楊 雪 ，胡 陽，王梓懿 ，王照國 ，余 帥，安正斌，夏 宇，李?

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550014；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省天然藥物工程研究中心，貴州 貴陽 550014；3.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽 550006）

【研究意義】二化螟（Chilo suppressalisWalker）是鱗翅目草螟科的一種害蟲。二化螟幼蟲作為鉆蛀性及寡食性害蟲，主要為害水稻及茭白等禾本科作物。二化螟屬兼性滯育種類，以4～6齡幼蟲在稻蔸滯育越冬，平均每年發(fā)生1～5代，江淮稻區(qū)常年發(fā)生2代［1］。在水稻苗期二化螟幼蟲的為害可造成水稻苗枯鞘和枯心等癥狀，在水稻孕穗期和穗期二化螟幼蟲的為害會(huì)造成稻苗白穗、枯孕穗和蟲傷株等癥狀，嚴(yán)重降低水稻的產(chǎn)量和質(zhì)量［2］。最近幾年二化螟種群的數(shù)量呈現(xiàn)出一定的回升趨勢，主要原因包括其寄主植物的種植規(guī)模越來越大、水稻種類的替換、耕作方式發(fā)生改變以及氣候的變化等，其為害性逐年加劇，故有人將其與蝗蟲并列，稱它們?yōu)椤澳厦被取保?］。目前對二化螟的防治主要依賴于化學(xué)藥劑，而長期以及連續(xù)不合理的使用化學(xué)藥劑使得二化螟對其產(chǎn)生了不同水平的抗藥性［4］。因此，尋找環(huán)境友好型防治二化螟的措施十分必要和迫切。

【前人研究進(jìn)展】隨著目前化學(xué)生態(tài)學(xué)的快速發(fā)展，對于植物與昆蟲之間產(chǎn)生的化學(xué)信息聯(lián)系的研究成為新的重點(diǎn)研究領(lǐng)域之一。植物精油中含有多種低沸點(diǎn)、易揮發(fā)的成分，且具有強(qiáng)烈的特殊氣味。植物精油按一定比例構(gòu)成化學(xué)指紋圖譜，并能夠影響昆蟲對于寄主植物的定位、逃避敵害、交配、產(chǎn)卵、取食等行為，在昆蟲行為調(diào)控和植物防御過程中起著重要作用［5］。薄荷（Mentha haplocalyxBrig.）為唇形科多年生草本植物，其入藥部分為地上干燥部分。夏秋二季莖、葉茂盛或花開至三輪時(shí)，選晴天，分次采割，陰干或曬干，其性辛、涼，歸肺、肝經(jīng)。具有疏散風(fēng)熱、清利頭目、利咽、透疹的作用、用于風(fēng)熱感冒、風(fēng)溫初起、頭痛、目赤、喉痹、口瘡、風(fēng)疹、麻疹、胸脅脹悶等［6］，我國南北各省均有分布，主產(chǎn)于江蘇、江西、湖南等省。據(jù)報(bào)道，薄荷精油對白紋伊蚊（Aedes albopictus）具有驅(qū)避作用，活性成分為右旋8-乙酰氧基別二氫葛縷酮［7］。李中姍等研究了香草根揮發(fā)油中萜類化合物對二化螟具有引誘作用［8］。鄭許松等通過二化螟在香草根和水稻之間產(chǎn)卵和幼蟲存活的情況進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)二化螟更傾向于將卵產(chǎn)在香草根上，表明二化螟對香草根具有強(qiáng)烈的吸引作用［9］。高廣春等研究表明香草根提取物對剛孵化的二化螟幼蟲具有一定的毒殺活性［10］。王廣利等報(bào)道二化螟對16 種香草根揮發(fā)物產(chǎn)生EAG 反應(yīng)［11］。查閱文獻(xiàn)，我們可以得知很多研究者都是對薄荷精油的抗菌和防腐作用的研究。Espiritu 等報(bào)道了薄荷甲醇提取物對大腸桿菌具有顯著的抑制作用［12］。野生薄荷精油清除超氧陰離子自由基和羥基自由基的能力較強(qiáng)［13］。另外，He 等從薄荷精油中分離出25 個(gè)葡萄糖苷類化合物，活性測定結(jié)果顯示這些化合物對葡萄糖苷酶具有抑制活性［14］。薄荷屬植物椒樣薄荷（Mentha piperitaL.）和蘇格蘭留蘭香（Mentha cardiacG.）精油可抑制多種細(xì)菌的生長，該2 種薄荷植物提取精油后，所剩余殘?jiān)募状继崛∥顳PPH 自由基具有較強(qiáng)的清除作用［15］。

