冀德君 ，張 威，許 靜，程 牧

(1.揚州大學 動物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.盱眙縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇 淮安 211700)

始豐微型牛是我國浙江省地方品種天臺黃牛的一個小型類群。天臺黃牛分布在浙江省臺州市天臺縣及其周邊地區(qū)，其出生時體型小，當?shù)厮追Q“小狗?！保瑢偃庖奂嬗眯偷牡胤教厣贩N。黃牛體型大小的形成與遺傳特性、生長激素軸、性軸等的調控有關[1]。生長相關激素調控是生長發(fā)育過程中必不可少的環(huán)節(jié)，通過細胞合成與分泌激素物質進入血液循環(huán)，在不同的組織發(fā)揮相應生理作用，從而對生長發(fā)育起調節(jié)作用。與體型大小形成最為密切相關的是骨骼的生長發(fā)育調控，涉及環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、甲狀旁腺素(PTH)和轉化生長因子β(TGF-β)等因子。cAMP具有調節(jié)神經(jīng)遞質合成，促進激素分泌的作用[2]。一些二級促激素促進次級激素合成是通過cAMP途徑調節(jié)的。cAMP能誘導GH的釋放，使代謝酶活性增強，從而促進肝臟內(nèi)蛋白質、DNA和RNA的合成[3]，并激活IGF1，促進機體的合成代謝、增殖骨骼生長和其他一些生物學的變化[4]，增快動物的生長速度。PTH是調節(jié)血鈣水平的最重要激素，它有升高血鈣和降低血磷含量的作用，其調節(jié)骨的合成、分解代謝，對骨形成和骨吸收具有雙重效應，持續(xù)大劑量PTH 促進骨吸收，間歇性小劑量PTH 促進骨形成。另一方面，PTH對靶器官的作用是通過cAMP系統(tǒng)而實現(xiàn)的。PTH對骨樣細胞細胞膜上的受體結合，活化腺苷酸環(huán)化酶，使細胞cAMP濃度增加。在PTH作用下細胞cAMP含量升高是成骨細胞的典型表現(xiàn)之一[5-7]。Bllow等[8]認為PTH 對鼠顱骨細胞的作用依賴于成骨母細胞分化的程度，PTH 刺激鼠顱骨細胞cAMP合成的高低與細胞的分化程度相一致。PTH刺激破骨細胞吸收骨基質釋放TGF-β1，釋放的TGF-β1促使骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞，從而增加骨形成[9]。TGF-β1在骨質中大量存在，并由破骨細胞激活和釋放，是骨生成的關鍵調節(jié)者，也是體型大小形成的重要基礎。

本研究在普通體型天臺黃牛和始豐微型牛群體中，對骨骼生長相關的cAMP等指標進行測定分析，以獲得始豐微型牛的基礎生理生化信息，并嘗試對始豐微型牛體型形成機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

本研究采用的微型牛和較大體型天臺黃牛來自浙江省天臺縣天臺黃牛保種場，選取13～16月齡的健康始豐微型牛9頭(♀6♂3)和較大體型天臺黃牛9頭(♀6 ♂3)。

1.2 樣品采集與處理

早上空腹(禁食一晚，不禁水)，每頭牛無菌頸靜脈采血5 mL，加EDTA 抗凝，4 000轉/min離心，取上清，4 ℃保存，及時轉移至實驗室檢測分析。

1.3 ELISA測定

針對生長發(fā)育相關因子cAMP、PTH和TGF-β，采用商用ELISA試劑盒(上海研瑾生物公司)進行測定。首先稀釋ELISA試劑盒內(nèi)各標準品，在酶標包被板上設定空白孔、標準孔和待測樣品孔，在標準品孔中準確加樣50 μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL，倍比稀釋后輕微振蕩，封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。然后洗滌5次，拍干。接著加入HRP酶標試劑50 μL，空白孔除外，重復溫育、洗滌步驟，最后加入底物溶液(TMB)50 μL，輕輕震蕩混勻，覆膜，37 ℃ 避光顯色15 min后，每孔加終止液50 μL，終止反應，酶標儀(Labsystems MultiskanMS-352，芬蘭)進行450 nm波長測量測定OD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

依據(jù)酶標儀測定數(shù)據(jù)，用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，用獨立樣本T檢驗進行統(tǒng)計分析不同體型組間三個指標的差異。

2 結果與分析

2.1 公牛不同體型間三個因子含量的比較

由圖1可知，微型牛組公牛TGF-β含量(185.9 ng/L)極顯著低于對照組(236.6 ng/L)(P<0.01)，cAMP含量(11.4 ng/L)顯著低于對照組(12.6 ng/L)(P<0.05)，甲狀旁腺素(PTH)含量兩組間差異不顯著(P>0.05)。說明促生長相關因子水平對公牛體型大小的形成有影響。

圖1 公牛不同體型間三個因子含量的比較*表示差異顯著(P<0.05), **表示差異極顯著(P<0.01)Fig.1 Comparison of blood biochemical indice between miniature and normal body size of bulls* represents significant difference(P<0.05),** represents extremely significant difference(P<0.01)

