陳譚星，高正龍，曹力凡，顏慧萍，謝曉陽，孟慶法，王 洋，王品勝

（1.河南省高新技術(shù)實(shí)業(yè)有限公司，河南 鄭州 450002；2.河南省生物技術(shù)開發(fā)中心/河南省科學(xué)院天然產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；3.河南省科學(xué)院地理研究所，河南 鄭州 450052）

構(gòu)樹（Broussonetia papyrifera）又名楮桃樹，桑科（Moraceae）構(gòu)樹屬（Broussonetia）多年生落葉喬木，為雌雄異株植物，廣泛分布于我國各地區(qū)［1］。構(gòu)樹葉氨基酸含量豐富，營養(yǎng)價(jià)值高，適口性好，具有易豐產(chǎn)、耐砍伐、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，可以作為優(yōu)質(zhì)的蛋白飼料原料［1-2］。2015 年構(gòu)樹扶貧被國家扶貧辦列為十大精準(zhǔn)扶貧工程，該工程采用中科院植物所培育的雜交構(gòu)樹以及其配套的產(chǎn)業(yè)化技術(shù)，重點(diǎn)在全國貧困地區(qū)實(shí)施雜交構(gòu)樹“林-料-畜”一體化畜牧產(chǎn)業(yè)扶貧，讓我國養(yǎng)殖業(yè)看到了擺脫蛋白飼料依賴進(jìn)口的希望［3］。構(gòu)樹不僅飼用價(jià)值高，且在飼料、造紙、醫(yī)藥、食品、綠化及生態(tài)修復(fù)等方面具有巨大的應(yīng)用前景，如構(gòu)樹枝葉繁茂、根系發(fā)達(dá)，對(duì)防風(fēng)固沙、固土保水有顯著作用；構(gòu)樹葉片對(duì)NO2、Cl2、SO2具有較強(qiáng)的吸收凈化能力；構(gòu)樹果實(shí)是一種富含維生素及礦質(zhì)營養(yǎng)的野生水果資源?？偟膩碚f，構(gòu)樹是集生態(tài)、經(jīng)濟(jì)及社會(huì)效益于一身的多功能樹種［4-5］。

優(yōu)質(zhì)的構(gòu)樹種苗生產(chǎn)是推進(jìn)構(gòu)樹產(chǎn)業(yè)化發(fā)展的重要因素之一。構(gòu)樹常見的繁殖方式有種子繁殖、無性扦插繁殖、組織培養(yǎng)繁殖等，種子繁殖擁有苗木抗逆能力強(qiáng)、生長發(fā)育健壯等特點(diǎn)，缺點(diǎn)是變異系數(shù)大，不能保持母本的優(yōu)良特性；扦插繁殖的特點(diǎn)是方法簡單、繁殖系數(shù)高、繁殖材料來源廣等，缺點(diǎn)是扦插苗的根系分布不均勻，且不發(fā)達(dá)；組織培養(yǎng)繁殖的特點(diǎn)是繁殖率高、遺傳性穩(wěn)定，缺點(diǎn)是生產(chǎn)成本高，多次繼代易退化等。構(gòu)樹種苗繁育過程中，溫度、光照、植物生長調(diào)節(jié)劑的種類等均對(duì)構(gòu)樹的繁殖有顯著影響，針對(duì)不同的繁殖方式開展各類影響育苗成活率的因素，已成為構(gòu)樹科學(xué)研究新的關(guān)注點(diǎn)之一［6-8］。

目前，構(gòu)樹育苗技術(shù)方面的研究已有一些報(bào)道，但比較零散，還不完善，對(duì)構(gòu)樹育苗生產(chǎn)缺乏系統(tǒng)性指導(dǎo)?；诖耍疚氖占?、整理了近10 余年來構(gòu)樹育苗的現(xiàn)狀與研究進(jìn)展，從播種、扦插、組織培養(yǎng)3 種常見的育苗方法入手分析影響構(gòu)樹育苗的主要因素，對(duì)播種育苗中常見的種子處理方法進(jìn)行匯總，對(duì)組織培養(yǎng)中使用的消毒方法、培養(yǎng)基類型及植物生長調(diào)節(jié)劑濃度進(jìn)行歸納總結(jié)，并對(duì)未來構(gòu)樹育苗相關(guān)研究提出了建議與展望，以期為構(gòu)樹的種苗生產(chǎn)和良種選育工作提供參考，也為我國構(gòu)樹的大面積推廣種植提供借鑒。