【本研究切入點(diǎn)】薄荷精油中含有豐富的的萜類化合物，同時(shí)薄荷精油對二化螟行為研究未見報(bào)道。通過前期對實(shí)驗(yàn)室所提取的全部精油篩選出了薄荷精油對二化螟有取食引誘活性。因此本試驗(yàn)測試了薄荷精油對二化螟幼蟲的取食趨向的影響，在此基礎(chǔ)上，測試了二化螟對薄荷精油的觸角電位反應(yīng)，并采用氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀（GC-EAD）分析了薄荷精油中的活性成分，為揭示薄荷精油調(diào)控農(nóng)業(yè)害蟲的行為提供依據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】薄荷精油是否對二化螟的取食有影響，薄荷精油中不同化合物對二化螟雌雄成蟲是否產(chǎn)生電生理反應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試蟲源：二化螟三齡幼蟲由貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所室提供，二化螟成蟲由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院提供。

植物材料：留蘭香薄荷地上部分于2018 年4月采自貴州省貴陽市沙文，陰干備用。

主要儀器：GC-EAD 系統(tǒng)由裝有HP-5（30 m×0.25 mm）色譜柱、FID 檢測器的氣相色譜（Angilent 5890 B）和觸角電位儀（Syntech）組成。觸角電位儀由荷蘭Syntech 公司生產(chǎn)的智能化數(shù)據(jù)獲取控制器IDAC-4、微動(dòng)操作儀Syntech MN-151、刺激氣流控制器Syntech CS-55 和Syntech軟件處理系統(tǒng)組成。

主要試劑：正己烷（分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司），配制成0.1、1、10、100、1000、10000 mg/L 6 個(gè)濃度梯度。乙醚、丙酮（分析純，天津富宇精細(xì)化工有限公司），無水硫酸鈉（分析純，江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 精油提取 采用水蒸氣蒸餾法提取薄荷精油：將采集的薄荷樣品粉碎，過0.850 mm篩，稱量500 g，置1000 mL 圓底燒瓶中，加水500～900 mL，浸泡12 h，組裝好水蒸氣蒸餾裝置。用電加熱套緩緩加熱圓底燒瓶至沸騰，并一直保持微沸的狀態(tài)約5 h，直至無油狀物流出為止。用等體積的乙醚萃取餾出液3 次，合并乙醚層，用無水硫酸鈉進(jìn)行干燥，過濾掉無水硫酸鈉，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀去除乙醚，得到薄荷精油，在4 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 二化螟幼蟲非選擇性拒食活性測試 采用稱重法測試拒食活性［16］：選取三齡二化螟幼蟲為測試?yán)ハx，將受試?yán)ハx饑餓24 h，逐頭編號稱重，以丙酮為溶劑，采用二倍稀釋法將薄荷精油配制成5.0、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 mg/mL的系列濃度。以丙酮溶液為對照，每個(gè)濃度3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 頭試蟲。選取新鮮稻莖，切割成2 cm，在藥液中浸漬5 s，自然晾干后放入培養(yǎng)皿中，接入1 頭試蟲，每天更換帶藥稻莖，飼養(yǎng)7 d，取出稱重，計(jì)算拒食率。

1.2.3 氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀（GC-EAD）測試 樣品用GC-EAD 進(jìn)行分析［17］，每次進(jìn)樣量為2 μL（濃度為10 mg/mL），進(jìn)樣口溫度220 ℃，檢測器溫度250 ℃，載氣為流速 1 mL/min 的99.999% N2，不分流進(jìn)樣。升溫程序：初始溫度從50 ℃保持2 min，以升溫速度10 ℃/min 升至210 ℃，再以10 ℃/min 的速度升至280 ℃，運(yùn)行25 min，柱前壓7.65 psi，載氣流量1.0 mL/min，分流比20 ∶1，溶劑滯后時(shí)間 4.0 min。將羽化后2 d 的成蟲觸角剪下，接到觸角電位儀上，測試方法同上。

質(zhì)譜條件：電子能量70 eV，離子源為EI源，EI 源溫度230 ℃，發(fā)射電流34.6 μA，四極桿溫度150 ℃，倍增器電壓1482 V，質(zhì)量范圍29～500 amu。

采用氣相色譜-質(zhì)譜-計(jì)算機(jī)聯(lián)用儀進(jìn)行分析鑒定，各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索，標(biāo)準(zhǔn)圖譜庫Nist 2005 和Wiley 275，確定精油中的化合物結(jié)構(gòu)，用峰面積歸一化法確定各化學(xué)成分的相對含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 二化螟幼蟲非選擇性拒食活性

