李金玲， 楊愿愿， 劉思思， 趙建亮， 應光國， 陳長二

(教育部環(huán)境理論化學重點實驗室∥廣東省化學品污染與環(huán)境安全重點實驗室∥華南師范大學環(huán)境學院， 環(huán)境研究院， 廣州 510006)

中國是世界上最大的抗生素生產(chǎn)和使用國[1]. 據(jù)估計，我國抗生素年使用量超過1.6×105t[2]，然而藥用抗生素只有少部分可以被機體吸收利用[3]，大部分會以藥物原形或代謝產(chǎn)物的形式進入環(huán)境[4-5]. 抗生素一旦進入環(huán)境，可能通過食物鏈進行傳遞[6]，進而對人類和動物健康以及生態(tài)環(huán)境造成極大的威脅[7-8]. 另一方面，在低濃度長期暴露下，抗生素還會誘導產(chǎn)生抗性基因[9]. 因此，了解抗生素在環(huán)境中的賦存水平，可以為相關(guān)環(huán)境部門評估抗生素生態(tài)風險與管理抗生素的使用提供強有力的數(shù)據(jù)支撐.

氟喹諾酮類抗生素(FQs)是在喹諾酮類抗生素主環(huán)的6位或8位加上1個F原子衍生而來[10]，因其具有廣譜性、抗菌性強等優(yōu)點而被廣泛應用，導致其在環(huán)境中有較高的檢出率和檢出濃度[11]. 目前，環(huán)境樣品中FQs的定量方法主要有高效液相色譜法[12-14]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-17]、酶聯(lián)免疫分析法[18-19]等. 但是在復雜的基質(zhì)干擾下，對目標污染物的準確檢測要求儀器有較高的選擇性和靈敏度，電噴霧離子源高分辨飛行時間質(zhì)譜可提供目標物母離子和碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)，不僅提高了目標物定性篩查的可靠性，也可獲得較高靈敏度的定量數(shù)據(jù).

本文利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF)在電噴霧正離子條件的3種模式：MS(Mass Scan)、MSE、MRM(Multiple Reaction Monitoring)，建立同時測定5種FQs的定量分析方法，并與超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-TQMS)的方法進行比較研究.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-四極桿串聯(lián)時間飛行質(zhì)譜儀(UPLC-QTOF，美國Waters)，配有電噴霧離子源；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(UPLC-TQMS，美國Waters)，配有電噴霧離子源；PURELAB flex純水儀(英國ELGA)；玻璃纖維濾膜(GF/F，0.7 μm, 英國Whatman)；Oasis 親水親油平衡(Hydrophilic Lipophilic Balance,HLB)固相萃取柱(500 mg，6 mL，美國Waters);甲醇、乙腈(HPLC級，德國Merck)；HPLC級甲酸(HPLC級，阿拉丁)；本實驗用水均為超純水(18.2 MΩ·cm).

標準品：環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin，CFX)、恩諾沙星(Enrofloxacin，EFX)、諾氟沙星(Norfloxacin，NFX)、氧氟沙星(Ofloxacin，OFX)、培氟沙星(Pefloxacin，PFX)和內(nèi)標環(huán)丙沙星-D8(Ciprofloxacin-D8，CFX-D8)均購于德國Dr. Ehrenstorfer GmbH. 所有標準品純度均不低于98%(質(zhì)量分數(shù)).

標準溶液的配制：準確稱取適量各標準品，并用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的單一標準儲備液，放入-20 ℃低溫的冰箱中避光保存.

1.2 質(zhì)譜方法的建立

1.2.1 UPLC-QTOF方法 將質(zhì)量濃度為100 μg/L的各化合物單標分別在UPLC-QTOF上進行一級質(zhì)譜全掃描，分析得到母離子，并在高能量通道掃描其二級質(zhì)譜. 隨后，在MRM模式下優(yōu)化5種FQs的特征離子對、毛細管電壓、碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)，選取響應強、干擾小的離子作為定量和定性離子.

1.2.2 UPLC-TQMS方法 將各FQs的單標標準品在全掃描模式下直接進樣，并利用MassLynx4.1軟件中質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化的功能，確定各目標化合物的最優(yōu)碰撞能、錐孔電壓等參數(shù).

1.3 色譜方法的建立

色譜柱選用Waters ACUITY UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm). 在低pH條件下可保持FQs在流動相中穩(wěn)定的溶解狀態(tài)，采用甲酸來控制流動相的pH，比較甲醇和乙腈作有機相時，目標物色譜峰的峰形、響應強度以及分離度. 此外，本文考察了0.1%(體積分數(shù)，全文同)甲酸水-甲醇、0.2%甲酸水溶液-甲醇、0.1%甲酸水溶液-甲醇作為流動相時對目標物峰形和響應值的影響. 隨后，調(diào)節(jié)流動相初始體積比和洗脫梯度，確定最佳液相測試方法.

柱溫不僅會影響目標化合物的保留時間，也會影響目標物的分離和響應. 比較不同柱溫(30、40、50 ℃)對目標化合物響應強度的影響.

