李璐 尹燕鋒 楊越 楊鑫 高建虎

[摘要]目的：通過(guò)體外培養(yǎng)人乳腺癌難愈合創(chuàng)面中成纖維細(xì)胞，并應(yīng)用TGF-β/Smad信號(hào)通路阻斷劑干擾素γ（IFN-γ）干擾后，探討IFN-γ在乳腺癌難愈合創(chuàng)面中所發(fā)揮的作用和影響。方法：采用酶消化法對(duì)人乳腺癌潰瘍創(chuàng)面組織行體外成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成A、B、C、D共四組，A組為IFN-γ 5 000U/ml組;B組為IFN-γ 10 000U/ml組;C組為對(duì)照組，不加藥物;D組為空白組。分別于第7天、第14天將培養(yǎng)細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，用MTT法測(cè)定細(xì)胞增殖情況。結(jié)果：第7天及第14天A組吸光值與對(duì)照組C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;B組吸光值均低于對(duì)照組C組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：IFN-γ對(duì)成纖維細(xì)胞的增殖抑制受到濃度的影響，濃度10 000U/ml時(shí)明顯抑制了體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的增殖，而在較低濃度（5 000U/ml）時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞增殖無(wú)明顯抑制作用。

[關(guān)鍵詞]乳腺癌;成纖維細(xì)胞;干擾素γ（IFN-γ）;潰瘍創(chuàng)面;難愈合創(chuàng)面

[中圖分類(lèi)號(hào)]R737.9? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2021）03-0099-03

Effect of IFN-γ on Fibroblasts in Wound Tissue of Breast Cancer Ulcer

LI Lu1 ，YIN Yan-feng2，YANG Yue1，YANG Xin1，GAO Jian-hu1

（1.Department of Breast Surgery; 2.Biomedical Research Center，Gan Mei Hospital Affiliated to Kunming Medical University，Kunming 650011，Yunnan，China）

Abstract： Objective? The role and influence of IFN-γ in refractory wounds of breast cancer were investigated by in vitro culture of fibroblast cells in refractory wounds of breast cancer and interference with IFN-γ （TGF-β/Smad signaling pathway blocker）. Methods? In vitro fibroblast primary culture was performed on the wound tissue of human breast cancer ulcer by enzyme digestion. The experimental cells were divided into four groups： group A， group B， group C and group D. Group A was IFN-γ 5 000U/ml group， group B was IFN-γ 10 000U/ml group; group C was the control group without drugs， group D was blank group. The cultured cells were inoculated into 96-well plates on the 7th and 14th day respectively， and cell proliferation was determined by MTT method. Results? There was no significant difference in OD value between group A and control group C on the 7th and 14th day（P>0.05）. The OD value of group B was lower than those of group C， the differences were statistically significant（P<0.05）. Conclusion? The inhibition of IFN-γ on proliferation of fibroblasts was affected by the concentration， the concentration at 10 000U/ml significantly inhibited proliferation of fibroblasts cultured in vitro， while the lower concentration of IFN-γ at 5 000U/ml no obvious inhibitory effect on the proliferation of fibroblasts.

Key words： breast cancer; fibroblast; interferon-γ（IFN-γ）; ulcer wound; refractory wound

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（Transforming growth factor β，TGF-β）是一種多向性、多效性的細(xì)胞因子，以自分泌或旁分泌的方式通過(guò)細(xì)胞表面的受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的合成、創(chuàng)傷的修復(fù)、免疫功能等有重要的調(diào)節(jié)作用[1]。TGF-β參與創(chuàng)面愈合的全過(guò)程[2]。Smad是指參與TGF-β細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)的相關(guān)蛋白，統(tǒng)一命名為Smad信號(hào)蛋白，是TGF-β受體作用的直接底物，是將配體與受體作用的信號(hào)由胞漿傳導(dǎo)至細(xì)胞核的中介分子[3]。本研究通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞使用TGF-β/Smad信號(hào)通路阻斷劑干擾素-γ（IFN-γ）后，觀(guān)測(cè)體外培養(yǎng)的人乳腺癌難愈性創(chuàng)面成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞功能方面的變化，為了解TGF-β/Smads信號(hào)通路在人乳腺癌難愈性創(chuàng)面愈合過(guò)程中發(fā)揮的作用及其程度，探討促進(jìn)人乳腺癌難愈性創(chuàng)面愈合的新方法。

