鄭志慧，曾凡一，秦國文，黃秀秀，李梓良，李彥靈

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003)

女貞樹(LigustrumlucidumAit.)是木犀科植物，分布于華東、華南、西南及華中各地，其藥用歷史有2 000多年。女貞果實在《神農(nóng)本草經(jīng)》中首次提及，謂其可以祛除百病，其味甘、苦，性涼，歸肝、腎經(jīng)，具有滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的效果，被稱為養(yǎng)生佳品。明代醫(yī)藥學(xué)家李時珍謂其“果實強(qiáng)陰健腰膝，烏發(fā)，明目”[1]。女貞果實主要用來治療慢性氣管炎[2]、肝癌[3]、高血脂癥[4]、糖尿病[5]、骨質(zhì)酥松[6]、更年期綜合征、不孕癥、動脈粥樣硬化等，近年來成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

女貞含有豐富的三萜類化合物，其次黃酮的含量也十分豐富。黃酮類化合物具有較好的抗炎、抗腫瘤等藥理活性[7-8]，此外黃酮類化合物還具有一定的成骨作用[9]，同時某些黃酮類化合物正在臨床試驗用于丙型肝炎的治療。女貞的化學(xué)成分較為復(fù)雜，其質(zhì)量評價是通過多種成分的含量測定來進(jìn)行綜合評價，黃酮類化合物是女貞質(zhì)量鑒別的標(biāo)志物之一[10]。

近年來，通過對女貞不同部位化學(xué)活性成分的提取工藝進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境包括采摘時間、提取溫度等，都對女貞化學(xué)成分有著顯著的影響。故本實驗以女貞總黃酮作為檢測標(biāo)準(zhǔn)，通過比較不同時段、不同部位采摘的女貞總黃酮含量變化，為女貞以后的藥用研究提供實驗依據(jù)；在靜態(tài)工藝的篩選方法上，采用大孔樹脂吸附分離技術(shù)，對女貞果實總黃酮的純化工藝進(jìn)行研究，為女貞果實總黃酮的分離純化提供實驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

女貞子藥材采于新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院內(nèi)(2018年7月-2019年2月，共13份樣品)，由本校中藥教研室李彥靈老師鑒定為木犀科植物女貞的干燥成熟果實；蘆丁對照片(中國食品藥品檢定研究院，10080-201408)；D-101大孔樹脂(濟(jì)寧宏明化學(xué)試劑有限公司)；無水乙醇等所用試劑均為分析純。

T6新世紀(jì)型號紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；XFB-500型高速中藥粉碎機(jī)(中國吉首市中誠制藥機(jī)械廠)；FA2004型電子天平(d=0.1mg，批號：14D101-1000，上海良平儀器儀表有限公司)；DT5-2型低速離心機(jī)(北京時代北利離心機(jī)公司)；KQ5200型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHZ-3循環(huán)水式多用真空泵(鄭州杜普儀器廠)。

1.2 女貞黃酮含量的測定

1.2.1 黃酮提取工藝 將每個時段的女貞子洗干凈自然風(fēng)干，至恒重，用粉碎機(jī)粉碎成粉末，密封保存貼上標(biāo)簽備用。精密稱取1.000 g女貞子，放在100 mL燒杯中，加入70 mL 50%乙醇，浸泡30 min，60 ℃超聲處理1 h，對所得浸提液進(jìn)行離心，3 000 r/min，離心6 min，分離后，將上層清液轉(zhuǎn)移到合適容量瓶中，用50%乙醇補(bǔ)足體積[11]，將1 mL溶液精確轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用于顯色、定容并測得吸光度，進(jìn)而求得總黃酮的含量。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取蘆丁對照品0.100 g，溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，然后用無水甲醇定容至刻度線，搖勻，將5.00 mL溶液轉(zhuǎn)移到一個50 mL容量瓶中，用無水甲醇補(bǔ)足體積，搖勻，此蘆丁對照品溶液為0.1 mg/mL。精密移取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL溶液分別放置在6個大小相同的25 mL的容量瓶中，加入50%乙醇溶液至6 mL，加入5%亞硝酸鈉1 mL，搖勻，放置6 min，加入10%的硝酸鋁1 mL，搖勻放置6 min，加1.0%的氫氧化鈉10.0 mL，再用50%的乙醇定容，搖勻，靜止15 min后，以空白溶液為基準(zhǔn)，在510 nm處測吸收度，得回歸方程[12-13]，結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 女貞總黃酮率測定 根據(jù)“1.2.2”項下得到的回歸方程計算總黃酮得率[14-15]。

2 方法學(xué)考察

在女貞中總黃酮含量測定方法建立后，從精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性方面進(jìn)行方法學(xué)考察。

3 女貞子總黃酮的純化

3.1 供試品的制備

取10 g女貞子，制成粗粉末，加入100 mL 50%乙醇，浸泡30 min，超聲處理1 h，對所得試液進(jìn)行抽濾，取殘渣重復(fù)上步操作。合并兩次濾液，濃縮至浸膏，以水分散至100 mg/mL。

