王 璐，張 強，王艷萍，郭旭川，張文倩，朱春灝，曾維斌

（石河子大學(xué) 動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832000）

新疆驢具有耐粗飼、抗寒、繁殖力強等諸多優(yōu)良性能，在農(nóng)牧民生產(chǎn)和生活中占有重要地位。隨著驢及驢副產(chǎn)品的需求增加，有關(guān)驢奶、驢皮、驢肉的生產(chǎn)應(yīng)用與相關(guān)研究逐漸深入[1-3]，然而生活方式的改變，導(dǎo)致新疆驢的役用價值逐漸下降，存欄量持續(xù)減少。研究新疆驢精液低溫稀釋液對高效利用優(yōu)秀種公驢精液和加強品種保護具有重要意義。精液稀釋液的成分對精液的質(zhì)量有著較大影響[4]，所以配制合理的稀釋液有利于精液的保存。研究表明，添加不同緩沖劑的稀釋液對豬精液低溫保存效果具有顯著差異[5]，卵黃可附著于精子細(xì)胞表面，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外電解質(zhì)平衡，卵黃液冷保存精子后可提高精子的穿卵率[6,7]，添加一定比例的卵黃稀釋液有利于驢精液的保存[8]，糖類在馬精子等保存過程中發(fā)揮著重要作用[9,10]。人工授精技術(shù)因具有提高公畜精液利用率、方便母畜集約化管理等優(yōu)勢被大力推廣。在實際生產(chǎn)中，精液稀釋液在豬、牛等動物已獲得普遍應(yīng)用，通過精液稀釋液來提高種公驢精液的保存品質(zhì)正在逐漸引起人們的關(guān)注，而適用于新疆驢精液低溫稀釋液的相關(guān)研究較少。本研究通過逐步改進稀釋液的配方，篩選對精液低溫保存效果較好的稀釋液，以期為提高新疆驢種公驢精液利用率和實現(xiàn)品種保護提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

3頭優(yōu)秀新疆驢種公驢（石河子市九昌驢業(yè)有限公司提供），年齡為3～5歲，體況良好，無生殖系統(tǒng)疾病，按照種公驢培育管理技術(shù)規(guī)程進行飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑及器材

檸檬酸、羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、青霉素鉀和硫酸鏈霉素均購自范德生物公司，三羥甲基氨基甲烷（Tris）購自北京索萊寶科技有限公司，自配低滲（HOST）液（果糖0.9 g，檸檬酸鈉0.49 g，雙蒸水100 ml，現(xiàn)用現(xiàn)配），倒置顯微鏡，恒溫臺。

1.3 試驗方法

1.3.1 稀釋液配方 試驗先設(shè)置3種不同類型緩沖體系的配方（A1、A2、A3），在篩選出最佳緩沖體系后，設(shè)置含不同比例卵黃的稀釋液配方（B1、B2、B3），再次篩選出最佳卵黃添比例，設(shè)置含不同糖類的稀釋液配方（C1、C2、C3、C4）。具體精液稀釋液配方見表1。

1.3.2 稀釋液配置 準(zhǔn)確稱量各試劑，溶于雙蒸水，濾紙過濾，高壓滅菌10 min，冷卻至室溫備用。新鮮雞蛋敲開外殼，無菌濾紙滾動去除卵黃表面的蛋清，注射器針頭輕輕挑破卵黃，無針頭注射器緩慢吸取卵黃液，注入冷卻后的溶液中，最后加入青鏈霉素，磁力攪拌器攪拌30 min，所有稀釋液均為現(xiàn)配現(xiàn)用。

表1 精液稀釋液配方

1.3.3 精液采集與處理 假陰道法采集精液，經(jīng)4～6層紗布過濾后，按照1∶1 體積比稀釋精液，室溫平衡30 min后，1 800 r/min離心10 min，棄上清，加入精液稀釋液至原精液量的3倍。將裝有精液的離心管以10層紗布包裹，置于5℃冰箱保存。每12小時翻動1次離心管，避免精子沉積。

1.4 精液品質(zhì)指標(biāo)及檢測方法

精子活率檢測：取適量精液于1.5 ml離心管，37℃水浴5 min，顯微鏡下隨機5個視野，每次計數(shù)不少于200個精子，重復(fù)3次。統(tǒng)計所含的活精子數(shù)所占比例。

質(zhì)膜完整性檢測：取1 mlHOST液，37℃預(yù)熱5 min，加入100μl精液，輕輕混勻，37℃水浴45 min。倒置顯微鏡下隨機觀察5個變化，每次計數(shù)不少于200個精子，重復(fù)3次。正常精子由于質(zhì)膜膨脹而使尾部彎曲、形成環(huán)狀，膜功能不完整的精子則不發(fā)生彎尾現(xiàn)象。統(tǒng)計所含的彎尾、環(huán)狀精子數(shù)所占比例。

有效存活時間：每2小時觀察1次精子活率，統(tǒng)計精子活率在0.50以上時的保存時間。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同緩沖體系的稀釋液保存效果

由表2可知，隨著保存時間的延長，精液品質(zhì)逐漸下降。1 d時，A3組精子活率、質(zhì)膜完整性顯著高于A1、A2組；在2～4 d，A1組精子活率、質(zhì)膜完整性趨于0；4 d時，A3組精子活率、質(zhì)膜完整性依然最高，分別為0.736±0.045、0.637±0.032；A 3 組精子有效存活時間為132.00±2.37 h。