1 播種育苗影響因素

種子萌發(fā)是一個(gè)涉及形態(tài)變化、生理生化及基因調(diào)控等復(fù)雜的物質(zhì)代謝過程，除種子內(nèi)在結(jié)構(gòu)發(fā)育完全外，適宜的溫度、水分和光照等也是種子萌發(fā)的必要條件，不同植物的種子形態(tài)結(jié)構(gòu)存在差異，影響其萌發(fā)的主導(dǎo)因素因而不同［9-11］。

1.1 種子采收

適時(shí)采收是保證種子發(fā)芽率與發(fā)芽勢(shì)的關(guān)鍵因素。構(gòu)樹的種子成熟期主要在8 月份，此時(shí)采收的構(gòu)樹種子發(fā)芽率最高，發(fā)芽勢(shì)最好，而9 月的構(gòu)樹種子發(fā)芽率比8 月份降低［12］。閆東方等［13］以構(gòu)樹青果、微紅果、紅果和過熟果的種子進(jìn)行催芽試驗(yàn)，結(jié)果顯示紅果的種子萌發(fā)效果最好、發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別為62.50%和25.83%，微紅果的種子萌發(fā)效果較差，發(fā)芽率和發(fā)芽勢(shì)分別為10.00%和5.00%，青果種子不萌發(fā)。此外，構(gòu)樹種子含水量較低、為11.20%，采集后若不及時(shí)播種，應(yīng)干燥保存［14］。

1.2 種子處理

構(gòu)樹種子較小，種皮較硬，種子吸水能力弱，自然條件下萌發(fā)需40 d 左右，不利于構(gòu)樹種苗生產(chǎn)。構(gòu)樹種子經(jīng)低濃度NaCl 溶液處理后可以提高萌芽率，濃度過高則會(huì)抑制構(gòu)樹種子萌發(fā)，種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)均出現(xiàn)下降現(xiàn)象［15-16］。也有研究表明，濃硫酸可促進(jìn)構(gòu)樹種子萌芽，構(gòu)樹種子經(jīng)濃硫酸腐蝕處理9 min 后，平均發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)和發(fā)芽時(shí)間分別為91.11%、48.89%和8.41 d，發(fā)芽效果最好［17］。外源激素浸種對(duì)構(gòu)樹種子的萌芽效果影響不同，6-BA 與GA3能不同程度地促進(jìn)構(gòu)樹種子萌發(fā)，其中GA3促進(jìn)作用最大，使用1600 mg/L GA3浸種24 h，構(gòu)樹種子萌發(fā)率達(dá)72.4%［18］。常見的構(gòu)樹種子處理方法見表1。

1.3 環(huán)境條件

構(gòu)樹種子是光中性種子，光照不是構(gòu)樹種子萌發(fā)的限制因子，構(gòu)樹種子在暗條件下可以正常萌發(fā)，但萌發(fā)后會(huì)出現(xiàn)莖徒長、子葉長出時(shí)間延遲等現(xiàn)象［18］。溫度對(duì)構(gòu)樹種子發(fā)芽非常關(guān)鍵，適合構(gòu)樹種子的催芽溫度是30 ℃，構(gòu)樹種子催芽的上限致死溫度是40 ℃［17］。楊平等［20］研究結(jié)果顯示，構(gòu)樹種子在水勢(shì)0～-0.6 MPa 之間時(shí)可以萌發(fā)，種子萌發(fā)率和萌發(fā)速度隨著水勢(shì)下降出現(xiàn)降低，其中在水勢(shì)0～-0.2 MPa 時(shí)萌發(fā)速度下降最快，對(duì)種子萌發(fā)影響最大，水勢(shì)在-0.86 MPa 時(shí)種子萌發(fā)完全被抑制。

2 扦插育苗影響因素

扦插育苗是選用離體的枝、葉、根等植物部分營養(yǎng)器官作為材料，插入土壤、泥炭、蛭石等基質(zhì)中，使其生根、發(fā)芽，生長為完整植株的育苗方法，具有繁殖速度快、方法簡單、成本低等特點(diǎn)［21］。根據(jù)繁殖材料的不同可將扦插分為葉插、根插、枝插、芽插等，在構(gòu)樹的相關(guān)研究及應(yīng)用中，枝插最為普遍。影響構(gòu)樹扦插繁殖的因素較多，主要包括插穗規(guī)格、插穗的處理、基質(zhì)配比等［6］。

