溫碧柔,林來鳳,賴文娜,陳仕林,劉 活,易潤華
(廣東海洋大學(xué)濱海農(nóng)業(yè)學(xué)院,廣東 湛江 524088)
【研究意義】椰子(Cocos nucifera)為棕櫚科(Palmae)椰子屬(Cocos)多年生熱帶木本油料和食品能源作物。椰子原產(chǎn)于亞洲東南部、印度尼西亞至太平洋群島,主要分布于亞洲、非洲、拉丁美洲等赤道濱海地區(qū),主產(chǎn)國有中國、印度尼西亞、斯里蘭卡、印度、菲律賓、泰國和馬來西亞等國家。我國種植椰子有2000 多年歷史,在我國海南、臺灣、廣東、福建、廣西、云南南部均有栽培。椰樹高大挺拔美觀,在熱帶亞熱帶地區(qū)可作為園林綠化樹種;椰果經(jīng)濟(jì)價值高,可加工為形色多樣的產(chǎn)品[1];椰汁富含蛋白質(zhì)、果糖、維生素等營養(yǎng)物質(zhì),營養(yǎng)價值高;椰肉可加工膳食食品[2],具有很大的開發(fā)潛力。2018 年我國椰子主產(chǎn)區(qū)海南省的種植面積3.36 萬hm2,總產(chǎn)值達(dá)3.86 億元,總產(chǎn)量2.26 億個,而2011 年的總產(chǎn)值曾達(dá)4.79 億元[3]。因此,椰子種植可增加農(nóng)民就業(yè)機(jī)會和經(jīng)濟(jì)收入,促使農(nóng)民脫貧致富,實(shí)現(xiàn)鄉(xiāng)村振興,促進(jìn)熱帶現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】據(jù)文獻(xiàn)報道,約600 多種真菌侵染椰子樹根部、葉片、莖干和椰果,引起各種病害[4]。椰果腐病是椰子種植中常見的病害,由多種腐霉如棕櫚疫霉Phytophthora palmivora、桂氏疫霉P.katsurae、P.castaneae和P.heveae等引起,在樹上引起椰果褐色腐爛,播種發(fā)芽時引起芽腐爛。在苗期主要發(fā)生葉部病害,主要有灰斑?。ㄗ貦皵M盤多毛孢菌Pestalotiopsis palmarum)[5]和炭疽?。–olletrotrichum gloeosporioides)[6]等病害侵染。莖泄血?。╯tem bleeding)又稱莖干腐爛?。╯tem rot),在椰子種植區(qū)均有發(fā)生,是一種世界性的病害,對椰子產(chǎn)業(yè)發(fā)展影響極大。該病害的病原菌為奇異根串珠霉菌Thielaviopsis paradoxa,有性型為Ceratocystis paradoxa,可侵染椰樹莖稈,形成黑色病斑,受侵染部位溢出紅棕色液汁,導(dǎo)致莖干腐爛[7-8]。在我國椰子主要發(fā)生的病害有莖泄血病、果腐病和葉部病害。近年來,報道的椰子病害主要有椰苗葉斑病(Bipolaris setariae[9]、Colletrotrichum gloeosporioides[6]和Curvulariaoryzae[10])、椰果蒂腐?。↙asiodiplodia theobromae[11]和Pestalotiopsis adusta[12])、葉枯?。≒.menezesiana)[13]等?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】椰果采收后發(fā)生的病害主要有椰果底腐病[14]和黑腐?。?5],2017 年12 月,在廣東省湛江地區(qū)的椰子交易市場發(fā)現(xiàn)一種引起椰子果實(shí)外果皮黑色腐爛的病害。該病害引起約15%~20% 的果實(shí)腐爛。病害發(fā)生后傳播速度極快,嚴(yán)重時侵染內(nèi)果皮,導(dǎo)致椰肉腐爛和椰汁變質(zhì),經(jīng)濟(jì)價值受損嚴(yán)重?!緮M解決的關(guān)鍵問題】為確定椰子腐爛的病原菌,本試驗(yàn)對從腐爛果中分離到的純培養(yǎng)物進(jìn)行致病性測定,根據(jù)分離物形態(tài)學(xué)特征和ITS 序列分析確定其分類地位,并研究其生物學(xué)特性,以期為該病害的防治提供科學(xué)依據(jù)。
用稀釋分離法分離病原菌。從發(fā)病的椰果上挑取孢子進(jìn)行梯度稀釋制成菌懸液,用混菌法接種到PDA 培養(yǎng)基,置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d,待菌落長出,挑取單菌落,保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2.1 致病性測定 純培養(yǎng)物接種到PDA 培養(yǎng)基25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。選取健康的椰子經(jīng)75%酒精表面消毒后,接種直徑為6 mm的菌餅,室溫(25~28℃)保濕,觀察病害發(fā)生情況。試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù),以接種6 mm 不帶菌的培養(yǎng)基作為對照。
1.2.2 寄主范圍測定 接種方法同致病性測定,13種供試寄主植物分別為香蕉Musa nana、芒果Mangifera indica、菠蘿Ananas comosus、甘蔗Saccharum officinarum、豆薯Pachyrhizus erosus、木薯Manihot esculenta、菠蘿蜜Artocarpusheterophyllus、龍血樹Dracaena angustifolia、番木瓜Carica papaya、番薯Ipomoea batatas、白蘿卜Raphanus sativus、木蘭Magnolia lilifl ora和富貴竹Dracaena sanderiana。香蕉、芒果、菠蘿和菠蘿蜜的接種部位為果實(shí),白蘿卜、番薯和豆薯的接種部位為塊根,龍血樹、木蘭、富貴竹和番木瓜的接種部位為葉片,木薯和甘蔗的接種部位為莖桿。