在UPLC-TQMS上直接應用UPLC-QTOF確定的色譜柱、流動相及液相洗脫方法，并適當優(yōu)化洗脫梯度，以使目標化合物的響應和峰形更好.

1.4 方法性能的比較

1.4.1 線性關(guān)系 將標準儲備液逐級稀釋，配制成質(zhì)量濃度為0.5、1、5、10、20、50、100 μg/L的混合標準溶液，按照優(yōu)化后的色譜-質(zhì)譜條件測定，使用內(nèi)標法定量. 以目標物定量離子與內(nèi)標定量離子的峰面積之比為縱坐標，標準溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線.

1.4.2 定量限、檢出限及數(shù)據(jù)存儲大小比較 為測定儀器檢出限和定量限，將低濃度的混標工作液(7個平行樣)在2臺儀器的各個模式下分別連續(xù)測定，同時準備7組甲醇溶液，按以上步驟測定. 通過幾次測定結(jié)果的標準偏差，計算儀器檢出限和定量限[20]. 此外，比較UPLC-QTOF的3種質(zhì)譜采集模式下和UPLC-TQMS的MRM模式下，測定1個樣品所需的數(shù)據(jù)存儲空間.

1.4.3 儀器的精密度 對低、中、高質(zhì)量濃度的FQs混標工作液重復測定6次，根據(jù)6次重復測定數(shù)據(jù)的相對標準偏差來考察儀器的精密度.

1.5 方法應用

于廣東省茅洲河上游和中游分別采集3個1 L水樣，加入0.4 mL 4 mol/L硫酸以調(diào)節(jié)pH，加入50 mL甲醇抑制微生物的生長. 上游和中游樣品分別命名為樣品1、2. 將水樣置于含有冰袋的采樣箱，迅速運回實驗室. 參照文獻[21]的方法，將1 L水樣過玻璃纖維濾膜，加入100 μL 1 mg/L CFX-D8內(nèi)標，混勻后采用固相萃取法提取水樣中抗生素. 依次用10 mL甲醇和10 mL超純水活化HLB萃取柱，將過濾后的水樣以5～10 mL/min的流速加載于固相萃取柱，樣品瓶用50 mL 5%甲醇水潤洗2次. 用10 mL 超純水清洗小柱，對萃取柱真空抽干2 h，用10 mL甲醇進行洗脫，收集洗脫液，用氮氣吹干，用1 mL初始流動相復溶，采用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾，將濾液分別在2臺儀器各模式下進行檢測.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 UPLC-QTOF質(zhì)譜條件 優(yōu)化的質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子模式；毛細管電壓為2.0 kV，錐孔電壓為40 V，離子源溫度為120 ℃；脫溶劑氣溫度為500 ℃，脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔氣流速為50 L/h；掃描模式MS/MSE/MRM，質(zhì)荷比m/z范圍為50～1 200；Lockmass為亮氨酸腦啡肽(2 μg/L)溶液；采集時間0.5 s，采集間隔時間10 s，掃描精確質(zhì)荷比為556.277. 5種FQs在該儀器上的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1. UPLC-QTOF所采集目標物的相對分子質(zhì)量偏差均小于±0.3 mDa，表明該儀器可提供較精確的質(zhì)荷比，可為復雜環(huán)境基質(zhì)樣品的準確定量分析提供條件.

表1 不同F(xiàn)Qs在UPLC-QTOF上的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 The parameters of different FQs detection under UPLC-QTOF

2.1.2 UPLC-TQMS的質(zhì)譜條件 采用電噴霧離子源、正離子模式；毛細管電壓為2.0 kV，錐孔電壓為40 V；離子源溫度為120 ℃，脫溶劑氣溫度為300 ℃；脫溶劑氣流速為800 L/h，錐孔氣流流速為150 L/h；掃描模式為MRM. FQs結(jié)構(gòu)中含有羧基和氨基，當溶液為酸性時，其呈現(xiàn)陽離子狀態(tài)，并在ESI+模式下，易形成[M+H]+準分子離子，可作為母離子. 5種FQs及其內(nèi)標在該儀器上的質(zhì)譜采集參數(shù)見表2.

2.2 液相條件的優(yōu)化

2種儀器優(yōu)化后的液相條件：柱溫為40 ℃，樣品室溫度為10 ℃，進樣體積為5 μL. 流動相A為0.1%甲酸水溶液；流動相B為甲醇. 梯度洗脫程序設置為：(1)UPLC-QTOF：0～2.5 min，20% B；2.5～2.6 min，20%～100% B；2.6～3.6 min，100% B；3.6～3.7 min，100%～20% B；3.7～4.5 min，20% B. 流速為0.5 mL/min. (2)UPLC-TQMS：0～2.5 min，10% B；2.5～2.6 min，10%～100% B；2.6～3.6 min，100% B；3.6～3.7 min，100%～10% B；3.7～4.5 min，10% B. 流速為0.5 mL/min.