2.1 插穗規(guī)格

插穗的木質(zhì)化程度、粗度及長度均不同程度影響植物扦插效果［21-24］。不同木質(zhì)化程度的構(gòu)樹穗條扦插生根率存在差異：未木質(zhì)化的穗條比半木質(zhì)化與完全木質(zhì)化的穗條生根狀況好，其總根長、最長根長均為最好［25］。陳譚星等［6］的研究表明，插穗直徑0.5～1.0 cm 半木質(zhì)化穗條的構(gòu)樹扦插生根率及根系效果指數(shù)均顯著大于1.0～1.5 cm（木質(zhì)化穗條和0.3～0.5 cm 嫩枝穗條；王定勝［26］以4 種不同粗度規(guī)格的光葉楮插穗進(jìn)行扦插繁殖，結(jié)果顯示中等粗度的插穗平均不定根數(shù)量最多，插穗過粗或過細(xì)均會(huì)導(dǎo)致不定根數(shù)減少。總的來說，木質(zhì)化高的插穗，由于其直徑較粗，儲(chǔ)存的營養(yǎng)物質(zhì)較多，有利于插穗的生根，但木質(zhì)化程度越高，分生能力越差，越難產(chǎn)生和形成不定根［27-28］。

2.2 處理方法

在育苗過程中，通常使用一些外源物質(zhì)處理來調(diào)控插穗內(nèi)含物的含量，進(jìn)而減少抑制插穗生根物質(zhì)的含量，達(dá)到提高扦插成活率的目的。大量研究表明，用不同濃度的植物生長調(diào)節(jié)劑處理穗條，可促進(jìn)植物扦插生根，提高成活率［29-31］。陳譚星等［6］使用200 mg/L 的ABT 1 號(hào)生根劑處理雜交構(gòu)樹插穗30 min，插穗的生根率最高，生根效果最好；王定勝［26］以2 年生光葉楮插穗為試材，用600 mg/L 的IBA 處理插穗后，扦插生根效果最佳，生根率達(dá)92%，生根數(shù)量、平均根長及最長根長等生根指標(biāo)均比其他濃度處理好；ABT 1 號(hào)生根劑在雜交構(gòu)樹扦插中的處理結(jié)果顯示，扦插90 d 后，不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)激素處理下插穗的生根率依次為0.02‰＞0.5‰＞0.4‰［25］。

2.3 基質(zhì)選擇

扦插基質(zhì)是扦插苗水分的載體，也是營養(yǎng)和礦物質(zhì)的來源，應(yīng)根據(jù)樹種選擇相應(yīng)的扦插基質(zhì)［21］。構(gòu)樹無性系扦插試驗(yàn)結(jié)果顯示，在純黃心土（未耕種過）、黃土（耕種過）、水稻田土、火燒土4 種土壤中的穗條扦插生根結(jié)果存在顯著差異，其中以火燒土作為扦插基質(zhì)時(shí)生根率及生根數(shù)最高［32］。陳譚星等［6］使用扦插基質(zhì)為33.33%珍珠巖+33.33%蛭石+33.33%草炭土?xí)r插穗生根率最高，最適合雜交構(gòu)樹扦插；王定勝［26］認(rèn)為沙∶礱糠灰∶珍珠巖的體積比為1 ∶1 ∶1作為基質(zhì)時(shí)，光葉楮扦插的生根率、平均根數(shù)、平均根長均為最優(yōu)，扦插效果最好［26］。

3 組織培養(yǎng)育苗影響因素

植物組織培養(yǎng)是一種在無菌條件下，利用適宜的培養(yǎng)基對(duì)植物的器官、組織、細(xì)胞及原生質(zhì)體等外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)其產(chǎn)生愈傷組織或潛伏芽等，以獲得再生的完整植株的技術(shù)［33］。目前，研究人員已經(jīng)利用構(gòu)樹不同部位的器官作為外植體建立了植株再生體系，在體細(xì)胞胚胎發(fā)生方面也進(jìn)行了初步研究。利用組織培養(yǎng)繁殖法進(jìn)行構(gòu)樹的種苗繁育，具有繁殖系數(shù)高、節(jié)省土地等優(yōu)點(diǎn)，在組織培養(yǎng)育苗過程中，外植體消毒、培養(yǎng)基選擇、植物生長調(diào)節(jié)劑應(yīng)用、環(huán)境條件等均影響著種苗的成活率。

