王 穎，許 麗，吳海洋，李良勇

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院 腦病科，安徽 合肥 230000；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)，安徽 合肥 230000；3.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 腦病科，安徽 合肥 230000)

隨著社會(huì)的發(fā)展及人口老齡化，腦卒中作為一種常見(jiàn)的腦血管疾病，其發(fā)生率、致殘率及病死率正逐年升高。據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告顯示，腦卒中是在世界范圍內(nèi)的第3位死亡原因，僅次于冠心病和癌癥，在我國(guó)目前是致殘率第一、致死率第二的高發(fā)疾病，嚴(yán)重影響患者的身心健康[1]。研究表明[2]，在腦卒中眾多的并發(fā)癥中，卒中相關(guān)性肺炎為最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致卒中患者死亡的主要原因，其占7%～22%[3]。卒中相關(guān)性肺炎(stroke-associated pneumonia，SAP)的概念由Hilker[4]在2003年首次提出。目前關(guān)于SAP的發(fā)生機(jī)制尚不明確，其發(fā)病可能與卒中后免疫抑制狀態(tài)、細(xì)菌種植、吞咽功能障礙等因素密切相關(guān)[5]。且SAP相關(guān)的危險(xiǎn)因素有高齡、吞咽困難、神經(jīng)功能缺損及合并的一些慢性疾病，如慢阻肺、糖尿病等，這些危險(xiǎn)因素都會(huì)引起SAP的發(fā)生和加劇病情的發(fā)展。目前關(guān)于SAP的西醫(yī)治療主要以使用抗生素為主，但長(zhǎng)期使用容易引起耐藥菌的產(chǎn)生、機(jī)體菌群失調(diào)等不良后果。因此，如何發(fā)揮中醫(yī)藥特色治療卒中相關(guān)性肺炎是本課題研究的重點(diǎn)，本研究擬通過(guò)針刺結(jié)合中藥對(duì)SAP大鼠干預(yù)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究，為卒中相關(guān)性肺炎的臨床治療提供依據(jù)和思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取健康成年雄性SD大鼠120只，鼠齡10～12周，體重約250～280 g，大鼠均由安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：svxi-[(皖)2011-007]。所有大鼠均采用統(tǒng)一飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度控制在24～28 ℃之間，濕度在50%～60%，飲用滅菌自來(lái)水，房間要保持干凈、通風(fēng)，定時(shí)清理鼠籠。實(shí)驗(yàn)在安徽中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

頑痰湯藥液：陳皮、姜半夏、老鸛草、桃仁、碧桃干、全瓜蔞、苦杏仁、佛耳草、生地、川芎、炙甘草各10 g(頑痰湯為安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院腦病一科治療肺部感染的經(jīng)驗(yàn)方)。以上中藥飲片的提供來(lái)自安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院中草藥房。

藥液制備：將所有藥物飲片放入鍋內(nèi)，加足量水浸過(guò)藥物，充分浸泡30 min后煎煮3次，濾出藥液，合并藥液后用水煎醇沉法制備原方提取液，濃縮藥液至含生藥0.82 g/mL，分裝后放置4 ℃冰箱中貯存?zhèn)溆?，給藥劑量參照標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物的體表面積等效劑量折算系數(shù)法[6]算出大鼠灌胃等效計(jì)量為：8.2 g·kg-1·d-1，中藥組按46.0 g·kg-1·d-1的濃度灌胃。

1.3 主要實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、MH(A)、MH(B)培養(yǎng)基購(gòu)自蘇州北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；腫瘤壞死因子TNF-α、白細(xì)胞介素IL-18酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒購(gòu)自武漢基因美科技有限公司；移液器購(gòu)自eppendorf公司；電熱恒溫箱購(gòu)自上海三發(fā)；離心機(jī)購(gòu)自安徽嘉文；電子天平購(gòu)自梅特勒-托利多儀器上海有限公司；一次性針刺毫針(0.25 mm×30 mm)購(gòu)自蘇州天協(xié)針灸器械有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組

選取健康雄性SD大鼠120只，隨機(jī)分為6組，即空白對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組、針刺組、中藥組、針刺結(jié)合中藥組，每組各20只，空白對(duì)照組不作任何處理，假手術(shù)組只暴露頸總動(dòng)脈，不阻斷血管，其他4組參照改良線(xiàn)栓法結(jié)合滴鼻法[7]接種0.2 mL金黃色葡萄球菌菌液制備SAP模型。