1.3.1 形態(tài)特征鑒定 參照De Beer 等[16]方法,將病原菌接種到PDA 培養(yǎng)基,25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d,觀察菌落形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)、孢子形態(tài)特征。
1.3.2 ITS 序列分析 按照童依婷等[17]的方法PCR 擴(kuò)增病原菌ITS 序列。擴(kuò)增引物為ITS1(TCC GTA GGT GAA CCT GCG G)和ITS4(TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC)。PCR 反應(yīng)體系采用TaKaRa 公司的MightyAmp DNA Polymerase Ver.2試劑盒,擴(kuò)增體積為50 μL,含1×MightyAmp Buffer、0.2 μmol/L 上下游引物,1.25 U MightyAmp DNA 聚合酶。擴(kuò)增程序:98 ℃預(yù)變性2 min,98 ℃變性10 s,56 ℃退火15 s,68 ℃延伸 1 min,35 個循環(huán)。PCR 產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司測序。所得序列在GenBank 進(jìn)行BLAST 比對和同源性分析,用MEGA6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,用Bootstrap 進(jìn)行自舉檢驗(yàn),1000 次重復(fù)。
測定溫度、光照、pH、碳源、氮源和培養(yǎng)基對菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響。用十字交叉法測量菌落直徑,顯微直接計數(shù)測定病原菌的產(chǎn)孢量。將孢子懸浮液涂布在帶有厚度約為2 mm PDA 培養(yǎng)基的玻片,保濕培養(yǎng)6 h 后,記錄孢子萌發(fā)量,計算孢子萌發(fā)率。每個處理3次重復(fù)。
1.4.1 溫度 將病原菌接種到PDA 后分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。
1.4.2 光照 將病原菌分別接種到PDA 培養(yǎng)基后分別置于24 h 光照、12 h光照12 h黑暗、24 h黑暗、10 min 紫外線+24 h 光照、10 min 紫外線+24 h 黑暗條件下,室溫(25~28℃)培養(yǎng)3 d。
1.4.3 pH 將病原菌分別接種至pH 為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 的PDA培養(yǎng)基后置于25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。
1.4.4 碳源和氮源 分別用等質(zhì)量的葡萄糖、半乳糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、棉子糖、淀粉和阿拉伯樹膠,替換察氏培養(yǎng)基中的蔗糖,以不加碳源為對照;用硫酸銨、硝酸鈉、明膠、水解乳蛋白、甘氨酸、尿素、牛肉膏、酵母粉代替察氏培養(yǎng)基中的NaNO3,以不加氮源為對照,病原菌接種后置于25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。
1.4.5 培養(yǎng)基 測試培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA:土豆200.0 g、瓊脂20.0 g、葡萄糖20.0 g、水1 L)、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(PSA:土豆200.0 g、瓊脂20.0 g、蔗糖20.0 g、水1 L)、燕麥培養(yǎng)基(OMA:燕麥片30.0 g、瓊脂17.0 g、水1 L)、椰子葉培養(yǎng)基(MCL:椰子葉30.0 g、瓊脂20.0 g、水1 L)、胡蘿卜培養(yǎng)基(CM:胡蘿卜100.0 g、瓊脂18 g、水1 L)、玉米粉培養(yǎng)基(CMM:玉米粉17.0 g、瓊脂15.0 g、水1 L)、葡萄糖蛋白胨酵母培養(yǎng)基(GTYA:蛋白胨2.0g、酵母粉1.0 g、葡萄糖10.0 g、瓊脂20.0 g、水1 L)。
6 種供試藥劑:250 g/L 戊唑醇乳油、400 g/L氟硅唑乳油、300 g/L苯甲·丙環(huán)唑(150 g/L丙環(huán)唑、150 g/L 苯醚甲環(huán)唑)乳油、30%苯甲·吡唑酯(20%苯醚甲環(huán)唑、10%吡唑醚菌酯)乳油、60%唑醚·代森聯(lián)(55%代森聯(lián)、5%吡唑醚菌酯)水分散粒劑、40%氟硅唑·吡唑乳。試驗(yàn)方法參照楊世杰等[18]和谷會等[19]的方法。