3.1 外植體消毒

無菌體系的建立是植物組織培養(yǎng)試驗(yàn)成功的關(guān)鍵［34］。構(gòu)樹全株密被絨毛，不利于外植體的消毒滅菌，消毒劑的選擇及消毒時(shí)間是影響構(gòu)樹外植體滅菌效果的主要因素。從表2 可以看出，構(gòu)樹消毒劑主要為酒精+HgCl2，消毒時(shí)間5～15 min。前人研究表明，光葉楮的嫩莖基部采用70%酒精30 s+0.1%HgCl2（含吐溫）8 min 消毒效果最佳［35］；蔣澤平等［36］研究結(jié)果顯示，光葉楮莖段（含葉柄）經(jīng)75% 乙醇溶液浸泡殺菌30 s 后，再用0.1% HgCl2消毒15 min 效果最好，外植體成活率達(dá)53.6% ；田瑞等［37］以3 種消毒劑（2% NaClO、0.3% HgCl2和10% H2O2）及3 種滅菌時(shí)間（5、10、15 min）對(duì)帶芽的雜交構(gòu)樹莖段進(jìn)行處理，結(jié)果顯示消毒效果最好的處理是75%乙醇溶液浸泡40 s 后再用0.3% HgCl2滅菌15 min，除菌率達(dá)68%。構(gòu)樹莖尖［38］、莖段［39］、下胚軸［40］及葉片［41］都可作為誘導(dǎo)增殖的外植體，不同的外植體來源，由于其自身因素（外植體生長程度、表面菌及內(nèi)生菌）使其消毒時(shí)間、消毒劑的使用存在著差異，常見的外植體部位及消毒方法見表2。

表2 構(gòu)樹常用外植體及其消毒方法Table 2 Commonly used explants of paper mulberry and their disinfection methods

3.2 培養(yǎng)基及植物生長調(diào)節(jié)劑

器官發(fā)生途徑和體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑是兩種常用的構(gòu)樹離體植株再生途徑，兩種途徑均可通過直接和間接發(fā)生途徑實(shí)現(xiàn)［46-47］。在器官發(fā)生與體細(xì)胞胚胎發(fā)生的直接與間接發(fā)生途徑中，培養(yǎng)基和植物生長調(diào)節(jié)劑的選擇是影響外植體再生的關(guān)鍵因素［48-49］。

3.2.1 體細(xì)胞胚發(fā)生途徑 植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生是指在特定條件下，植物體細(xì)胞未經(jīng)性細(xì)胞融合而進(jìn)行類似合子胚發(fā)育過程形成胚狀體，最終發(fā)育成完整植株的過程，是一種可以快速有效、遺傳相對(duì)穩(wěn)定的植物擴(kuò)繁方法。目前，已有學(xué)者對(duì)構(gòu)樹體細(xì)胞胚胎發(fā)生技術(shù)進(jìn)行研究，集中在間接發(fā)生途徑中，如周鵬等［39］在MS 基本培養(yǎng)基中分別添加TDZ、NAA 和2,4-D，從構(gòu)樹莖段誘導(dǎo)胚性愈傷組織及體胚，結(jié)果顯示TDZ 是影響外植體胚性愈傷組織誘導(dǎo)的主要因素，NAA 是影響體胚誘導(dǎo)的主要因素，胚性愈傷組織、體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的最佳激素組合分別為0.05 mg/L TDZ+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L 2,4-D 和0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA，體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率達(dá)41.33%。構(gòu)樹嫩葉在含2,4-D 0.5 mg/L 的MS 培養(yǎng)基中7 d 左右出現(xiàn)愈傷且誘導(dǎo)率最高，達(dá)93%；愈傷組織繼代在激素為2,4-D 0.2 mg/L 的MS 培養(yǎng)基（愈傷生長旺盛，松散，淡黃色）中進(jìn)行；使用6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L 的MS 培養(yǎng)基體胚誘導(dǎo)效率最高，胚胎發(fā)生率達(dá)17.9%［43］。培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D，pH 6.0，雜交構(gòu)樹葉片愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)94.6%，誘導(dǎo)效果最佳；最佳繼代培養(yǎng)基為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT，pH 6.2；選擇表面顆粒多、質(zhì)地松軟、淺黃色或白色的愈傷組織進(jìn)行體細(xì)胞胚誘導(dǎo)，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，pH 6.4，體細(xì)胞胚的發(fā)生頻率達(dá)到96.0%［50］。

3.2.2 器官發(fā)生途徑 器官發(fā)生途徑是利用植物器官脫分化產(chǎn)生愈傷組織再分化產(chǎn)生不定芽，或者直接從外植體上誘導(dǎo)不定芽培養(yǎng)成完整植株的過程［51］。這種途徑具有周期短、易于操作、誘導(dǎo)率較高、能較好地保持母體遺傳性等優(yōu)點(diǎn)。