1? 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器：CDEM高糖培養(yǎng)基 （sigma）D6429-500ml;胎牛血清;DPBS（gibco）8113346;青霉素-鏈霉素（gibco）;MTT試劑盒（sigma）CGD1;0.25%胰酶（gibco）1213981;干擾素-γ（IFN-γ）購(gòu)自上?？寺∩锔呒夹g(shù)有限公司;二甲基亞砜（DMSO）;96孔培養(yǎng)板;25cm2培養(yǎng)瓶;3cm培養(yǎng)基;CO2孵育箱;顯微鏡;微型震蕩儀;酶標(biāo)儀等由昆明市第一人民醫(yī)院分子生物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.2 標(biāo)本來(lái)源：臨床常見(jiàn)人乳腺癌潰瘍創(chuàng)面組織，經(jīng)過(guò)常規(guī)換藥3個(gè)月仍然難愈合的潰瘍創(chuàng)面組織且面積大于5cm×5cm，經(jīng)過(guò)病理學(xué)活檢鑒定創(chuàng)面組織有乳腺癌浸潤(rùn)生長(zhǎng)。取該創(chuàng)面組織，采用酶消化法進(jìn)行成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組：實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成A、B、C、D共4組，A組為IFN-γ5 000U/ml組;B組為IFN-γ10 000U/ml組;C組為對(duì)照組，只有培養(yǎng)細(xì)胞，不加IFN-γ;D組為空白組，與實(shí)驗(yàn)孔平行設(shè)置不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液，其他實(shí)驗(yàn)條件保持一致，用于比色時(shí)儀器調(diào)零。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)：①所得組織切除壞死組織（不小于1cm3），放于15ml離心管中（瓶中放加過(guò)雙抗的生理鹽水）;②用鑷子將組織從瓶子中取出，放入75%酒精的3cm培養(yǎng)皿中浸泡5～10s;③用加過(guò)雙抗的生理鹽水沖洗浸泡2遍（每次不少于10s）;④去除暴露在外的組織和脂肪組織，用4℃加雙抗的DPBS（gibco）8113346緩沖液沖洗組織2遍，置于0.25%胰酶（gibco1213981）中在4℃條件下孵育18h，用無(wú)血清的CDEM高糖培養(yǎng)基（sigma）D6429-500ml浸潤(rùn)后置于干凈的3cm培養(yǎng)皿中;⑤將組織剪切成1～2mm3的小塊，將剪好的組織小塊排列于25cm2的培養(yǎng)瓶中，用marker筆標(biāo)記好日期等信息;⑥將培養(yǎng)瓶置于37℃、5% CO2條件下孵育1～3h;⑦預(yù)熱二甲基亞砜（DMSO）完全后，將培養(yǎng)基置于37℃;⑧培養(yǎng)瓶中，每瓶加入5ml預(yù)熱好的青霉素-鏈霉素（gibco），其中含青霉素100U/ml、鏈霉素各100U/ml、胰島素40U/200ml和10%胎牛血清的CDEM高糖培養(yǎng)基（sigma）D6429-500ml中，置于37℃、5% CO2條件培養(yǎng)箱中培養(yǎng);⑨以后每隔3d換1次培養(yǎng)液。

觀(guān)察到成纖維細(xì)胞于培養(yǎng)后第3天開(kāi)始繁殖，由組織塊開(kāi)始向四周擴(kuò)展，于第3天加入干擾素γ（IFN-γ）（購(gòu)自上海克隆生物高技術(shù)有限公司）。A組加入濃度為5 000U/ml的IFN-γ、B組加入濃度為10 000U/ml IFN-γ后繼續(xù)培養(yǎng)，隔日每組加入與之前同組別相同濃度的IFN-γ。分別于第7天、第14天分別取培養(yǎng)細(xì)胞用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：①將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)，濃度為每孔104/200μl，繼續(xù)培養(yǎng)24h;②棄去細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)液，每孔中加入4mg/ml MTT試劑盒（sigma）CGD1溶液100μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h;③終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。每孔加入150μl二甲基亞砜（DMSO），在微型振蕩器上震蕩5min，使結(jié)晶充分溶解;④比色：選擇490nm波長(zhǎng)，用D組空白組儀器調(diào)零，在酶標(biāo)儀（由昆明市第一人民醫(yī)院分子生物實(shí)驗(yàn)中心提供）上測(cè)定每孔光吸收值（OD值），并記錄結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x?±s）表示，采用SPSS 24.0 for windows統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。處理檢驗(yàn)水準(zhǔn)α為0.05，P<0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

成纖維細(xì)胞于培養(yǎng)后第3天開(kāi)始繁殖，由組織塊開(kāi)始向四周擴(kuò)展。分別于第7天（見(jiàn)圖1）、第14天（見(jiàn)圖2）分別取培養(yǎng)細(xì)胞，接種于96孔板內(nèi)，用MTT法做細(xì)胞增殖的測(cè)定。第7天A組吸光值（OD值）為0.198±0.082與對(duì)照組C組0.201±0.008比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.941>0.05）;B組吸光值（OD值）為0.145±0.013低于對(duì)照組C組0.201±0.008，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.006<0.05）;第14天A組吸光值（OD值）為0.206±0.054與對(duì)照組C組0.189±0.052比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.692>0.05）;B組吸光（OD值）值0.164±0.057低于對(duì)照組C組0.189±0.052，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.012<0.05）。實(shí)驗(yàn)表明IFN-γ在濃度10 000U/ml對(duì)體外成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用，而濃度5 000U/ml對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制作用。