表1 為不同濃度薄荷精油對二化螟三齡幼蟲的拒食活性。由表1 可知，所有測試濃度均表現(xiàn)出顯著的引誘取食作用，且隨著濃度的降低，引誘取食作用越強(qiáng)。當(dāng)濃度為0.15625 mg/mL 時(shí)，取食率為123.01 %，故選取0.1 mg/mL 薄荷精油用于測定二化螟雌雄成蟲觸角電位反應(yīng)的濃度。

表1 不同濃度薄荷精油對二化螟幼蟲的引誘取食活性Table 1 Feeding attraction activities of different concentrations of essential oil of Mentha haplocalyx against Chilo suppressalis

2.2 薄荷精油化學(xué)成分分析

圖1 為薄荷精油GC-MS 離子流。由表2 可知，從薄荷精油中共檢測出27 個(gè)化合物，化合物含量占總含量的81.965 %，其中含量最多的為長葉薄荷酮，含量為15.854 %，其次為異薄荷腦，含量為15.206 %。氧化胡椒酮和順-胡椒酮氧化物的含量分別為13.044 %和12.655 %，異薄荷酮含量為9.067 %，其余化合物含量均較低。因長葉薄荷酮為薄荷精油的主要化合物，故測試了薄荷精油和長葉薄荷酮對二化螟雌雄成蟲的觸角電位反應(yīng)。

圖1 薄荷精油GC-MS 離子流Fig.1 Ion flux of essential oil of Mentha haplocalyx

表2 薄荷精油主要化學(xué)成分Table 2 Chemical components of essential oil of Mentha haplocalyx

2.3 薄荷精油對二化螟雌雄成蟲氣相色譜-觸角電位聯(lián)用儀（GC-EAD）電位反應(yīng)

二化螟雌性成蟲對薄荷精油的GC-EAD 反應(yīng)見圖2，結(jié)果顯示薄荷精油中的12 種化合物能明顯引起雌蟲產(chǎn)生電生理反應(yīng)，其中長葉薄荷酮的反應(yīng)最為強(qiáng)烈，12 號未知物對二化螟雄蟲也有較明顯的反應(yīng)，從GC-MS 分析可以看出，12 號未知物為菖蒲烯（0.489 %）、乙烯丁香酚（0.151 %）、4-環(huán)丙基-2-甲氧基苯酚（1.929 %）的混合物，它們的總含量僅為2.569 %，與長葉薄荷酮（15.854 %）的含量差別較大，故推測3 個(gè)化合物中的某個(gè)化合物對二化螟雄蟲的觸角電位有更大反應(yīng)。

圖2 二化螟雌性成蟲對薄荷精油的GC-EAD 反應(yīng)Fig.2 Gas chromatography-electroantennographic detection（GC-EAD）response of female adults of Chilo suppressalis to essential oil of Mentha haplocalyx

二化螟雄性成蟲對薄荷精油的GC-EAD 反應(yīng)見圖3。與雌蟲不同，雄蟲對薄荷精油中的10 種化合物產(chǎn)生電生理反應(yīng)，其中丁子香酚對二化螟雄蟲的電生理反應(yīng)最為強(qiáng)烈。結(jié)合GC-MS 分析可知，丁子香酚旁的為薄荷烯酮醚，其對二化螟雄蟲的電生理反應(yīng)影響也較為強(qiáng)烈。另外，丁子香酚在薄荷精油中的含量為11.692 %，而薄荷烯酮醚的含量僅為2.766 %，推測薄荷烯酮醚對二化螟雄蟲的電生理反應(yīng)較丁子香酚強(qiáng)烈。

3 討論

圖3 二化螟雄性成蟲對薄荷精油的GC-EAD 反應(yīng)Fig.3 Gas chromatography-electroantennographicdetection（GC-EAD）response of male adults of Chilo suppressalis to essential oil of Mentha haplocalyx