3.2 大孔樹脂預(yù)處理

取一定量D101樹脂，浸泡在95%乙醇中24 h，后除去漂浮的樹脂與肉眼可見的絮狀物。濕法裝柱，分別用95%乙醇和水進(jìn)行洗脫，洗至流出液無色并無異味為止。水洗至無醇味，用5% HCl溶液與 2% NaOH溶液分別浸泡樹脂2 h，水洗至中性[16-17]。

3.3 黃酮的純化

取8 g樹脂(濕重)裝柱，加入黃酮提取液10 mL濕法裝柱，靜置1 h，分別以蒸餾水、30%乙醇、70%乙醇各50 mL洗脫。取70%洗脫部位，回收至浸膏，轉(zhuǎn)移至干燥蒸發(fā)皿中。在105 ℃下干燥3 h，冷卻0.5h后迅速稱定質(zhì)量[18-19]。將稱定后的提取物溶于50%乙醇中，定容至100 mL容量瓶中，并準(zhǔn)確移取4 mL于50 mL容量瓶中測量吸光度。然后量取20 mL“1.3.1”項下樣品液，蒸發(fā)至恒重。50%乙醇溶解，稀釋至100 mL容量瓶定容，取4 mL于50 mL容量瓶中測定吸光度，計算理論中黃酮類化合物的含量[20-21]。

4 結(jié)果分析

4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以蘆丁質(zhì)量濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，測得回歸方程：y=0.0296x+0.1197，相關(guān)系數(shù)R2=0.9999，結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在0～20 μg /mL范圍內(nèi)有良好線性關(guān)系。

4.2 方法學(xué)考察

4.2.1 精密度試驗 準(zhǔn)確吸取1 mL供試液并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，空白對照未添加樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線“加入50%乙醇溶液至6 mL”開始操作，在重復(fù)5次測定后，計算出總黃酮的RSD=1.38%，表明儀器精密度良好。試驗結(jié)果見表1。

表1 女貞子總黃酮含量測定精密度試驗結(jié)果

4.2.2 穩(wěn)定性試驗 準(zhǔn)確吸取1 mL供試液并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，空白對照未添加樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線“加入50%乙醇溶液至6 mL”開始操作測量，分別在0 min、30 min、60 min、90 min，4個時間段測定，計算結(jié)果顯示穩(wěn)定性的RSD=1.35%。表明樣品在90 min內(nèi)穩(wěn)定性良好，穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表2。

表2 女貞子總黃酮含量測定穩(wěn)定性試驗結(jié)果

4.2.3 重復(fù)性試驗 準(zhǔn)確吸取1 mL供試液并轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，空白對照未添加樣品溶液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線“加入50%乙醇溶液至6 mL”開始操作。重復(fù)6次操作，結(jié)果顯示女貞子總黃酮的質(zhì)量濃度為RSD= 3.13%，表明所用實驗方法重復(fù)性良好。重復(fù)性試驗結(jié)果見表3。

表3 女貞子總黃酮含量測定重復(fù)性試驗結(jié)果

4.3 女貞不同部位總黃酮含量

將2018年7月-2019年2月采摘的共20個樣品的女貞子果實及葉子進(jìn)行風(fēng)干、粉碎和醇提取，測得總黃酮含量，分別平行測定3次，計算總黃酮含量，結(jié)果見表4、圖2。

表4 不同部位女貞中總黃酮含量 (mg/g)

圖2 不同部位女貞中總黃酮含量對比

4.4 純化測定結(jié)果

對大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理，裝樣洗脫，取 70% 洗脫部位，回收至浸膏。對女貞子總黃酮的純化率和轉(zhuǎn)移率進(jìn)行3次平行測定和計算，結(jié)果見表5。

表5 女貞子總黃酮純化結(jié)果

5 討論

本研究顯示，女貞子在8月中旬采摘總黃酮含量達(dá)到最大值44.77 mg/g；女貞葉在次年1月初期采摘總黃酮含量達(dá)到最大值44.11 mg/g，含量總體相差不大。普遍認(rèn)為女貞子采收期在12月份左右(果實呈紫黑色)，但從實驗結(jié)果來看，此階段總黃酮含量并不高，圖2顯示女貞子在8月末至9月初及次年的1至2月左右總黃酮活性成分含量達(dá)到最高，從8、9月之后，隨著氣溫降低，10月初至次年1月初女貞子中總黃酮含量呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，但次年1、2月含量卻陡然升高。但從圖2中發(fā)現(xiàn)，女貞葉與女貞子中總黃酮的含量分布規(guī)律與以上相反，其中8月初和次年1月初含量較高，8月末到11月末期間雖然有幾次小范圍的波動，但總體含量相對8月和次年1月含量較低。對比女貞子葉與女貞果實中的總黃酮含量，兩者的含量波動同樣劇烈，但兩者并沒有表現(xiàn)出較強(qiáng)的相關(guān)性。

女貞子總黃酮純化實驗結(jié)果表明，D101型大孔樹脂具有較好的吸附性能，純化后黃酮的純度為74.05%，轉(zhuǎn)移率為63.81%，表明所用實驗方法穩(wěn)定可行，有較高的參考價值。