2.2 母牛不同體型間三個因子含量的比較

由圖2可見，微型牛組母牛TGF-β含量(195.9 ng/L)顯著低于對照組(226.0 ng/L)(P<0.05)，其cAMP含量(13.97 ng/L)和甲狀旁腺素(PTH)(209.23 ng/L)含量和對照組(cAMP 13.52 ng/L；PTH 191.47 ng/L)間差異不顯著(P>0.05)。說明雌激素等性別相關因素可能干擾促生長相關因子的水平，進而一定程度上影響了母牛生長發(fā)育。

圖2 母牛不同體型間三個因子含量的比較*表示二者差異顯著(P<0.05)Fig.2 Comparison of blood biochemical indice between miniature and normal body size of heifers* represents significant difference(P<0.05)

2.3 不分性別不同體型間三個因子含量的比較

不分性別微型牛組TGF-β含量(192.6 ng/L)極顯著低于對照組(229.5 ng/L)(P<0.01)(圖3)，其cAMP含量(13.1 ng/L)和甲狀旁腺素(PTH)(205.8 ng/L)含量和對照組(cAMP 13.2 ng/L；PTH 203.8 ng/L)間差異不顯著(P>0.05)。說明不同體型群體在遺傳上存在差異的TGF-β水平，可能是導致不同體型分化生長結果的起因。

圖3 不分性別下不同體型間三個因子含量比較**表示二者差異極顯著(P<0.01)Fig.3 Comparison of blood biochemical indice of different genders with different body size** represents extremely significant difference(P<0.01)

3 討 論

正常的生理生化指標，既能反映動物體內(nèi)實質與外表性能之間的關系，也能反映品種、性別、年齡、地區(qū)、不同外界環(huán)境及不同生理狀況的特征[10]，有必要將血液生理生化指標的變化與生態(tài)環(huán)境、生產(chǎn)性能充分結合開展研究。甲狀旁腺激素(PTH)主要的作用是維持血鈣平衡，而血鈣濃度反過來又可以調節(jié) PTH 的分泌，在組織中表達使得cAMP含量升高。另外，PTH 也可以通過調節(jié)骨生長因子(如 IGF-1)和生長因子抑制劑等來間接地調節(jié)骨的生長，如 PTH 可以通過誘導 IGF-1 與成骨細胞結合達到促骨形成的作用[11-12]，其中cAMP是細胞內(nèi)參與調節(jié)物質代謝和生物學功能的重要物質，是生命信息傳遞的“第二信使”。甲狀旁腺素(PTH)是由甲狀腺主細胞分泌的一種84肽激素[13]，是調節(jié)鈣、磷代謝的主要生物活性物質，可促進骨鈣代謝、小腸對鈣的吸收[14]及遠曲小管對鈣的重吸收，使血鈣升高，同時抑制近曲小管對磷和碳酸氫鈉的重吸收，使尿磷排出量增多，血磷下降。其分泌量增加，會使血鈣濃度上升，從而促進骨形成和骨吸收，完成增加骨量[15-16]。Ferrari等[17]認為，β-Arrestins可能通過限制PTH誘導破骨細胞生成，限定了間歇性的PTH對骨骼的活性；另一方面，Arrestins可激活磷酸二酯酶，促進cAMP的降解，通過cAMP/PKA調節(jié)PTH成骨作用。TGF-β在機體生長發(fā)育中起著重要作用，可以調節(jié)成骨細胞的增殖和分化以及破骨細胞的活性。而PTH則通過PKC通路調控TGF-β1的表達以及通過PKA通路調控TGF-β2的表達[18]，PTH刺激破骨細胞吸收骨基質釋放TGF-β1，釋放的TGF-β1促使骨髓間充質干細胞分化為成骨細胞，從而增加骨形成[19]。PTH-Smad3通過抗凋亡作用來擴大TGF-β對成骨細胞的合成代謝效應，提示TGF-β 信號與PTH信號存在相互作用[20]。

本文研究的始豐微型牛，系經(jīng)長期自然選擇和人工選育而形成的山地型小個體黃牛，是一個肉役兼用型地方品種。通過研究始豐微型牛的三項生化指標環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、甲狀旁腺素(PTH)、與轉化生長因子β(TGF-β)，并對其進行分組比較分析，發(fā)現(xiàn)轉化生長因子β(TGF-β)在微型牛和正常體型黃牛間存在顯著差異，結果說明了TGF-β在體型形成中發(fā)揮著重要影響。由于本研究只涉及單個牛品種且樣本量較小，因此結果不能完全反映三個指標在不同體型群體中的實際差異情況，特別是cAMP和PTH，很可能存在性激素和營養(yǎng)、環(huán)境等因素的干擾，使得cAMP和PTH在遺傳上的差異不能體現(xiàn)?？傮w而言，始豐微型牛的體型和早期低水平促生長相關激素有直接關系，深入研究將會揭示始豐微型牛生長受阻的具體機制，為進一步的深入研究揭示始豐微型牛的生物學特性提供基礎數(shù)據(jù)及背景資料。

4 結 論

本研究結果表明，TGF-β在微型牛體型形成中發(fā)揮著重要影響，cAMP含量在公母牛上的影響有差異。