以配方A3（B1）進行下一步試驗。

2.2 不同卵黃比例的稀釋液保存效果

由表3可知，在1～5 d，各組間精子活率差異不顯著；6 d時，B3組精子活率顯著高于B2組；7 d時，B3組精子活率顯著高于B1、B2組，B1、B2組精子活率差異不顯著。在2～7 d，B3組精子質(zhì)膜完整性顯著高于B1、B2組；在5～6 d，B2組精子質(zhì)膜完整性顯著高于B1，除5～6 d外，B1、B2組精子質(zhì)膜完整性無顯著差異。組間比較顯示，各組間精子的有效存活時間差異顯著，其中B3組最高，其次為B1、B2組。

表2 不同緩沖體系對精液低溫保存品質(zhì)的影響

表4 不同糖類對精液低溫保存品質(zhì)的影響

以配方B3（C1）進行下一步試驗。

2.3 不同糖類的稀釋液保存效果

由表4可知，在2～3 d，各組精子活率差異不顯著，在5～7 d，C3組精子活率顯著高于C1、C4組，C2、C3組間差異不顯著；在6～7 d，C2組精子活率顯著高于C1、C4組。在1～2 d、4～7 d，各組精子質(zhì)膜完整性差異不顯著，C3組精子質(zhì)膜完整性顯著高于C1、C2、C4組；在5～7 d，C1、C2組精子質(zhì)膜完整性顯著高于C4組。組間比較顯示，各組間精子的有效存活時間差異顯著，其中C3組最高，其次為C2、C1、C4。

3 討論

3.1 不同緩沖體系對精液低溫保存品質(zhì)的影響

緩沖劑在精液的保存中具有至關(guān)重要的作用，HEPES作為非離子兩性緩沖劑在維持精子活率方面要優(yōu)于傳統(tǒng)的無機緩沖劑，且具有螯合有害重金屬離子的作用[11]。山羊精液在低溫保存中，含HEPES的稀釋液其保存效果好于“Tris+檸檬酸”稀釋液[12]。食蟹猴精液在低溫保存中，“Tris+檸檬酸”稀釋液的保存效果好于含HEPES的TALP液[13]。本研究表明，3種緩沖體系稀釋液中“HEPES+檸檬酸鹽”稀釋液的保存效果明顯好于其他組。以上結(jié)果不同的原因除了可能與物種差異有關(guān)外，還可能是由于本研究的“HEPES+檸檬酸鹽”稀釋液中鈉、鉀離子可以維持細(xì)胞滲透壓和跨膜靜息電位，更有利于精子的長期保存。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫保存2 d內(nèi)，精子活率存在波動現(xiàn)象，這可能與稀釋液酸堿度和精子代謝造成精子假死狀態(tài)的變化有關(guān)，此現(xiàn)象與部分報道結(jié)果相似[14,15]。

3.2 不同卵黃比例對精液低溫保存品質(zhì)的影響

卵黃作為一種緩沖物質(zhì)，它能使精子適應(yīng)滲透壓變化較大的稀釋液，但卵黃中的高密度脂蛋白、氨基酸經(jīng)酶等會降低精子質(zhì)量[16,17]，所以卵黃恰當(dāng)?shù)奶砑恿坑幸嬗诰拥谋４?。另外，卵黃通過促進精子與卵細(xì)胞透明帶的結(jié)合，可提高精子的頂體反應(yīng)（AR）率[18]。藍狐精液稀釋液中添加5%卵黃精子質(zhì)量最好，其精子活率在第5天為0.559[19]，與本研究結(jié)果不同。馬精液稀釋液中添加8%卵黃時精子質(zhì)量好于添加5%、0.8%的卵黃[20]。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，添加8%卵黃的稀釋液可顯著延長驢精液的低溫保存時間，保存第5天時，精液活率仍高于0.700。

3.3 不同糖類對精液低溫保存品質(zhì)的影響

糖類是精液稀釋液的主要成分之一，作為常用的非滲透性保護劑可通過糖酵解途徑為精子代謝提供能量。而且糖類的羥基可以與精子膜磷脂的磷酸根結(jié)合置換周圍的水分子，從而起到穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)和防止冰晶損傷的作用[21]。毛冉等[22]研究表明，鮮精稀釋保存液中添加葡萄糖、果糖和D-半乳糖的混合糖，有利于維持精液品質(zhì)和延長精子在體外的有效存活時間，其有效存活時間為57.70±6.3 h。徐文慧等[9]研究表明，葡萄糖分別與果糖、乳糖、棉籽糖及海藻糖兩兩組合低溫保存，精液96 h以內(nèi)TM差異不大。本研究表明，葡萄糖或“葡萄糖+果糖（或蔗糖）”的組合未達到比“葡萄糖+乳糖”更好的低溫保存效果，優(yōu)化后的“葡萄糖+乳糖”組，其有效存活時間可達215.00±3.46 h，與單獨添加葡萄糖相比，“葡萄糖+蔗糖”組的精子活率降低較快，說明蔗糖可能不適用于新疆驢精液的低溫保存。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，“HEPES+檸檬酸鹽、8%卵黃、葡萄糖+乳糖”組合的稀釋液適用于新疆驢精液的低溫保存，有利于提高種公驢精液利用率和加強品種保護，可用于實際生產(chǎn)和長途運輸。