溫碧柔，林來鳳，賴文娜，陳仕林，劉 活，易潤華

（廣東海洋大學濱海農業(yè)學院，廣東 湛江 524088）

【研究意義】椰子（Cocos nucifera）為棕櫚科（Palmae）椰子屬（Cocos）多年生熱帶木本油料和食品能源作物。椰子原產于亞洲東南部、印度尼西亞至太平洋群島，主要分布于亞洲、非洲、拉丁美洲等赤道濱海地區(qū)，主產國有中國、印度尼西亞、斯里蘭卡、印度、菲律賓、泰國和馬來西亞等國家。我國種植椰子有2000 多年歷史，在我國海南、臺灣、廣東、福建、廣西、云南南部均有栽培。椰樹高大挺拔美觀，在熱帶亞熱帶地區(qū)可作為園林綠化樹種；椰果經濟價值高，可加工為形色多樣的產品［1］；椰汁富含蛋白質、果糖、維生素等營養(yǎng)物質，營養(yǎng)價值高；椰肉可加工膳食食品［2］，具有很大的開發(fā)潛力。2018 年我國椰子主產區(qū)海南省的種植面積3.36 萬hm2，總產值達3.86 億元，總產量2.26 億個，而2011 年的總產值曾達4.79 億元［3］。因此，椰子種植可增加農民就業(yè)機會和經濟收入，促使農民脫貧致富，實現(xiàn)鄉(xiāng)村振興，促進熱帶現(xiàn)代農業(yè)發(fā)展?！厩叭搜芯窟M展】據文獻報道，約600 多種真菌侵染椰子樹根部、葉片、莖干和椰果，引起各種病害［4］。椰果腐病是椰子種植中常見的病害，由多種腐霉如棕櫚疫霉Phytophthora palmivora、桂氏疫霉P.katsurae、P.castaneae和P.heveae等引起，在樹上引起椰果褐色腐爛，播種發(fā)芽時引起芽腐爛。在苗期主要發(fā)生葉部病害，主要有灰斑病（棕櫚擬盤多毛孢菌Pestalotiopsis palmarum）［5］和炭疽?。–olletrotrichum gloeosporioides）［6］等病害侵染。莖泄血?。╯tem bleeding）又稱莖干腐爛?。╯tem rot），在椰子種植區(qū)均有發(fā)生，是一種世界性的病害，對椰子產業(yè)發(fā)展影響極大。該病害的病原菌為奇異根串珠霉菌Thielaviopsis paradoxa，有性型為Ceratocystis paradoxa，可侵染椰樹莖稈，形成黑色病斑，受侵染部位溢出紅棕色液汁，導致莖干腐爛［7-8］。在我國椰子主要發(fā)生的病害有莖泄血病、果腐病和葉部病害。近年來，報道的椰子病害主要有椰苗葉斑?。˙ipolaris setariae［9］、Colletrotrichum gloeosporioides［6］和Curvulariaoryzae［10］）、椰果蒂腐?。↙asiodiplodia theobromae［11］和Pestalotiopsis adusta［12］）、葉枯?。≒.menezesiana）［13］等?！颈狙芯壳腥朦c】椰果采收后發(fā)生的病害主要有椰果底腐?。?4］和黑腐病［15］，2017 年12 月，在廣東省湛江地區(qū)的椰子交易市場發(fā)現(xiàn)一種引起椰子果實外果皮黑色腐爛的病害。該病害引起約15%～20% 的果實腐爛。病害發(fā)生后傳播速度極快，嚴重時侵染內果皮，導致椰肉腐爛和椰汁變質，經濟價值受損嚴重?！緮M解決的關鍵問題】為確定椰子腐爛的病原菌，本試驗對從腐爛果中分離到的純培養(yǎng)物進行致病性測定，根據分離物形態(tài)學特征和ITS 序列分析確定其分類地位，并研究其生物學特性，以期為該病害的防治提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離

用稀釋分離法分離病原菌。從發(fā)病的椰果上挑取孢子進行梯度稀釋制成菌懸液，用混菌法接種到PDA 培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，待菌落長出，挑取單菌落，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 致病性及寄主范圍測定

1.2.1 致病性測定 純培養(yǎng)物接種到PDA 培養(yǎng)基25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。選取健康的椰子經75%酒精表面消毒后，接種直徑為6 mm的菌餅，室溫（25～28℃）保濕，觀察病害發(fā)生情況。試驗設3 次重復，以接種6 mm 不帶菌的培養(yǎng)基作為對照。