昆蟲的取食行為是指昆蟲在接受內(nèi)外信息后，由神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉系統(tǒng)作出的綜合反應(yīng)，表現(xiàn)出攝取食物以及與此相關(guān)的一系列活動(dòng)［18］，一般同種昆蟲個(gè)體的取食行為既表現(xiàn)出種群的相似性又表現(xiàn)出種群所特有的固定模式。昆蟲對食物有一定的選擇性，用以識別和選擇食物的方式多種多樣，但多以化學(xué)刺激作為識別寄主的主要工具，昆蟲的取食行為取決于從化學(xué)感受器輸入的感覺信號，如植食性昆蟲通常以植物的次生代謝產(chǎn)物作為信息化合物或取食刺激劑［19］。昆蟲在覓食和尋找寄主行為中，嗅覺感受器發(fā)揮著極其重要的作用，即通過嗅覺感受植物揮發(fā)物以識別寄主及確認(rèn)取食適合度，昆蟲可通過味覺感受系統(tǒng)辨別促進(jìn)取食的營養(yǎng)化合物和抑制取食的有毒化合物以確認(rèn)和評估潛在食物［20］。芳香植物的氣味可影響昆蟲的行為［21-23］，從具有特殊氣味的植物中篩選出可顯著影響昆蟲行為的揮發(fā)性物質(zhì)，是利用化學(xué)生態(tài)調(diào)控害蟲的主要研究方向之一。氣相色譜-觸角電位（GC-EAD）是昆蟲化學(xué)生態(tài)學(xué)中最重要的電生理技術(shù)，在研究昆蟲對信息化學(xué)物質(zhì)的感受機(jī)理、篩選活性信息素成分或植物次生物質(zhì)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

長葉薄荷酮在多種芳香植物的精油中被檢測出［24-27］，丁子香酚是植物丁香、丁香羅勒以及樟樹屬肉桂葉揮發(fā)油的主要成分，呈現(xiàn)出特殊辛辣味和強(qiáng)烈的丁香氣息［28］。丁子香酚抑菌活性較好，目前已有相關(guān)殺菌劑應(yīng)用于農(nóng)業(yè)實(shí)踐中。本試驗(yàn)測試的薄荷精油中的異薄荷腦、氧化胡椒酮、順-胡椒酮氧化物、異薄荷酮含量也較高，但GC-EAD 結(jié)果顯示這些化合物對二化螟雌雄成蟲觸角的電生理反應(yīng)不是很強(qiáng)烈。雌雄蟲觸角上化學(xué)感受器數(shù)量和類型有差異，導(dǎo)致雌雄蟲各自具備獨(dú)特的嗅覺感受和分辨能力，也可能與嗅覺感受器中相關(guān)嗅覺蛋白與精油中某種活性成分的結(jié)合能力有關(guān)。在自然界中，昆蟲雌雄個(gè)體在整個(gè)種群生存和繁衍過程中長期分工不同，也會(huì)導(dǎo)致其對植物氣味的反應(yīng)在兩性間存在明顯的差異。在GC-EAD 測試中，作為刺激源的每種柱流出組分的量是不相同的，有可能會(huì)出現(xiàn)有行為活性的組分在樣品中含量太低而沒有觸角電位反應(yīng)。具有觸角電位活性的化合物作為行為實(shí)驗(yàn)的材料時(shí)，供試?yán)ハx不一定都對其產(chǎn)生趨性反應(yīng)，主要是由于觸角電位反映的是嗅覺感受器對特定化合物反應(yīng)電壓的強(qiáng)弱，而行為反應(yīng)需要經(jīng)歷嗅覺受體、神經(jīng)中樞，依據(jù)大腦的判斷從而對運(yùn)動(dòng)器官進(jìn)行調(diào)控。

不同產(chǎn)地、不同采摘時(shí)間的薄荷精油化學(xué)成分亦不同。王微等報(bào)道薄荷精油中異佛爾酮相對含量最高，達(dá)到41.22 %［29］。李鐵純等報(bào)道采自遼寧省遼中縣的薄荷精油中相對含量最高的化合物為香薷酮（58.90 %）［30］。本試驗(yàn)測定結(jié)果相對含量最高的為長葉薄荷酮（15.854 %），可能是產(chǎn)地和采摘時(shí)間不同所致，推測其生物活性也有差異。

昆蟲誘食劑具有引誘害蟲取食更多沾有藥物的葉片，加速害蟲死亡，可提高藥效，本研究結(jié)果將為開發(fā)薄荷精油中的活性化合物為植物源誘食劑奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)測試了薄荷精油對二化螟三齡幼蟲的取食影響，結(jié)果顯示薄荷精油可顯著引誘二化螟幼蟲取食，考慮到處理組和對照組喂食的均為新鮮稻莖，可以排除味覺對取食變化的影響，故進(jìn)一步測試了薄荷精油中不同化合物對二化螟雌雄成蟲觸角的電生理反應(yīng)。GC-MS 分析結(jié)果顯示長葉薄荷酮是薄荷精油中的主要化合物。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)采用GC-EAD 法測試了薄荷精油中不同化合物對二化螟雌雄成蟲的電生理反應(yīng)，結(jié)果顯示雌蟲對長葉薄荷酮的電生理反應(yīng)最為強(qiáng)烈，而雄蟲對丁子香酚的電生理反應(yīng)最為強(qiáng)烈。