2.2 菌液配制

以0.9%生理鹽水配取菌懸液，用比濁儀將菌液濃度調(diào)節(jié)至1.0×108CFU/mL，并置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 制備SAP模型

2.3.1 腦卒中模型的制備和評(píng)價(jià) 采用參考文獻(xiàn)[8]中的線(xiàn)栓法建立大鼠的腦卒中模型。制備后采用Longa5分法[9]對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)損傷癥狀；1分：對(duì)側(cè)的前爪不能完全伸展；2分：向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；3分：向?qū)?cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，沒(méi)有意識(shí)；5分：死亡。評(píng)分在2～3分為腦卒中模型建立成功。

2.3.2 肺炎模型的制備 采用10%的水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔麻醉腦卒中模型成功的大鼠，將其以頭仰立位姿勢(shì)固定，經(jīng)左側(cè)鼻腔逐滴緩慢滴入0.2 mL已配好的濃度為1×108cfu/mL金黃色葡萄球菌菌懸液(冰浴保存)，立即豎起大鼠，并將頭部向上垂直左右旋轉(zhuǎn)30 s，使菌液均勻分布于兩肺[10]。

2.3.3 腦卒中感染肺炎后的評(píng)價(jià) 感染72 h后觀察大鼠出現(xiàn)精神狀態(tài)差、進(jìn)食減少、毛色灰暗、背部弓起、耳緣靜脈突起加粗，且呼吸急促，鼻唇部分泌液增多等癥狀。符合以上表現(xiàn)的大鼠則認(rèn)為卒中相關(guān)性肺炎造模成功，不符合的將棄用。最終模型組和中藥組各有1只死亡，針刺組有2只死亡。

2.4 治療方法

將造模成功后的4組大鼠，稱(chēng)取體重并記錄?？瞻讓?duì)照組、假手術(shù)組、模型組不進(jìn)行干預(yù)，同等條件下常規(guī)喂養(yǎng)。中藥組采用46.0 g·kg-1·d-1的劑量于每日上午9時(shí)左右進(jìn)行灌胃(給藥前將藥液加溫至38 ℃左右)。針刺組自由飲水飲食，選取雙側(cè)大椎、列缺、尺澤、豐隆、太溪、足三里穴，穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]，皮膚和針具常規(guī)消毒，采用一次性0.25 mm×30 mm的毫針，選定穴位后快速進(jìn)針，每次留針30 min，隔15 min行針1次，1次/天。針刺結(jié)合中藥組分別在針刺后予以中藥灌胃，方法同針刺和中藥組，每組連續(xù)治療7天。

2.5 標(biāo)本采集及檢測(cè)方法

2.5.1 腫瘤壞死因子TNF-α、白細(xì)胞介素IL-18的檢測(cè) 治療7天后，禁食12 h，腹腔麻醉大鼠，將其以仰臥位固定在操作臺(tái)，剖腹，暴露腹主動(dòng)脈，采用10 mL一次性注射器抽取動(dòng)脈血8～10 mL，立即注入非抗凝采血管內(nèi)，編號(hào)，在室溫下靜置2 h后離心(3 000 r/min)15 min，分離出血清并分裝保存在-20 ℃低溫冰箱待測(cè)。方法：按照TNF-α、IL-18 ELISA試劑盒的說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中TNF-α、IL-18炎性細(xì)胞因子水平。

2.5.2 肺組織含水量(濕重/干重)的測(cè)定 采血后開(kāi)胸迅速取大鼠肺組織，用生理鹽水洗去殘血后分離出左右肺組織，右肺中葉用于測(cè)定肺組織含水量，將左肺大葉置于液氮罐中凍存待測(cè)MPO活性。方法：將切除的右肺中葉用濾紙吸干水后置于電子天平稱(chēng)濕重(W)，隨后置于真空干燥箱內(nèi)烘烤24 h后稱(chēng)干重(D)，采用W/D比值表示肺組織含水量。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS21. 0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析，兩兩均數(shù)間比較用SNK-q檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠的一般狀態(tài)

干預(yù)7天后，空白對(duì)照組和假手術(shù)組的大鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)靈敏，毛發(fā)光澤，飲食正常，無(wú)明顯鼻周分泌物，呼吸平穩(wěn)，大便質(zhì)軟；模型組大鼠出現(xiàn)動(dòng)作緩慢、飲食減少，毛發(fā)干枯凌亂、鼻周見(jiàn)大量分泌物、呼吸喘促、大便質(zhì)干。針刺組大鼠輕度萎靡，缺乏活力，飲食較少，鼻周見(jiàn)較多分泌物；中藥組大鼠狀態(tài)尚可，行動(dòng)、飲食增加，無(wú)明顯毛發(fā)干枯、鼻周見(jiàn)少量分泌物；針刺結(jié)合中藥組大鼠精神狀態(tài)良好，活動(dòng)、飲食明顯增加，無(wú)毛發(fā)干枯，未見(jiàn)鼻周分泌物，呼吸平穩(wěn)，大便質(zhì)軟。