1.2.2 寄主范圍測定 接種方法同致病性測定，13種供試寄主植物分別為香蕉Musa nana、芒果Mangifera indica、菠蘿Ananas comosus、甘蔗Saccharum officinarum、豆薯Pachyrhizus erosus、木薯Manihot esculenta、菠蘿蜜Artocarpusheterophyllus、龍血樹Dracaena angustifolia、番木瓜Carica papaya、番薯Ipomoea batatas、白蘿卜Raphanus sativus、木蘭Magnolia lilifl ora和富貴竹Dracaena sanderiana。香蕉、芒果、菠蘿和菠蘿蜜的接種部位為果實，白蘿卜、番薯和豆薯的接種部位為塊根，龍血樹、木蘭、富貴竹和番木瓜的接種部位為葉片，木薯和甘蔗的接種部位為莖桿。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)特征鑒定 參照De Beer 等［16］方法，將病原菌接種到PDA 培養(yǎng)基，25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d，觀察菌落形態(tài)、產孢結構、孢子形態(tài)特征。

1.3.2 ITS 序列分析 按照童依婷等［17］的方法PCR 擴增病原菌ITS 序列。擴增引物為ITS1（TCC GTA GGT GAA CCT GCG G）和ITS4（TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC）。PCR 反應體系采用TaKaRa 公司的MightyAmp DNA Polymerase Ver.2試劑盒，擴增體積為50 μL，含1×MightyAmp Buffer、0.2 μmol/L 上下游引物，1.25 U MightyAmp DNA 聚合酶。擴增程序：98 ℃預變性2 min，98 ℃變性10 s，56 ℃退火15 s，68 ℃延伸 1 min，35 個循環(huán)。PCR 產物由生工生物工程（上海）股份有限公司測序。所得序列在GenBank 進行BLAST 比對和同源性分析，用MEGA6.0 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，用Bootstrap 進行自舉檢驗，1000 次重復。

1.4 生物學特性測定

測定溫度、光照、pH、碳源、氮源和培養(yǎng)基對菌絲生長、產孢量和孢子萌發(fā)的影響。用十字交叉法測量菌落直徑，顯微直接計數測定病原菌的產孢量。將孢子懸浮液涂布在帶有厚度約為2 mm PDA 培養(yǎng)基的玻片，保濕培養(yǎng)6 h 后，記錄孢子萌發(fā)量，計算孢子萌發(fā)率。每個處理3次重復。

1.4.1 溫度 將病原菌接種到PDA 后分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。

1.4.2 光照 將病原菌分別接種到PDA 培養(yǎng)基后分別置于24 h 光照、12 h光照12 h黑暗、24 h黑暗、10 min 紫外線+24 h 光照、10 min 紫外線+24 h 黑暗條件下，室溫（25～28℃）培養(yǎng)3 d。

1.4.3 pH 將病原菌分別接種至pH 為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0 的PDA培養(yǎng)基后置于25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。

1.4.4 碳源和氮源 分別用等質量的葡萄糖、半乳糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、棉子糖、淀粉和阿拉伯樹膠，替換察氏培養(yǎng)基中的蔗糖，以不加碳源為對照；用硫酸銨、硝酸鈉、明膠、水解乳蛋白、甘氨酸、尿素、牛肉膏、酵母粉代替察氏培養(yǎng)基中的NaNO3，以不加氮源為對照，病原菌接種后置于25 ℃黑暗培養(yǎng)3 d。

1.4.5 培養(yǎng)基 測試培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA：土豆200.0 g、瓊脂20.0 g、葡萄糖20.0 g、水1 L）、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA：土豆200.0 g、瓊脂20.0 g、蔗糖20.0 g、水1 L）、燕麥培養(yǎng)基（OMA：燕麥片30.0 g、瓊脂17.0 g、水1 L）、椰子葉培養(yǎng)基（MCL：椰子葉30.0 g、瓊脂20.0 g、水1 L）、胡蘿卜培養(yǎng)基（CM：胡蘿卜100.0 g、瓊脂18 g、水1 L）、玉米粉培養(yǎng)基（CMM：玉米粉17.0 g、瓊脂15.0 g、水1 L）、葡萄糖蛋白胨酵母培養(yǎng)基（GTYA：蛋白胨2.0g、酵母粉1.0 g、葡萄糖10.0 g、瓊脂20.0 g、水1 L）。

