張 睿，陳瑞妮，李 偉

(1.江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)院·整合醫(yī)學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)學(xué)院·中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，江蘇 南京 210023)

芹菜素(4′，5，7-三羥基黃酮；apigenin，API)又稱芹黃素、洋芹素，是天然存在的黃酮類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜(如芹菜)、茶葉和香料中[1]。許多中藥中含有大量芹菜素，如藜蘆、紫蘇、虎杖、蕪花、半枝蓮、仙鶴草等[2]。大量實(shí)驗(yàn)研究表明，芹菜素具有抗炎、抗癌、抗氧化、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌等多方面的生物活性[3]。芹菜素對(duì)多種人類腫瘤細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，包括乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等[4]。研究證實(shí)，芹菜素通過誘導(dǎo)凋亡及誘導(dǎo)周期阻滯于G2/M期而抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[5]。即便是在有氧環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞仍然偏好通過糖酵解途徑提供能量并生成乳酸，但芹菜素對(duì)人肝癌細(xì)胞糖酵解的作用研究較少。

本研究選用人肝癌HepG2細(xì)胞[6]，體外研究芹菜素對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、糖酵解及相關(guān)蛋白的作用，探討其作用機(jī)制，再利用裸小鼠移植瘤模型考察芹菜素的體內(nèi)作用。本研究針對(duì)芹菜素對(duì)人肝癌細(xì)胞糖酵解的影響及可能的機(jī)制進(jìn)行探究，從而驗(yàn)證芹菜素抗腫瘤活性，也為中醫(yī)臨床腫瘤防治時(shí)芹菜素的應(yīng)用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥物

芹菜素(Apigenin)，純度≥97%，購自美國Sigma公司。實(shí)驗(yàn)前，芹菜素用DMSO溶解，培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，DMSO終濃度≤0.1%。

1.2 動(dòng)物與細(xì)胞

SPF級(jí)BALB/c小鼠，購自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK(蘇)2011-0003)。日齡：35～40 d；體重：18～22 g；性別：雄性。

人肝癌HepG2細(xì)胞，購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)細(xì)胞庫。細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3 試劑

溴脫氧尿核苷(BrdU)購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；葡萄糖攝取檢測(cè)試劑盒購自Invitrogen公司；乳酸生成檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技有限公司；PDHK1、HKⅡ、LDHA、HIF-1α購自美國Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體購自武漢Boster公司；IRDyeTM800 Conjugated anti-mouse/rabbit second antibody購于美國 Rockland公司；蘇木素購自碧云天公司；免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Annexin V-FITC/PI 雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒：購自南京凱基生物公司。

1.4 儀器

HERA cell 150i CO2培養(yǎng)箱、MSC-Advantage 1.2生物安全柜(美國Thermo electron公司)；DFC450 C型倒置顯微鏡(德國Leica公司)；Centrifuge 5415R型冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)；MATRIX Cell Mate II型精密移液器(美國Thermo公司)；FV10-MCPSU型激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus)；Mini-PROTEAN 3型電泳裝置(美國Bio-Rad公司)。

1.5 方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌細(xì)胞HepG2以適量濃度接種于培養(yǎng)瓶中，加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃恒溫及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：37 ℃，20%O2，5% CO2和75% N2。細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)。每2～3 d傳代一次，傳代時(shí)用0.02% EDTA，0.25% 胰酶消化2～3 min，棄去消化液，加入新培養(yǎng)液吹打均勻，按所需細(xì)胞量移入新培養(yǎng)瓶，添加完全培養(yǎng)液至適量。

1.5.2 檢測(cè)摻入BrdU的細(xì)胞比例 將HepG2細(xì)胞種入使用100 μg· L-1多聚賴氨酸包被過的蓋玻片于6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，待到細(xì)胞長(zhǎng)到70%～80% 時(shí)分別給予不同濃度的芹菜素或等體積的DMSO，使終濃度為2，4，8 μmol·L-1。培養(yǎng)24 h后將BrdU加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，終質(zhì)量濃度是30 mg·L-1，繼續(xù)培養(yǎng)30 min后，進(jìn)行抗BrdU免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下隨機(jī)拍攝上下左右中共5個(gè)視野。結(jié)果以BrdU+細(xì)胞百分比衡量。BrdU陽性細(xì)胞比= BrdU陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%，對(duì)照組定義為100%，取這5個(gè)視野中的平均值統(tǒng)計(jì)分析。

