陶志云，徐文娟，施祖灝，朱春紅，章雙杰，宋衛(wèi)濤，劉宏祥，李慧芳*

(1. 江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州，225125；2. 譜尼測(cè)試集團(tuán)江蘇有限公司，江蘇 蘇州，215000)

鴨疫里默氏菌病是侵害水禽和其它鳥類的一種急性敗血性傳染病，以全身漿膜面發(fā)生纖維素性炎癥為特征，其發(fā)病及死亡率高，急性病變多以死亡為轉(zhuǎn)歸，慢性病例多會(huì)耐過，但會(huì)失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-3]，因此，該病已成為危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的一種重要傳染病。目前，鴨疫里默氏菌病的臨床診斷主要的方法是血清學(xué)診斷(酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和間接免疫熒光試驗(yàn))和常規(guī)PCR檢測(cè)等。由于鴨疫里默氏菌血清學(xué)眾多，目前已報(bào)道的有21種血清型[4-7]，檢測(cè)難度較大。SYBRGreen I實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用特異性引物和SYBR Green I核酸染料，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR過程，無需電泳，以其速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、能定量等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)[8-10]。本研究建立一種檢測(cè)鴨疫里默氏菌的熒光定量PCR方法，根據(jù)鴨疫里默氏菌16S rRNA保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)優(yōu)化反應(yīng)體系和條件，建立檢測(cè)鴨疫里默氏菌的熒光定量PCR方法，并將該方法用于鴨疫里默氏菌感染后在組織中分布檢測(cè)，為鴨疫里默氏菌感染機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株培養(yǎng) 試驗(yàn)所用鴨疫里默氏菌菌株為ATCC11845標(biāo)準(zhǔn)株，菌株購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。凍存的菌株經(jīng)活化后挑取單克隆，加入5 mL含5%血清的TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)培養(yǎng)液中，37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)，取2 mL菌液加入到200 mL的含有5%血清的TSB(胰蛋白胨大豆肉湯)培養(yǎng)液中，繼續(xù)37 ℃搖床中過夜培養(yǎng)。將所得菌液1 000 rpm/min離心10 min后去上清，用生理鹽水將沉淀稀釋為4×106，4×107，4×108，4×109，4×1010，4×1011cfu/mL，備用。

1.1.2 試驗(yàn)鴨 試驗(yàn)鴨來源于高郵鴨集團(tuán)，為健康雛鴨，相同飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)至30日齡時(shí)進(jìn)行分組。

1.1.3 鴨疫里默氏菌人工感染試驗(yàn)及樣品采集 每只鴨皮下注射0.5 mL菌液，對(duì)照組鴨注射相同劑量的生理鹽水，每組15只，人工感染后連續(xù)觀察14 d，統(tǒng)計(jì)死亡率，計(jì)算半數(shù)致死量，確定適宜的感染劑量。

采用1×109cfu/mL的鴨疫里默氏菌人工感染健康的30日齡育成期高郵鴨150只，按照該品種鴨國家標(biāo)準(zhǔn)要求飼養(yǎng)，隨機(jī)分為2組(對(duì)照組和感染組)，在感染的1 d，2 d，3 d，5 d，9 d和14 d，屠宰后采集心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及腦組織，分別用凍存管儲(chǔ)存于液氮中，用于細(xì)菌RNA提取。

1.2 主要試劑與儀器

胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(HB4114，青島海博生物有限公司)，血平皿(9 cm，YB3400071，上海鈺博生物科技有限公司)，國產(chǎn)血清(四季青，11011-8611，北京索萊寶科技有限公司)，TRIzol-A+總RNA提取試劑(DP421)、RealUniversal彩色熒光定量預(yù)混試劑(SYBR Green，F(xiàn)P201，天根生化科技(北京)有限公司)、FastKing一步法除基因組cDNA 第一鏈合成預(yù)混試劑(KR118，天根生化科技(北京)有限公司)、pGM-T克隆試劑盒(VT302-02，天根生化科技(北京)有限公司)、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒(DP118，天根生化科技(北京)有限公司)、Universal DNA純化回收試劑盒(DP214，天跟生化科技(北京)有限公司)。高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf centrifuge 5417R)，紫外分光光度計(jì)(GeneQuant II Pharmacia Biotech)，PCR儀(Eppendorf mastercycler)，凝膠成像系統(tǒng)(Tanon 3500R)，熒光定量PCR儀(Stratagene Mx3000P)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 RNA提取和質(zhì)量檢測(cè) 按照TRNzol-A+總RNA提取試劑說明書提取組織總RNA，用適量RNA-free水溶解提取的RNA沉淀，通過瓊脂糖凝膠電泳和分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的純度和含量。