3.2 各組大鼠TNF-α、IL-18水平比較

干預(yù)7天后，與空白對(duì)照組比較，假手術(shù)組TNF-α、IL-18水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組TNF-α、IL-18水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，針刺組、中藥組、針刺結(jié)合中藥組TNF-α、IL-18水平均降低(P<0. 05)，但都高于空白對(duì)照組(P<0. 05)。與針刺組比較，中藥組TNF-α、IL-18水平差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)，針刺結(jié)合中藥組差異顯著(P<0. 01)。與中藥組比較，針刺結(jié)合中藥組TNF-α、IL-18水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。見(jiàn)表1。

表1 各組治療后血清中TNF-α、IL-18炎癥因子水平比較

3.3 各組大鼠肺組織含水量(濕重/干重)比較

干預(yù)7天后，與空白對(duì)照組比較，假手術(shù)組W/D比值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；模型組W/D比值顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，針刺組、中藥組、針刺結(jié)合中藥組W/D比值均降低(P<0. 05)，尤其針刺結(jié)合中藥組W/D比值顯著降低(P<0.01)。與針刺組比較，中藥組W/D比值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)，針刺結(jié)合中藥組差異顯著(P<0. 01)。與中藥組比較，針刺結(jié)合中藥組W/D比值降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0. 05)。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠治療后肺組織含水量(W/D)的比較

4 討論

目前SAP的發(fā)病機(jī)制尚不明確，Meisel等[12]提出了中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷誘導(dǎo)的免疫抑制綜合征(SIDS)，認(rèn)為其可能是SAP發(fā)病的主要機(jī)制。腦卒中后發(fā)生的炎癥反應(yīng)能清除壞死細(xì)胞以及促進(jìn)組織愈合，但炎癥反應(yīng)的過(guò)度能引起繼發(fā)性損害，SIDS不但能抑制炎癥反應(yīng)，降低對(duì)腦組織的保護(hù)，還能降低機(jī)體對(duì)病原菌的抵抗力，進(jìn)一步增加肺部感染的發(fā)生率[13]。TNF-α為一種多肽類(lèi)細(xì)胞因子，由單核巨噬細(xì)胞分泌，在各種致炎因素的刺激或者機(jī)體處于應(yīng)激狀態(tài)下，TNF-α在炎癥早期可大量釋放，促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生各種促炎因子，進(jìn)一步加重炎癥，從而對(duì)機(jī)體造成損傷[14]。IL-18是新近發(fā)現(xiàn)的具有多效能的炎癥細(xì)胞因子，可作為前炎癥因子誘導(dǎo)其他炎癥介質(zhì)的釋放，促進(jìn)T細(xì)胞增值及中性粒細(xì)胞的活化[15]。有研究證明[16]，IL-18能使白細(xì)胞在肺循環(huán)發(fā)生黏附聚集，引起TNF-α等炎性細(xì)胞因子釋放，造成大鼠肺部炎癥損傷并導(dǎo)致呼吸功能下降。

腦卒中早期易引起肺損傷，肺組織會(huì)出現(xiàn)肺泡結(jié)構(gòu)變化、水腫及炎性浸潤(rùn)等典型病理特征[17]。本研究通過(guò)改良線(xiàn)栓法結(jié)合滴鼻法建立SAP模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肺組織出現(xiàn)腫脹、彌漫性充血、出血等符合肺組織損傷的表現(xiàn)，通過(guò)測(cè)定大鼠肺組織W/D值以及血清中的TNF-α、IL-18炎癥因子水平，發(fā)現(xiàn)呈不同程度的升高，進(jìn)一步表明肺組織出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，由此認(rèn)為SAP模型制備成功。在針刺、中藥治療后，結(jié)果顯示，與模型組對(duì)比，各干預(yù)治療組大鼠的一般狀態(tài)均有一定的改善，其中W/D值、TNF-α、IL-18水平均呈現(xiàn)不同程度的降低，說(shuō)明針刺以及中藥干預(yù)可以有效減輕肺間質(zhì)水腫和改善肺部炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)肺功能的恢復(fù)。