表2 不同F(xiàn)Qs在UPLC-TQMS上的質(zhì)譜采集參數(shù)

與乙腈相比，當有機相為甲醇時，色譜峰的分離度更高，且由于甲醇在氫鍵作用下是較強的質(zhì)子供體，可提高目標物的靈敏度. 不同的酸度會對目標物離子化效果、峰形和響應強度造成影響. 甲酸的加入不僅使其峰形更加對稱和尖銳，且利于FQs的離子化，得到較強的響應. 以環(huán)丙沙星為例，在不同流動相條件下的色譜峰見圖1A. 0.1%甲酸水溶液-甲醇流動相為本實驗最優(yōu)流動相，用于后續(xù)實驗. 目標化合物的響應強度隨柱溫的升高而增強(圖1B)，考慮到柱溫對色譜柱壽命的影響，故選取40 ℃作為最佳柱溫. 圖2為環(huán)丙沙星在UPLC-QTOF上的3種模式(MSE、Full scan、MRM)和UPLC-TQMS的MRM模式下定量離子的色譜圖.

圖1 不同流動相條件及柱溫對環(huán)丙沙星色譜峰的影響

圖2 環(huán)丙沙星在UPLC-TQMS和UPLC-QTOF模式下定量離子的色譜圖

2.3 線性關(guān)系

2臺儀器各個采集模式下，目標物的線性范圍、線性方程見表3和表4，各模式下目標物線性方程的相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.99，表明其在相應的范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系. 崔敬鑫等[22]研究中FQs的線性范圍為5～100 μg/L，本文方法的線性范圍與其方法的線性范圍相當.

2.4 檢出限、定量限及數(shù)據(jù)量比較

在UPLC-TQMS上，目標物的檢出限和定量限分別為0.08～0.10 μg/L和0.32～0.92 μg/L，在UPLC-QTOF上，檢出限和定量限為0.04～0.22 μg/L和0.17～0.90 μg/L，2臺儀器均顯示出較高的靈敏度. 對比其他文獻報道的方法[23]，本方法對目標物的檢出限與定量限均低于或接近于其他方法的檢出限與定量限，且本方法的分析時間較短.

很明顯2臺儀器的MRM采集模式所需的數(shù)據(jù)存儲空間更小(表3、4)，且UPLC-QTOF上MRM模式更具節(jié)省存儲空間的優(yōu)勢. 對比之下，MS和MSE模式占據(jù)的存儲空間主要用于存儲更多的樣品質(zhì)譜信息.

2.5 儀器的精密度

對3種不同質(zhì)量濃度的FQs混標工作液重復測定6次，以考察儀器的精密度，測定濃度的重復性結(jié)果如表5所示. 結(jié)果表明：用UPLC-TQMS測定的相對標準偏差在1.2%～3.3%之間. 在UPLC-QTOF的MS/MSE/MRM模式下，測定的相對標準偏差分別為0.8%～3.8%、0.7%～11%和0.5%～6.7%，表明該檢測方法有良好的重現(xiàn)性. 可以看出2臺儀器的精密度良好.

表3 5種FQs在UPLC-TQMS的定量限、檢出限、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和數(shù)據(jù)量Table 3 The limits of detection and quantification, linear range, correlation coefficient and data size for 5 FQs under UPLC-TQMS

表4 5種FQs在UPLC-QTOF不同采集模式下的定量限、檢出限、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和數(shù)據(jù)量

表5 UPLC-QTOF和UPLC-TQMS下5種FQs質(zhì)量極度檢測結(jié)果的精密度Table 5 The precision of concentration detection for 5 FQs under UPLC-QTDF and UPLC-TQMS

2.6 環(huán)境樣品分析

將實際環(huán)境樣品于2臺儀器各模式下進行檢測，均只有OFX被檢出，其他4種喹諾酮質(zhì)量濃度低于檢出限. 定量數(shù)據(jù)均由MassLynx4.1軟件中的TargetLynx計算得到(表6). 2臺儀器各模式下所測定的樣品1與樣品2的質(zhì)量濃度呈現(xiàn)一致的大小規(guī)律，且平行測試之間偏差較小. UPLC-QTOF的MSE和UPLC-TQMS上測定的質(zhì)量濃度無顯著性差異，但是UPLC-QTOF的MRM模式和MS模式下檢出的質(zhì)量濃度高于UPLC-TQMS，可能是不同儀器和不同模式下的基質(zhì)效應存在顯著差異.

表6 UPLC-QTOF和UPLC-TQMS對氧氟沙星質(zhì)量濃度的測定

3 結(jié)論

本研究采用超高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜，建立了5種FQs的定量檢測方法，各目標物在3種檢測模式(MS/ MSE/ MRM)下的方法檢出限在0.04～0.22 μg/L之間，相對標準偏差(RSD)在0.5%～11%之間. 通過與超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜法比較發(fā)現(xiàn)，超高效液相色譜-高分辨飛行時間質(zhì)譜具有與超高效液相色譜-質(zhì)譜同樣出色的定量能力和儀器精密度. 而高分辨飛行時間質(zhì)譜還可對目標物準確定性，從而有效降低質(zhì)譜MRM模式下假陽性的情況. 因此，本文為氟喹諾酮類抗生素的快速、準確定量分析提供了一種可靠的方法，具有較強的實用價值.