應(yīng)用SPSS 21.0 軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA及DUNCAN 氏新復(fù)極差法分析,并用 MEGA 6 軟件進(jìn)行圖表分析。用Excel 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行殺菌劑毒力測定的生物統(tǒng)計分析。
2.1.1 致病性 自然發(fā)病的椰子果實(shí)內(nèi)部棕黑色腐爛,表面長出白色菌絲,并逐漸變成灰黑色(圖1A),形成黑色粉層,果實(shí)腐爛。將從具典型癥狀病組織分離到的菌株YZS 接種到健康無病的椰子,10 d 后,果柄斷裂,斷裂處有白色菌絲,內(nèi)部果肉呈黑褐色(圖1B),隨后整個果實(shí)呈棕褐色腐爛。病果上菌絲生長茂盛,菌絲初期白色,后期全部變?yōu)榛液谏▓D1C),散發(fā)出香味。人工接種健康椰子腐爛的癥狀與自然發(fā)病癥狀一致,對照不發(fā)病。從人工接種發(fā)病組織中重新分離的純培養(yǎng)物性狀與菌株YZS 相同,證明菌株YZS 為椰子果腐病的病原菌。
2.1.2 寄主范圍 用菌株YZS 接種13 種植物,其中菠蘿蜜、甘蔗、木薯、香蕉、豆薯、龍血樹、芒果和菠蘿8 種植物在接種部位形成病斑,引起發(fā)病。
圖1 椰子果腐病癥狀Fig.1 Symptoms of fruit rot on Cocos nucifera
2.2.1 形態(tài)特征 在PDA平板上,病原菌生長迅速,25 ℃恒溫培養(yǎng)菌落直徑 73.7(±0.5)mm,3 d后長滿9.00 cm的培養(yǎng)皿,菌落初期白色,后變黑(圖2A、B),散發(fā)出果香味。氣生菌絲棉絮狀,菌絲無色,有分隔,分生孢子有大、小兩型。大型分生孢子串生于菌絲頂端的孢子梗上(圖2C、D),鏈狀排列(圖2E、F),單胞,橢圓形,壁較厚,初為無色透明至棕黃色,老熟時為黑褐色,大小為17.3~25.6 μm×9.3~14.6 μm〔平均為20.9(±2.0)μm×11.9(±1.1)μm〕(圖2G)。小型分生孢子內(nèi)生于瓶梗狀產(chǎn)孢細(xì)胞中,孢子排列成串,成熟后自梗末端的孔口依次釋放(圖2 H~J),孢子圓柱形,薄壁,無色,平滑,老熟時為棕褐色,大小為6.9~11.7 μm×3.3~4.9 μm〔平均為9.3(±1.0)μm×4.2(±0.4)μm〕(圖2K)。
2.2.2 ITS 序列分析 椰子果腐病菌的ITS 序列長約為520 bp,經(jīng)BLAST 分析,與Thielaviopsis ethacetica(KU377506)、T.paradoxa(MG062870)、T.musarum(JX5183250)、Ceratocystis paradoxa(KJ881375)的同源性為100%。利用MEGA6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,顯示椰子果腐病原菌與它們處于同一分支的自舉值為100%(圖3)。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征(差異分析見表1)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,將椰子果腐病原菌鑒定為Thielaviopsis paradoxa[20-21]。
圖2 椰子果腐病病原菌形態(tài)Fig.2 Morphology of Thielaviopsis paradoxa
2.3.1 溫度 溫度對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)影響差異顯著。在PDA 培養(yǎng)基上,椰子果腐病菌的生長溫度為5~35 ℃;在5、10、35 ℃菌絲生長直徑和產(chǎn)孢量為0,5、10 ℃孢子萌發(fā)率低,而35℃孢子萌發(fā)率為47.08%。在15~30 ℃病原菌可生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā),25、30 ℃菌落直徑為88.0 mm,25 ℃時產(chǎn)孢量最大,達(dá)190.00×106個/皿;在5~35 ℃孢子均能萌發(fā),25 ℃孢子萌發(fā)率最高達(dá)49.76%(表2)。
2.3.2 光照 光照對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響有顯著差異(表3)。24 h 光照條件下菌落生長最快、孢子萌發(fā)率最高,菌落直徑和萌發(fā)率分別為88.0 mm 和70.28%,光照有利于菌絲生長和孢子萌發(fā);24 h 黑暗培養(yǎng)病原菌產(chǎn)孢量最大,產(chǎn)孢量最大,達(dá)13.50×106個/皿;紫外線對病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)均有顯著的抑制作用。24 h 黑暗或24 h 光照培養(yǎng)時,增加10 minUV 照射,可顯著減小菌落直徑,降低產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率(表3)。
圖3 基于椰子果腐病菌ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of based on the ITS sequences of Thielaviopsis paradoxa
表1 椰子果腐病菌與其近源種形態(tài)特征比較Table 1 Morphological comparison of Thielaviopsis paradoxa with the relative Thielaviopsis spp.