1.5.3 Annexin V-FITC/PI雙染 在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸(PS)只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸(PS)由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。AnnexinV是一種分子量為35～36 kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此，Annexin V被作為檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V進(jìn)行熒光素(EGFP、FITC)標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此，將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開來。人肝癌HepG2細(xì)胞接種于6孔板中，密度為1×105個(gè)/mL。芹菜素處理后，分別置于常氧/缺氧條件下培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，洗滌。將上述細(xì)胞懸液離心棄上清，依Annexin-V/PI雙染試劑盒操作：將細(xì)胞數(shù)調(diào)整到(2～5)×105個(gè)/mL，用結(jié)合緩沖液500 μL 中重新懸浮細(xì)胞，加入5 μL Annexin-V染液，混勻并離心，再加入5 μL PI染液，混勻并離心，避光孵育15 min，于流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5.4 分析細(xì)胞糖酵解水平及相關(guān)蛋白表達(dá) HepG2細(xì)胞經(jīng)終濃度為20、40、80 μmol/L的芹菜素或等體積DMSO處理24 h，收集細(xì)胞后，用葡萄糖攝取檢測(cè)試劑盒和乳酸生成檢測(cè)試劑盒分析HepG2細(xì)胞中糖酵解水平。HepG2細(xì)胞經(jīng)終濃度為20、40、80 μmol/L的芹菜素或等體積DMSO處理24 h，收集細(xì)胞并提取蛋白，進(jìn)行免疫印跡分析。

1.5.5 EMSA檢測(cè)細(xì)胞中HIF-1α與DNA結(jié)合能力 電泳遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)反應(yīng)液由以下成分組成：①8 μg的按實(shí)驗(yàn)所需條件處理的HepG2細(xì)胞的核蛋白；②20 μL的結(jié)合緩沖液；③1 μL的生物素標(biāo)記的寡核苷酸探針(0.2 μmol/L)：HIF-1α(5′-TCT GTA CGT GAC CAC ACT CAC CTC-3′，3′-AGA CAT GCA CTG GTG TGA GTG GAG-5′)，脫氧核糖核苷酸生物素標(biāo)記末端的共識(shí)寡核苷酸探針；④野生型的未標(biāo)記的 HIF-1α探針(10 μmol/L)；⑤突變型的未標(biāo)記的HIF-1α探針(1.75 μmol/L)：HIF-1α(5′-TCT GTA AAA GAC CAC ACT CAC CTC-3′，3′-AGA CAT TTT CTG GTG TGA GTG GAG-5′)；⑥Stat3 抗體。電泳遷移混合液室溫放置20 min，加入5 μL的上樣緩沖液，DNA-蛋白復(fù)合物，在0.5×Tris-硼酸鹽-EDTA緩沖液中，經(jīng)6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳380 mA，1 h后，轉(zhuǎn)移到帶正電荷的硝酸纖維素膜，并經(jīng)紫外交聯(lián)。最后，使用化學(xué)發(fā)光電泳遷移工具包，通過Bio-Rad紅外系統(tǒng)使凝膠轉(zhuǎn)移可視化。

1.5.6 裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，以0.1 mL(2×106個(gè))接種于裸鼠右側(cè)腋窩皮下。用游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤直徑，待腫瘤生長(zhǎng)至50～100 mm3后將動(dòng)物隨機(jī)分組，每組6只。設(shè)4個(gè)組別，分別為生理鹽水對(duì)照組、芹菜素100 mg/kg組、芹菜素200 mg/kg組、芹菜素400 mg/kg組。芹菜素腹腔注射隔天給藥，30 d后，裸鼠處死，手術(shù)剝?nèi)×鰤K并比較分析各組瘤體積和瘤重。抑瘤率(tumor inhibitory ratio)的計(jì)算公式為：

抑瘤率% =(1-給藥組平均瘤重/空白組平均瘤重)×100%

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 芹菜素對(duì)HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響

對(duì)各組中BrdU陽性的HepG2細(xì)胞和DAPI陽性的總細(xì)胞計(jì)數(shù)。如圖1所示，與對(duì)照組比較，芹菜素給藥組BrdU陽性的數(shù)目比例顯著減少，40 μmol/L處理組與對(duì)照組相比其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，80 μmol/L處理組與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P<0.01)，表明芹菜素在體外可以劑量依賴性地抑制HepG2細(xì)胞的增殖。Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)果顯示，80 μmol/L芹菜素處理組HepG2細(xì)胞凋亡率為41.3%，20 μmol/L和40 μmol/L芹菜素對(duì)HepG2細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)作用較弱。

2.2 芹菜素對(duì)HepG2細(xì)胞糖酵解作用的影響

腫瘤細(xì)胞的代謝有一個(gè)顯著的特點(diǎn)，即高水平的糖酵解作用。檢測(cè)各組HepG2細(xì)胞內(nèi)葡萄糖攝取和乳酸生成水平。結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組比較，芹菜素給藥組內(nèi)HepG2細(xì)胞的葡萄糖攝取和乳酸生成水平均有所下降，40 μmol/L處理組與對(duì)照組相比其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，80 μmol/L處理組與對(duì)照組相比差異具有顯著性(P<0.01)，表明芹菜素在體外可以劑量依賴性地抑制HepG2細(xì)胞的糖酵解作用。