3? 討論

眾所周知，TGF-β/Smad信號(hào)通路作為一個(gè)龐大的超家族，與創(chuàng)面愈合、疾病發(fā)生發(fā)展、腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。TGF-β可同時(shí)作為腫瘤抑制物和腫瘤促進(jìn)物存在，其作用的發(fā)揮在腫瘤早期起抑制作用，而在腫瘤后期起促進(jìn)作用[5]。而這個(gè)作用是通過(guò)的TGF-β/Smad中成員的缺失突變，以及抑制型TGF-β調(diào)節(jié)來(lái)影響惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。Smad2和Smad4在人惡性腫瘤中的滅活表明他們是抑癌基因調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的重要分子，其突變或表達(dá)的失活與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[7]。TGF-β/Smad導(dǎo)致的生長(zhǎng)抑制應(yīng)答的缺失，易導(dǎo)致上皮細(xì)胞惡性腫瘤的產(chǎn)生[8]。

目前，已發(fā)現(xiàn)的Smad分子共有8種，其中Smad2，3，4，6，7與TGF-β的信號(hào)調(diào)控最為密切，并將這5種Smad按其功能分為3類(lèi)：①受體調(diào)節(jié)型Smad，即Smad2與Smad3。配體與受體結(jié)合后，即能磷酸化Smad2，Smad3使其激活;②共用型Smad，即Smad4。Smad2與Smad3激活磷酸化后必須與Smad4形成復(fù)合物，才能遷移至胞核中促進(jìn)靶基因表達(dá);③抑制型Smad，包括Smad6和Smad7[9]。目前，對(duì)于Smad7阻斷TGF-β信號(hào)通路，以及其對(duì)器官纖維化的實(shí)驗(yàn)研究成為廣大學(xué)者研究的熱點(diǎn)。Smad7可阻斷信號(hào)通路下調(diào)了TGF-β的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，減少其自身基因表達(dá)[10]。同時(shí)，Smad7的表達(dá)可以受到其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響。比如，IFN-γ通過(guò)Jak1酪氨酸蛋白激酶和Stat1轉(zhuǎn)錄因子可以增強(qiáng)Smad7的表達(dá)，而達(dá)到抑制TGF-β的作用[11]。

本試驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)乳腺癌難愈合創(chuàng)面中成纖維細(xì)胞并應(yīng)用外源性IFN-γ增強(qiáng)Smad7的表達(dá)而抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路，探討IFN-γ的作用及其影響。實(shí)驗(yàn)取人乳腺癌潰瘍創(chuàng)面組織，進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)其成纖維細(xì)胞。采用酶消化法進(jìn)行成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明IFN-γ在第7天和第14天均抑制了成纖維細(xì)胞的增殖。但是，IFN-γ對(duì)成纖維細(xì)胞增殖抑制受到濃度的影響，濃度在10 000U/ml明顯抑制了體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的增殖。而IFN-γ在較低濃度5 000U/ml對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響。說(shuō)明，IFN-γ在濃度10 000U/ml對(duì)體外成纖維細(xì)胞的增殖有抑制作用，而濃度5 000U/ml時(shí)對(duì)體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的增殖無(wú)明顯抑制作用。

通過(guò)阻斷TGF-β/Smads通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，觀(guān)測(cè)體外培養(yǎng)的人乳腺癌難愈合創(chuàng)面成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞功能方面的變化，濃度在10 000U/ml明顯抑制了體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的增殖;IFN-γ對(duì)于創(chuàng)面愈合的影響是通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，增生緩慢，從而影響創(chuàng)面愈合。目前對(duì)于體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞應(yīng)用外源性IFN-γ來(lái)阻斷TGF-β/Smad通路未見(jiàn)報(bào)道，本研究表明TGF-β/Smads信號(hào)通路在乳腺癌難愈合創(chuàng)面中所發(fā)揮的作用，為臨床促進(jìn)乳腺癌難愈合創(chuàng)面愈合提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。將在今后實(shí)驗(yàn)研究中進(jìn)一步探討其藥理規(guī)律，為臨床藥物試驗(yàn)提供理論依據(jù)，以便患者得到更為積極的藥物治療。

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[收稿日期]2019-10-25

本文引用格式：李璐，尹燕鋒，楊越，等.IFN-γ對(duì)乳腺癌潰瘍創(chuàng)面組織中成纖維細(xì)胞的影響[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2021，30（3）：99-101.