1.5 室內毒力測定

6 種供試藥劑：250 g/L 戊唑醇乳油、400 g/L氟硅唑乳油、300 g/L苯甲·丙環(huán)唑（150 g/L丙環(huán)唑、150 g/L 苯醚甲環(huán)唑）乳油、30%苯甲·吡唑酯（20%苯醚甲環(huán)唑、10%吡唑醚菌酯）乳油、60%唑醚·代森聯(lián)（55%代森聯(lián)、5%吡唑醚菌酯）水分散粒劑、40%氟硅唑·吡唑乳。試驗方法參照楊世杰等［18］和谷會等［19］的方法。

應用SPSS 21.0 軟件對試驗數據進行ANOVA及DUNCAN 氏新復極差法分析，并用 MEGA 6 軟件進行圖表分析。用Excel 數據處理系統(tǒng)進行殺菌劑毒力測定的生物統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 致病性及寄主范圍測定

2.1.1 致病性 自然發(fā)病的椰子果實內部棕黑色腐爛，表面長出白色菌絲，并逐漸變成灰黑色（圖1A），形成黑色粉層，果實腐爛。將從具典型癥狀病組織分離到的菌株YZS 接種到健康無病的椰子，10 d 后，果柄斷裂，斷裂處有白色菌絲，內部果肉呈黑褐色（圖1B），隨后整個果實呈棕褐色腐爛。病果上菌絲生長茂盛，菌絲初期白色，后期全部變?yōu)榛液谏▓D1C），散發(fā)出香味。人工接種健康椰子腐爛的癥狀與自然發(fā)病癥狀一致，對照不發(fā)病。從人工接種發(fā)病組織中重新分離的純培養(yǎng)物性狀與菌株YZS 相同，證明菌株YZS 為椰子果腐病的病原菌。

2.1.2 寄主范圍 用菌株YZS 接種13 種植物，其中菠蘿蜜、甘蔗、木薯、香蕉、豆薯、龍血樹、芒果和菠蘿8 種植物在接種部位形成病斑，引起發(fā)病。

圖1 椰子果腐病癥狀Fig.1 Symptoms of fruit rot on Cocos nucifera

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)特征 在PDA平板上，病原菌生長迅速，25 ℃恒溫培養(yǎng)菌落直徑 73.7（±0.5）mm，3 d后長滿9.00 cm的培養(yǎng)皿，菌落初期白色，后變黑（圖2A、B），散發(fā)出果香味。氣生菌絲棉絮狀，菌絲無色，有分隔，分生孢子有大、小兩型。大型分生孢子串生于菌絲頂端的孢子梗上（圖2C、D），鏈狀排列（圖2E、F），單胞，橢圓形，壁較厚，初為無色透明至棕黃色，老熟時為黑褐色，大小為17.3～25.6 μm×9.3～14.6 μm〔平均為20.9（±2.0）μm×11.9（±1.1）μm〕（圖2G）。小型分生孢子內生于瓶梗狀產孢細胞中，孢子排列成串，成熟后自梗末端的孔口依次釋放（圖2 H～J），孢子圓柱形，薄壁，無色，平滑，老熟時為棕褐色，大小為6.9～11.7 μm×3.3～4.9 μm〔平均為9.3（±1.0）μm×4.2（±0.4）μm〕（圖2K）。

2.2.2 ITS 序列分析 椰子果腐病菌的ITS 序列長約為520 bp，經BLAST 分析，與Thielaviopsis ethacetica（KU377506）、T.paradoxa（MG062870）、T.musarum（JX5183250）、Ceratocystis paradoxa（KJ881375）的同源性為100%。利用MEGA6.0軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示椰子果腐病原菌與它們處于同一分支的自舉值為100%（圖3）。根據形態(tài)學特征（差異分析見表1）及系統(tǒng)發(fā)育關系，將椰子果腐病原菌鑒定為Thielaviopsis paradoxa［20-21］。

圖2 椰子果腐病病原菌形態(tài)Fig.2 Morphology of Thielaviopsis paradoxa

2.3 生物學特性

2.3.1 溫度 溫度對病原菌菌絲生長、產孢和孢子萌發(fā)影響差異顯著。在PDA 培養(yǎng)基上，椰子果腐病菌的生長溫度為5～35 ℃；在5、10、35 ℃菌絲生長直徑和產孢量為0，5、10 ℃孢子萌發(fā)率低，而35℃孢子萌發(fā)率為47.08%。在15～30 ℃病原菌可生長、產孢和孢子萌發(fā)，25、30 ℃菌落直徑為88.0 mm，25 ℃時產孢量最大，達190.00×106個/皿；在5～35 ℃孢子均能萌發(fā)，25 ℃孢子萌發(fā)率最高達49.76%（表2）。