2.3 芹菜素對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)HIF-1α及糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

HIF-1α上調(diào)多種糖酵解的因素，包括HKII和LDHA。同時(shí)，HIF-1α通過抑制丙酮酸脫氫酶來抑制丙酮酸進(jìn)入線粒體，從而導(dǎo)致三羧酸循環(huán)受到抑制，這一過程需要PDHK1的誘導(dǎo)。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，芹菜素可以降低HepG2細(xì)胞內(nèi)糖酵解相關(guān)蛋白(PDHK1、HKII和LDHA)的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)HIF-1α的表達(dá)(見圖3)，其中，80 μmol/L作用效果非常明顯(P<0.01)，提示芹菜素可抑制HepG2細(xì)胞內(nèi)糖酵解。

圖3 芹菜素對(duì)HepG2細(xì)胞糖酵解相關(guān)蛋白的影響

2.4 芹菜素對(duì)HIF-1α與DNA結(jié)合能力的影響

EMSA的結(jié)果(見圖4)顯示，芹菜素對(duì)HIF-1α與DNA的結(jié)合能力也有明顯的抑制作用。從40 μmol/L開始表現(xiàn)出很好的效應(yīng)，加藥組與對(duì)照組相比具有顯著性差異(P<0.01)，以上結(jié)果表明芹菜素通過調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)及其與DNA結(jié)合能力發(fā)揮抗腫瘤作用。

2.5 芹菜素對(duì)HepG2細(xì)胞裸鼠移植瘤的影響

裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明(見圖5、圖6)，芹菜素在體內(nèi)有著較好的抑瘤作用，芹菜素100 mg/kg組瘤體積的相對(duì)增殖率為86.09%，抑瘤率為22.33%；芹菜素200 mg/kg組瘤體積的相對(duì)增殖率為75.97%，抑瘤率為37.32%；芹菜素400 mg/kg組瘤體積的相對(duì)增殖率為61.77%，抑瘤率高達(dá)53.67%。

注：*P<0.05，**P<0.01。

圖5 芹菜素對(duì)HepG2細(xì)胞裸鼠移植瘤體積的影響(n=6)

圖6 芹菜素對(duì)HepG2細(xì)胞裸鼠移植瘤瘤重的影響(n=6)

2.6 芹菜素對(duì)瘤組織內(nèi)HIF-1α及糖酵解相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

對(duì)移植瘤組織的石蠟切片進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果(見圖7)與體外Western blot結(jié)果一致，400 mg/kg芹菜素可以明顯降低瘤組織內(nèi)糖酵解相關(guān)蛋白(PDHK1、HKII和LDHA)的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)HIF-1α的表達(dá)，提示芹菜素在體內(nèi)也有抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解的作用。

圖7 芹菜素對(duì)HepG2細(xì)胞移植瘤組織糖酵解相關(guān)蛋白的影響

3 討論

本研究定位于中藥有效成分芹菜素，體內(nèi)利用裸鼠移植瘤模型驗(yàn)證芹菜素體內(nèi)抑制腫瘤糖酵解的效應(yīng)，并且可以實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)地觀察藥物對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。結(jié)合經(jīng)典的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芹菜素在體內(nèi)外都具有一定的抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解的作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素可以通過抑制HIF-1α與DNA的結(jié)合能力從而抑制糖酵解發(fā)揮其抗腫瘤的作用。

腫瘤細(xì)胞能量代謝異常的表現(xiàn)眾多，除糖代謝異常外，腫瘤組織還存在脂肪酸代謝、氨基酸代謝異常[7-8]。糖酵解過度活躍，線粒體有氧代謝削弱，是腫瘤細(xì)胞發(fā)生糖代謝異常的重要原因[9-10]。HIF-1α作為具有轉(zhuǎn)錄活性的核蛋白，具有相當(dāng)廣泛的靶基因譜，在增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的糖酵解和促進(jìn)腫瘤新生血管生成中都十分重要[11-12]。此外，實(shí)體瘤缺氧區(qū)的存在以及腫瘤細(xì)胞糖酵解增強(qiáng)還會(huì)導(dǎo)致腫瘤患者對(duì)治療產(chǎn)生抵抗，對(duì)化療藥物失去敏感產(chǎn)生耐受，最終導(dǎo)致腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移[13-14]。芹菜素有抑制腫瘤細(xì)胞糖酵解作用提示：芹菜素可能改善化療藥物耐受，或與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用可達(dá)到增效減毒的效果，值得進(jìn)一步探索。本研究為芹菜素用于防治腫瘤展示了有力證據(jù)，并提供了新的研究方法和研究模式。