表2 溫度對椰子果腐病菌菌絲生長、產(chǎn)孢以及孢子萌發(fā)的影響Table 2 Effect of temperature on the mycelial growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa
2.3.3 pH 由表4 可知,病原菌在pH 2~10 范圍內(nèi)均可生長和產(chǎn)孢,pH 6 時菌落直徑和產(chǎn)孢量最大,分別為79.8 mm 和10.42×107個/皿,最適合菌絲生長和產(chǎn)孢。孢子在pH 2~11 均能萌發(fā),pH 5 時萌發(fā)率最高,達(dá)32.07%,pH 2 時萌發(fā)率最低,僅為0.13%。
2.3.4 碳源對菌絲生長、產(chǎn)孢以及孢子萌發(fā)的影響 由表5 可知,病原菌可利用不同碳源物質(zhì)進(jìn)行生長繁殖、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)。碳源對病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)影響差異顯著,除阿拉伯樹膠,其余碳源對病原菌產(chǎn)孢影響差異不顯著。以阿拉伯樹膠作物碳源物質(zhì),菌絲生長速度之快,產(chǎn)孢量最大,培養(yǎng)3 d 后菌落直徑達(dá)88.0 mm,產(chǎn)孢量達(dá)18.33×105個/皿。以淀粉為碳源時有利于孢子萌發(fā),萌發(fā)率最高為5.03%。
2.3.5 氮源對菌絲生長、產(chǎn)孢以及孢子萌發(fā)的影響 氮源對病原菌生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)影響差異顯著。以酵母粉為氮源時病原菌的菌絲生長最快,菌落直徑達(dá)63.7 mm;最容易產(chǎn)孢,產(chǎn)孢量為52.09×106個/皿;孢子萌發(fā)率最高。硝酸鈉、硫酸銨、水解乳蛋白、明膠、甘氨酸和尿素對孢子形成影響差異不顯著,產(chǎn)孢量明顯低于牛肉膏和酵母粉(表6)。
2.3.6 培養(yǎng)基對菌絲生長、產(chǎn)孢以及孢子萌發(fā)的影響 病原菌在測試的7 種培養(yǎng)基上都能生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)。在PDA、PSA 和GTYA 培養(yǎng)基上菌絲生長差異不顯著,但在PDA 培養(yǎng)基中生長最快,菌落直徑達(dá)74.7 mm;在PSA 培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大,達(dá)12.56×107個/皿,在OMA、MCL、CM 和CMM 培養(yǎng)基上產(chǎn)孢結(jié)差異不顯著;OMA 最適合病原菌孢子萌發(fā),萌發(fā)率達(dá)41.46%,MCL 萌發(fā)率最低,僅為0.07%(表7)。
對250 g/L 戊唑醇乳油、400 g/L 氟硅唑乳油、300 g/L 苯甲·丙環(huán)唑乳油、30%苯甲·吡唑酯乳油、60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑、40%氟硅唑·吡唑乳6 種殺菌劑進(jìn)行室內(nèi)毒力測定,結(jié)果表明,6 種殺菌劑均對病原菌菌絲生長有抑制作用,其EC50分別為0.499、0.020、0.024、0.045、27.200、0.005 mg/L。氟硅唑·吡唑抑制菌絲生長效果最好,氟硅唑和苯甲·丙環(huán)唑次之。
表3 光照對椰子果腐病菌菌絲生長、產(chǎn)孢以及孢子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of light treatments on mycelia growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa
表4 pH 對椰子果腐病菌菌絲生長、產(chǎn)孢以及孢子萌發(fā)的影響Table 4 Effect of pH on the mycelia growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa
表5 碳源對椰子果腐病菌菌絲生長、產(chǎn)孢以及孢子萌發(fā)的影響Table 5 Effects of carbon sources on the mycelia growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa
表6 氮源對椰子果腐病菌菌絲生長、產(chǎn)孢以及孢子萌發(fā)的影響Table 6 Effects of nitrogen sources on the mycelial growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa
表7 培養(yǎng)基對椰子果腐病菌菌絲生長、產(chǎn)孢以及孢子萌發(fā)的影響Table 7 Effects of media on the mycelial growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa
250g/L 戊唑醇乳油、400 g/L 氟硅唑乳油、300 g/L 苯甲·丙環(huán)唑乳油、30%苯甲·吡唑酯乳油、40%氟硅唑·吡唑乳5 種殺菌劑對病原菌孢子萌發(fā)有抑制作用,EC50分別為9.411、38.340、11.777、8.864、3.657 mg/L,氟硅唑·吡唑抑制孢子萌發(fā)效果最好,苯甲·吡唑酯次之。
奇異根串珠霉菌(T.paradoxa)是一個從受傷寄主組織侵入的土傳植物病原真菌,寄主范圍廣,可侵染30 多種寄主,對重要的經(jīng)濟(jì)作物如菠蘿、甘蔗和椰子等造成很大損失[4]。在華南地區(qū)可侵染椰子、菠蘿、香龍血樹、甘蔗、棕櫚等植物引起病害[8,23-26],本研究致病性侵染結(jié)果表明該病原物還可以侵染香蕉、芒果、豆薯、菠蘿蜜和木薯等多種作物。該病菌可引起菠蘿黑腐病、香蕉冠腐病和椰果內(nèi)部腐爛等病害[27],是重要的采后病害病原菌。
椰子果腐病菌(T.paradoxa)在25~30 ℃生長速度快、產(chǎn)孢量大和孢子萌發(fā)率高,具有較好的耐熱性,病原菌在弱酸條件(pH=6)下菌絲生長速度最快和產(chǎn)孢量最大,與谷會等[19]和余鳳玉等[8]研究結(jié)果一致。病原菌生長速度快、產(chǎn)孢量大、孢子萌發(fā)率高和耐熱性好等特性意味著病原菌具有較好適應(yīng)環(huán)境變化的能力,加大了椰子果腐病病害的防控難度。紫外線對該病原菌菌絲生長、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)有抑制作用,光照對病原菌菌絲生長、孢子產(chǎn)生和孢子萌發(fā)有促進(jìn)作用,這與谷會等[19]報道的結(jié)果不同。奇異根串珠霉菌生物學(xué)特性研究結(jié)果不同反映該病原菌在自然界中存在一定的遺傳多樣性,是否存在致病性分化,還需要進(jìn)一步研究。
椰果采收后易受病原菌的侵染,選用合適的藥劑進(jìn)行防腐保鮮是非常必要的。本試驗(yàn)的氟硅唑·吡唑?qū)σ庸【z生長和孢子萌發(fā)的EC50值分別為0.005 mg/L 和3.657 mg/L,苯甲·吡唑酯則分別為0.045 mg/L 和8.864 mg/L,兩種殺菌劑均有較明顯的抑菌效果。谷會等測定咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑殺菌劑對奇異根串珠霉菌絲生長有很好的抑菌效果[19],其EC50分別為0.0111、0.0126 mg/L。這些殺菌劑對椰子果腐病菌抑菌都有很好的抑制作用,可用于椰子貯藏期的病害防控。
通過致病性測定、形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析,確定椰子果腐病的病原菌為奇異根串珠霉菌(Thielaviopsis paradoxa),病原物通過人工接種還可以侵染龍血樹、香蕉、芒果、豆薯、菠蘿蜜和木薯等植物。
環(huán)境因子影響病原菌的生長。在25~30 ℃菌絲生長速度快,產(chǎn)孢量大,孢子萌發(fā)率高;光暗交替和紫外線可抑制病原菌菌絲生長、孢子產(chǎn)生和萌發(fā);弱酸環(huán)境(pH=6)有利于菌絲生長和孢子形成,而酸性環(huán)境(pH=4、5)更適合孢子萌發(fā)。
氟硅唑·吡唑和苯甲·吡唑酯對病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有很好的抑制作用,可用于該病害的化學(xué)防治。