2.3.2 光照 光照對病原菌菌絲生長、產孢和孢子萌發(fā)的影響有顯著差異（表3）。24 h 光照條件下菌落生長最快、孢子萌發(fā)率最高，菌落直徑和萌發(fā)率分別為88.0 mm 和70.28%，光照有利于菌絲生長和孢子萌發(fā)；24 h 黑暗培養(yǎng)病原菌產孢量最大，產孢量最大，達13.50×106個/皿；紫外線對病原菌菌絲生長、產孢和孢子萌發(fā)均有顯著的抑制作用。24 h 黑暗或24 h 光照培養(yǎng)時，增加10 minUV 照射，可顯著減小菌落直徑，降低產孢量和孢子萌發(fā)率（表3）。

圖3 基于椰子果腐病菌ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of based on the ITS sequences of Thielaviopsis paradoxa

表1 椰子果腐病菌與其近源種形態(tài)特征比較Table 1 Morphological comparison of Thielaviopsis paradoxa with the relative Thielaviopsis spp.

表2 溫度對椰子果腐病菌菌絲生長、產孢以及孢子萌發(fā)的影響Table 2 Effect of temperature on the mycelial growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa

2.3.3 pH 由表4 可知，病原菌在pH 2～10 范圍內均可生長和產孢，pH 6 時菌落直徑和產孢量最大，分別為79.8 mm 和10.42×107個/皿，最適合菌絲生長和產孢。孢子在pH 2～11 均能萌發(fā)，pH 5 時萌發(fā)率最高，達32.07%，pH 2 時萌發(fā)率最低，僅為0.13%。

2.3.4 碳源對菌絲生長、產孢以及孢子萌發(fā)的影響 由表5 可知，病原菌可利用不同碳源物質進行生長繁殖、產孢和孢子萌發(fā)。碳源對病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)影響差異顯著，除阿拉伯樹膠，其余碳源對病原菌產孢影響差異不顯著。以阿拉伯樹膠作物碳源物質，菌絲生長速度之快，產孢量最大，培養(yǎng)3 d 后菌落直徑達88.0 mm，產孢量達18.33×105個/皿。以淀粉為碳源時有利于孢子萌發(fā)，萌發(fā)率最高為5.03%。

2.3.5 氮源對菌絲生長、產孢以及孢子萌發(fā)的影響 氮源對病原菌生長、產孢和孢子萌發(fā)影響差異顯著。以酵母粉為氮源時病原菌的菌絲生長最快，菌落直徑達63.7 mm；最容易產孢，產孢量為52.09×106個/皿；孢子萌發(fā)率最高。硝酸鈉、硫酸銨、水解乳蛋白、明膠、甘氨酸和尿素對孢子形成影響差異不顯著，產孢量明顯低于牛肉膏和酵母粉（表6）。

2.3.6 培養(yǎng)基對菌絲生長、產孢以及孢子萌發(fā)的影響 病原菌在測試的7 種培養(yǎng)基上都能生長、產孢和孢子萌發(fā)。在PDA、PSA 和GTYA 培養(yǎng)基上菌絲生長差異不顯著，但在PDA 培養(yǎng)基中生長最快，菌落直徑達74.7 mm；在PSA 培養(yǎng)基上產孢量最大，達12.56×107個/皿，在OMA、MCL、CM 和CMM 培養(yǎng)基上產孢結差異不顯著；OMA 最適合病原菌孢子萌發(fā)，萌發(fā)率達41.46%，MCL 萌發(fā)率最低，僅為0.07%（表7）。

2.6 6 種殺菌劑對病原菌的影響

對250 g/L 戊唑醇乳油、400 g/L 氟硅唑乳油、300 g/L 苯甲·丙環(huán)唑乳油、30%苯甲·吡唑酯乳油、60%唑醚·代森聯(lián)水分散粒劑、40%氟硅唑·吡唑乳6 種殺菌劑進行室內毒力測定，結果表明，6 種殺菌劑均對病原菌菌絲生長有抑制作用，其EC50分別為0.499、0.020、0.024、0.045、27.200、0.005 mg/L。氟硅唑·吡唑抑制菌絲生長效果最好，氟硅唑和苯甲·丙環(huán)唑次之。