1.3.2 cDNA第一鏈的合成 參照FastKing一步法除基因組cDNA第一鏈合成試劑盒說明書將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)體系為：模板RNA 1 μg，5×FastKing-RT SuperMix 4 μL，加水至20 μL。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為：42 ℃ 孵育15 min，95 ℃孵育3 min，反應(yīng)結(jié)束后取出逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置冰上進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)或冷凍保存。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)、目的片段克隆及標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備 根據(jù)鴨疫里默氏菌16S rRNA基因信息(GenBank登錄號(hào)為：NR_026025.1)，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)。上游引物序列F: 5'-ACTGCCGTTGATACTGCTA-3'，下游引物序列R: 5'-TCTAATCCTGTTCGCTCCC-3'，目的序列長度約163 bp。PCR反應(yīng)體系總體積20 μL，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s(35個(gè)循環(huán))；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收純化試劑盒回收純化后按pGM-T載體試劑盒說明書連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入TOP10感受態(tài)細(xì)胞，涂板后置于37 ℃生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，挑取轉(zhuǎn)化子于含氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃ 搖床180 r/min振搖培養(yǎng)過夜，菌液PCR鑒定目的片段是否連接到質(zhì)粒中。將鑒定正確的質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 熒光定量PCR反應(yīng) SYBR Green I法進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，20 μL反應(yīng)體系為：cDNA 2 μL，2×RealUniversal PreMix 10 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 6.8 μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件為：① 95 ℃ 15min；② 95 ℃ 20 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)；③ 95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 將測(cè)序驗(yàn)證正確的含鴨疫里默氏菌16S rRNA基因的質(zhì)粒，用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒提取陽性質(zhì)粒，用分光光度計(jì)測(cè)其濃度后，做10倍梯度稀釋，以10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8濃度質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件同上，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)?？截悢?shù)(copies/μL)=標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度/標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子量×6×1014，其中，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子量=標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒堿基數(shù)×324。根據(jù)得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，將得到的未知樣本的Ct值代入線性方程即可計(jì)算出待測(cè)樣品中鴨疫里默氏菌的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同劑量鴨疫里默氏菌人工感染的死亡率

試驗(yàn)設(shè)置了2×106，2×107，2×108，2×109，2×1010，2×1011cfu/只 6個(gè)濃度梯度，記錄死亡情況，見表1。采用累計(jì)法(Reed-Muench法)計(jì)算LD50，死亡率每增加一個(gè)百分點(diǎn)，劑量對(duì)數(shù)增加：(11.301-10.301)/(86.667-46.667)=0.025，死亡率從46.67%增加到86.67%，劑量對(duì)數(shù)增加0.025×(50-46.667)=0.075，LogLD50=10.301+0.075=10.386，取反對(duì)數(shù)，LD50為2.432×1010。

表1 人工感染鴨疫里默氏菌劑量及死亡情況Table 1 The dose and mortality of Riemerella anatipestifer infection

2.2 鴨疫里默氏菌熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

2.2.1 熒光定量PCR產(chǎn)物檢測(cè) 經(jīng)瓊脂糖凝膠檢測(cè)，熒光定量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1A)和含有質(zhì)粒的菌液PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物(圖1B)，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物片段長度約163 bp(見圖1)。

圖1 16S rRNA基因片段PCR擴(kuò)增圖

2.2.2 熒光定量PCR熔解曲線、擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖2A可見，鴨疫里默氏菌16S rRNA基因的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒經(jīng)10倍梯度稀釋，定量PCR反應(yīng)后獲得的熔解曲線峰形單一，無雜峰；圖2B的擴(kuò)增曲線為S形，圖2C的標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合度(R2)為0.997，將標(biāo)準(zhǔn)品和樣本在同一試驗(yàn)中運(yùn)行，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=-3.319×LOG(X)+33.83。

圖2 鴨疫里默氏菌16S rRNA基因擴(kuò)增的熔解曲線(A)，擴(kuò)增曲線(B)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(C)Fig.2 Melting curve (A), Amplification curve (B) and standard curve (C) of Riemerella anatipestifer 16S rRNA gene

