觀遺傳學(xué)的改變，其中DNA甲基化是最常見的表觀遺傳學(xué)之一[10]。DNA通過甲基化調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，導(dǎo)致抑癌基因沉默，從而發(fā)生癌變。PAX1是配對盒基因家族中的一員，可通過調(diào)控細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞定向遷移等參與胚胎發(fā)育過程中重要器官的形成[5]。研究表明[5,7-8,11]，PAX1在正常宮頸和宮頸病變組織中的甲基化程度存在很大差異，PAX1甲基化檢測較傳統(tǒng)的HPV、TCT檢查有更高的敏感性和特異性。

3.2 PAX1基因甲基化檢測在宮頸癌診斷中的臨床意義 2008年，Lai等[5,7-8,11]首次發(fā)現(xiàn)PAX1在宮頸癌中出現(xiàn)甲基化異常，甲基化異常頻率高達(dá)94.4%，顯著高于正常組織(0%)(P<0.0001)。Nikolaidis等[5,7-8]將關(guān)于PAX1甲基化評估HSIL+的敏感性和特異性做了Meta分析，結(jié)果表明PAX1甲基化在宮頸癌進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，敏感性和特異性較高。Lai等[11]研究證實(shí)，PAX1檢測HSIL的敏感性、特異性和準(zhǔn)確率分別為0.77、0.88和0.90。Xu等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PAX1甲基化檢測宮頸癌的靈敏度和特異性分別為80%和93%。本研究顯示，以病理活檢為金標(biāo)準(zhǔn)，LSIL組(CT和LSIL)的PAX1陽性率顯著低于HSIL+(HSIL和SCC)組(P<0.05)；SCC組的PAX1甲基化陽性率為100%;PAX1診斷HSIL+的敏感度和特異度均較高，且能診斷出100%的SCC患者。本研究表明，宮頸病變越重，PAX1甲基化檢出率越高，PAX1基因甲基化可能促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，提示PAX1基因甲基化水平可作為宮頸癌的分子標(biāo)記物。由于樣本量不大，本研究僅探討了PAX1甲基化對宮頸鱗癌的診斷效能，而對其他類型的宮頸癌(腺癌、腺鱗癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌等)診斷效能未能統(tǒng)計(jì)。

3.3 PAX1基因甲基化檢測在分流細(xì)胞學(xué)結(jié)果為ASCUS、LSIL及ASC-H中的作用及與高危HPV篩查效能比較 近幾十年內(nèi)，以TCT為基礎(chǔ)的宮頸癌篩查方案使宮頸癌的死亡率顯著降低。據(jù)報(bào)道，在我國進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查的患者中，約有10%的結(jié)果診斷為ASC和LSIL。根據(jù)指南[3]，結(jié)果為ASCUS的女性在6和12個月時重復(fù)進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢測，或進(jìn)行高危HPV檢測；結(jié)果為ASC-H和LSIL患者建議直接轉(zhuǎn)診陰道鏡下活檢。但短時間內(nèi)重復(fù)隨訪、過高的陰道鏡轉(zhuǎn)診率對醫(yī)療資源不夠的地區(qū)要求過高，且陰道鏡檢查屬有創(chuàng)檢查。在指南中建議可將ASCUS患者進(jìn)行高危HPV分流，HPV檢測敏感性高，但特異性較低，故仍有50%的ASC-US女性轉(zhuǎn)診陰道鏡檢查。所以，宮頸癌的分子標(biāo)記物研究為分流輕度細(xì)胞學(xué)異常患者提供了新的思路。

多項(xiàng)研究證實(shí)[5,14-15]，PAX1甲基化檢測在細(xì)胞學(xué)ASC女性檢出HSIL+效能優(yōu)于高危HPV檢測。此外，一些研究者發(fā)現(xiàn)ZNF582、PAX1聯(lián)合診斷效能更佳，這些基因?qū)?xì)胞學(xué)診斷為LSIL的分流管理有一定幫助，且可降低陰道鏡轉(zhuǎn)診率[13-14]。本研究顯示，在ASCUS人群中PAX1敏感性(69.23%)低于高危HPV(92.31%)，特異性(92.00%)顯著高于高危HPV(48.00%)；在LSIL人群中PAX1診斷HSIL+的敏感性(87.50%)與高危HPV(87.50%)相比，無顯著差異；特異性(92.11%)顯著高于高危HPV(23.68%)；在ASC-H人群中，PAX1診斷HSIL+的特異性與高危HPV一樣，均為100%；敏感性(100%)顯著高于高危HPV(12.5%)。這與文獻(xiàn)大致相符，PAX1在分流細(xì)胞學(xué)輕度異常時診斷效能相較HPV更佳，但對于分流ASCUS時，其敏感性較HPV顯著較低，及在ASC-H人群中能100%診斷出HSIL+。但由于樣本量少，仍需前瞻性、大規(guī)模、全面的臨床研究來評估PAX1甲基化在分流輕度細(xì)胞學(xué)異常時的作用。本研究證實(shí)PAX1能有效分開LSIL和HSIL+，但對于LSIL組的PAX1陽性患者，是否進(jìn)展為HSIL+可能性更大，有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，PAX1基因的甲基化具有較高的靈敏度和特異度，在輕度細(xì)胞學(xué)異常(ASCUS、LSIL、ASC-H)女性中通過PAX1甲基化檢測分流可提高對HSIL+的檢出率，其診斷效能優(yōu)于高危HPV檢測，并且能降低一定的陰道鏡轉(zhuǎn)診率，很大程度上減輕了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和醫(yī)療資源負(fù)擔(dān)。