表3 光照對椰子果腐病菌菌絲生長、產孢以及孢子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of light treatments on mycelia growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa

表4 pH 對椰子果腐病菌菌絲生長、產孢以及孢子萌發(fā)的影響Table 4 Effect of pH on the mycelia growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa

表5 碳源對椰子果腐病菌菌絲生長、產孢以及孢子萌發(fā)的影響Table 5 Effects of carbon sources on the mycelia growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa

表6 氮源對椰子果腐病菌菌絲生長、產孢以及孢子萌發(fā)的影響Table 6 Effects of nitrogen sources on the mycelial growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa

表7 培養(yǎng)基對椰子果腐病菌菌絲生長、產孢以及孢子萌發(fā)的影響Table 7 Effects of media on the mycelial growth,spore production and spore germination of Thielaviopsis paradoxa

250g/L 戊唑醇乳油、400 g/L 氟硅唑乳油、300 g/L 苯甲·丙環(huán)唑乳油、30%苯甲·吡唑酯乳油、40%氟硅唑·吡唑乳5 種殺菌劑對病原菌孢子萌發(fā)有抑制作用，EC50分別為9.411、38.340、11.777、8.864、3.657 mg/L，氟硅唑·吡唑抑制孢子萌發(fā)效果最好，苯甲·吡唑酯次之。

3 討論

奇異根串珠霉菌（T.paradoxa）是一個從受傷寄主組織侵入的土傳植物病原真菌，寄主范圍廣，可侵染30 多種寄主，對重要的經濟作物如菠蘿、甘蔗和椰子等造成很大損失［4］。在華南地區(qū)可侵染椰子、菠蘿、香龍血樹、甘蔗、棕櫚等植物引起病害［8,23-26］，本研究致病性侵染結果表明該病原物還可以侵染香蕉、芒果、豆薯、菠蘿蜜和木薯等多種作物。該病菌可引起菠蘿黑腐病、香蕉冠腐病和椰果內部腐爛等病害［27］，是重要的采后病害病原菌。

椰子果腐病菌（T.paradoxa）在25～30 ℃生長速度快、產孢量大和孢子萌發(fā)率高，具有較好的耐熱性，病原菌在弱酸條件（pH=6）下菌絲生長速度最快和產孢量最大，與谷會等［19］和余鳳玉等［8］研究結果一致。病原菌生長速度快、產孢量大、孢子萌發(fā)率高和耐熱性好等特性意味著病原菌具有較好適應環(huán)境變化的能力，加大了椰子果腐病病害的防控難度。紫外線對該病原菌菌絲生長、產孢和孢子萌發(fā)有抑制作用，光照對病原菌菌絲生長、孢子產生和孢子萌發(fā)有促進作用，這與谷會等［19］報道的結果不同。奇異根串珠霉菌生物學特性研究結果不同反映該病原菌在自然界中存在一定的遺傳多樣性，是否存在致病性分化，還需要進一步研究。

椰果采收后易受病原菌的侵染，選用合適的藥劑進行防腐保鮮是非常必要的。本試驗的氟硅唑·吡唑對椰子果腐病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50值分別為0.005 mg/L 和3.657 mg/L，苯甲·吡唑酯則分別為0.045 mg/L 和8.864 mg/L，兩種殺菌劑均有較明顯的抑菌效果。谷會等測定咪鮮胺和苯醚甲環(huán)唑殺菌劑對奇異根串珠霉菌絲生長有很好的抑菌效果［19］，其EC50分別為0.0111、0.0126 mg/L。這些殺菌劑對椰子果腐病菌抑菌都有很好的抑制作用，可用于椰子貯藏期的病害防控。

4 結論

通過致病性測定、形態(tài)學特征和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定椰子果腐病的病原菌為奇異根串珠霉菌（Thielaviopsis paradoxa），病原物通過人工接種還可以侵染龍血樹、香蕉、芒果、豆薯、菠蘿蜜和木薯等植物。

環(huán)境因子影響病原菌的生長。在25～30 ℃菌絲生長速度快，產孢量大，孢子萌發(fā)率高；光暗交替和紫外線可抑制病原菌菌絲生長、孢子產生和萌發(fā)；弱酸環(huán)境（pH=6）有利于菌絲生長和孢子形成，而酸性環(huán)境（pH=4、5）更適合孢子萌發(fā)。

氟硅唑·吡唑和苯甲·吡唑酯對病原菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有很好的抑制作用，可用于該病害的化學防治。