SAP在中醫(yī)學(xué)可歸屬于“咳嗽”“喘證”等范疇，其病理因素多為痰、虛，病因病機(jī)多為中風(fēng)后機(jī)體陰陽(yáng)失調(diào)，脾胃虛弱，氣化不利，導(dǎo)致痰濕內(nèi)生，易停留肺，使肺氣不宣，而致咳嗽，且痰濕郁肺日久可化為痰火，痰熱內(nèi)擾，壅阻于肺，則出現(xiàn)咳嗽、痰黃質(zhì)稠等癥狀，演變成痰熱郁肺之證[18]，故治療上采用清熱化痰之法，且肺與大腸相表里，肺氣不宣，則腑氣不通，出現(xiàn)大便秘結(jié)；中風(fēng)后多伴有肢體活動(dòng)不利，日久則氣虛血瘀，治療上要兼顧行氣活血通絡(luò)、潤(rùn)腸通便。目前有研究證實(shí)[19]，葦莖湯合麻杏石甘湯能明顯改善SAP痰熱蘊(yùn)肺證患者的炎癥損傷、心肺功能，提高其免疫功能。本研究采用自擬方頑痰湯治療SAP，此方由陳皮、姜半夏、老鸛草、桃仁、碧桃干、全瓜蔞、苦杏仁、佛耳草、生地、川芎、炙甘草組成，其中陳皮、姜半夏相互配伍共達(dá)健脾燥濕化痰之效；老鸛草祛風(fēng)通絡(luò)、活血化瘀；桃仁活血化瘀、止咳平喘，碧桃干、川芎與桃仁配伍加強(qiáng)活血止痛之效；全瓜蔞清熱滌痰、潤(rùn)燥滑腸；苦杏仁與佛耳草配伍止咳平喘之效更佳；生地滋陰清熱涼血；炙甘草補(bǔ)脾和胃、止咳平喘，諸藥合用，共奏清熱化痰、行氣活血通絡(luò)、潤(rùn)腸通便之效。此次結(jié)果顯示，與模型組和針刺組比較，中藥組W/D值、TNF-α、IL-18水平呈現(xiàn)不同程度的降低(P>0.05)，尤其針刺結(jié)合中藥組降低顯著(P<0.01)，說(shuō)明頑痰湯能有效減輕肺組織炎癥損傷。

針刺療法以經(jīng)絡(luò)腧穴為理論依據(jù)，有疏通經(jīng)絡(luò)，調(diào)節(jié)氣血，平衡陰陽(yáng)之用。研究[20]證實(shí)，將肺俞、合谷、列缺作為主穴的針刺療法治療SAP有顯著的臨床效果。本研究選取大椎、列缺、尺澤、足三里、豐隆、太溪穴為針刺治療穴位。大椎屬督脈穴，解表泄熱、通督行氣；列缺為手太陰肺經(jīng)的絡(luò)穴，解表宣肺、通經(jīng)活絡(luò)；尺澤為肺經(jīng)的合穴，清解肺熱；足三里為足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴，調(diào)理氣血、祛邪扶正；豐隆屬足陽(yáng)明胃經(jīng)，為治痰要穴，加強(qiáng)祛痰之效；太溪為足少陰腎經(jīng)的原穴，滋陰益腎，以上穴位相互配伍以達(dá)清熱燥濕化痰、通經(jīng)活絡(luò)之效。此次結(jié)果顯示，與模型組比較，針刺組的W/D值、TNF-α、IL-18水平均呈現(xiàn)不同程度的降低(P<0.05)，說(shuō)明針刺治療可以有效改善SAP大鼠的肺損傷。李俠等[21]研究發(fā)現(xiàn)，針刺結(jié)合瀉肺化痰方對(duì)改善SAP患者的臨床癥狀及促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)有相對(duì)的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)，針刺結(jié)合中藥組與其余各干預(yù)組比較差異顯著(P<0.05)，說(shuō)明針刺結(jié)合中藥療效優(yōu)于單用針刺或中藥治療，能有效減輕SAP大鼠的肺組織炎癥反應(yīng)。

綜上所述，針刺結(jié)合中藥治療卒中相關(guān)性肺炎大鼠有一定療效，可以有效改善肺組織水腫、降低肺組織的TNF-α、IL-18炎性細(xì)胞因子水平，這可能為其減輕SAP肺組織損傷的機(jī)制之一，并且能為臨床上治療卒中相關(guān)性肺炎提供依據(jù)和優(yōu)化方案。