構(gòu)樹器官間接發(fā)生一般要經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)及不定芽分化、芽增殖及生根培養(yǎng)3 個(gè)步驟。從表3 可以看出，構(gòu)樹葉片及莖段均能作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)進(jìn)而完成間接器官發(fā)生。構(gòu)樹間接器官發(fā)生途徑中，常用的細(xì)胞分裂素和生長素分別是6-BA 和NAA；愈傷組織的誘導(dǎo)、不定芽的分化及芽的增殖常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS，生根培養(yǎng)常用的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為1/2 MS。前人研究結(jié)果顯示，光葉楮葉柄的再生能力明顯強(qiáng)于葉片，生根培養(yǎng)時(shí)，1/2 MS 培養(yǎng)基的生根效果優(yōu)于MS培養(yǎng)基［52］。

從已發(fā)表的研究結(jié)果來看，構(gòu)樹直接器官發(fā)生途徑一般是用腋芽進(jìn)行增殖進(jìn)而實(shí)現(xiàn)快速繁殖，是優(yōu)良無性系擴(kuò)繁的有效途徑（表3）。陶文丞等［53］以優(yōu)良構(gòu)樹母株的幼莖為外植體，出芽率最高的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，生根效果最好的培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.1 mg/L。萬文等［8］研究結(jié)果顯示，適宜雜交構(gòu)樹側(cè)芽誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS +6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，誘導(dǎo)分化率為94.4%；適宜試管苗增殖和生長的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L +GA0.2 mg/L，不定芽平均分化系數(shù)為3.3，平均苗高2.83 cm；在壯苗生根過程中培養(yǎng)基為1/2 MS+NAA 0.3 mg/L+IBA 0.5 mg/L+6-BA 0.01 mg/L 和1/2 MS+NAA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L+6-BA 0.01 mg/L時(shí)最適合壯苗生根，生根率均達(dá)100%［8］。直接器官發(fā)生途徑快速繁殖常用的培養(yǎng)基組合見表3。

表3 不同品種構(gòu)樹芽增殖和生根培養(yǎng)基成分Table 3 Composition of culture medium for shoot proliferation and rooting of different varieties of paper mulberry

3.3 煉苗條件

煉苗時(shí)影響組培苗成活率的主要因素為溫度和光照。當(dāng)瓶苗生長至4～6 片葉、株高3～5 cm 時(shí)可出瓶移栽［53］。移栽前將瓶苗在自然光下煉苗2～3 d，隨后將幼苗取出，置于清水中漂洗去除根部的培養(yǎng)基，栽植于體積比為珍珠巖∶蛭石∶草炭土=1 ∶1 ∶1 的基質(zhì)中并覆蓋塑料薄膜，幼苗移栽后要經(jīng)常給葉片噴水。為保證植物恢復(fù)生長所需養(yǎng)分，可在有效移栽后用無機(jī)營養(yǎng)液噴施葉面，每隔3 d 噴1 次，15 d 后可移栽到苗圃，成活率達(dá)82.5%［39］。

4 展望

近年來，構(gòu)樹因其在飼用、造紙、食品及綠化等方面的價(jià)值而備受關(guān)注。種子繁殖常導(dǎo)致性狀分離，增加遺傳多樣性，有利于構(gòu)樹品種選育工作。從現(xiàn)有文獻(xiàn)來看，常規(guī)播種育苗技術(shù)日漸成熟，但有關(guān)構(gòu)樹育種的研究報(bào)道較為罕見，今后應(yīng)加大構(gòu)樹育種的工作力度，建立構(gòu)樹種質(zhì)資源圃，不斷更新創(chuàng)造適合于各地區(qū)的優(yōu)良構(gòu)樹品種。此外，國外已有學(xué)者初步建立了構(gòu)樹遺傳轉(zhuǎn)化體系［40］，但有關(guān)此方面的研究依舊薄弱，應(yīng)加強(qiáng)構(gòu)樹分子輔助育種研究，為構(gòu)樹的遺傳改良提供依據(jù)。

目前，構(gòu)樹無性扦插繁殖技術(shù)已經(jīng)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大量使用，研究人員通過各類研究解決了構(gòu)樹扦插難生根的問題，大大提高了扦插生根率及成活率，但在扦插生根機(jī)理方面未能深入研究。構(gòu)樹組織培養(yǎng)雖建立了植株再生及莖段快繁體系，但生產(chǎn)實(shí)踐上仍存在生產(chǎn)成本高、育苗周期長、多次繼代易退化等一系列問題。因此，在今后研究中，一方面應(yīng)大力度開展提高扦插生根率、減少成本及和縮短育苗周期等方面研究；另一方面，在構(gòu)樹組織培養(yǎng)技術(shù)各個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行深入研究，探索出一套優(yōu)質(zhì)、高效、經(jīng)濟(jì)的種苗繁育技術(shù)，為構(gòu)樹的大量繁殖和工廠化育苗提供支持。