2.3 鴨疫里默氏菌在鴨組織中的分布規(guī)律

采用建立的熒光定量PCR方法，對(duì)鴨疫里默氏菌感染后1 d，2 d，3 d，5 d，9 d和14 d的脾臟，腦，心臟，肺臟，肝臟中的載菌量進(jìn)行了檢測(cè)，見表2。結(jié)果表明在人工感染后1 d，幾種組織中均有鴨疫里默氏菌定殖，在2 d時(shí)顯著增加，達(dá)高峰，3 d時(shí)細(xì)菌定殖量快速下降，但在心臟和腦中仍檢測(cè)到大量細(xì)菌定殖，5 d后細(xì)菌定殖大幅減少，在肺和肝中未檢測(cè)到，但在腦中仍有大量細(xì)菌定殖。

表2 鴨疫里默氏菌人工感染后不同組織中的載菌量Table 2 Amount of bacteria in tissues during Riemerella anatipestifer infection

3 討 論

目前已有較多鴨疫里默氏菌人工感染試驗(yàn)的報(bào)道，如，I型鴨疫里默氏桿菌菌株人工感染試驗(yàn)中，采用2×108cfu/只經(jīng)嗉囊和氣管注射感染途徑感染1周齡的雛鴨，成功建立了鴨疫里默氏菌人工感染模型[11]；用3×109cfu/只經(jīng)頸部皮下注射13日齡的天府肉鴨進(jìn)行人工感染試驗(yàn)[12]；用2×108cfu/只經(jīng)腿部皮下注射10日齡四川麻鴨，在接種后168 h內(nèi)發(fā)病率80%[13]。以上試驗(yàn)表明，由于鴨疫里默氏菌菌株、感染途徑、鴨的品種和日齡等的不同，感染劑量也不同，應(yīng)針對(duì)不同的菌株和試驗(yàn)動(dòng)物摸索適宜的感染劑量。因此，本文通過皮下注射，設(shè)置了鴨疫里默氏菌ATCC11845標(biāo)準(zhǔn)株的不同感染劑量感染30日齡高郵鴨試驗(yàn)，確立了鴨疫里默氏菌的LD50為2.432×1010cfu/只。為了達(dá)到好的感染效果，同時(shí)減少病死率，選擇1×109cfu/只為后續(xù)試驗(yàn)的人工感染劑量。

SYBRGreen I熒光定量PCR法以無需電泳，速度快、靈敏度高、特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、能定量等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于病原體檢測(cè)[14-16]。本試驗(yàn)中所設(shè)計(jì)引物經(jīng)PCR擴(kuò)增后可獲得單一的清晰條帶，經(jīng)測(cè)序和BLAST比對(duì)與相應(yīng)的目的基因的一致性達(dá)到100%，說明所設(shè)計(jì)的引物正確。實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增的熔解曲線可以看出，擴(kuò)增產(chǎn)物在熔解溫度上為一特異性的單峰，無其它雜峰，說明該引物的特異性強(qiáng)，可以準(zhǔn)確定量。擴(kuò)增曲線為“s”形，符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR的要求。一般認(rèn)為當(dāng)R2>0.98時(shí)，所建立的熒光定量反應(yīng)才更加可靠和穩(wěn)定[17]。本試驗(yàn)中16S rRNA基因的熒光定量PCR反應(yīng)相關(guān)系數(shù)為0.997，說明所建立的該基因的熒光定量PCR方法穩(wěn)定可靠。

已有研究表明，在自然感染的病例中，鴨心、肝、腦三種組織中荷載量由高到低依次為腦，心，肝[18]。本文對(duì)人工感染鴨疫里默氏菌后在組織中的分布情況做了分析，結(jié)果表明組織中的鴨疫里默氏菌載菌量由高到低依次為腦，心，脾，肺，肝，該結(jié)果與自然感染結(jié)果一致。進(jìn)一步對(duì)鴨疫里默氏菌感染的時(shí)間特征做了分析，表明鴨疫里默氏菌在幾種組織中均在感染后2 d達(dá)定殖高峰，這與臨床觀察的感染后2 d臨床癥狀最為嚴(yán)重相一致。在感染的1 d到14 d在腦中均可檢測(cè)到鴨疫里默氏菌，這與鴨疫里默氏菌感染可引起站立不穩(wěn)，頭頸震顫，角弓反張，抽搐等腦神經(jīng)癥狀相符，明確了鴨疫里默氏菌可以突破腦屏障，引起腦損傷。感染后5 d，鴨疫里默氏菌在脾臟，心，肺，肝中的載菌量很少或檢測(cè)不到，這說明在5 d時(shí)，由于機(jī)體的抗感染免疫作用，鴨疫里默氏菌大幅減少。