陳宇 溫潔儀 韓萍 劉冠廷 張光耀 杜志云

[摘要]目的：通過研究葛根素（Puerarin，Pur）對3T3-L1前脂肪細胞增殖分化及大鼠乳房脂肪組織的影響及其相關(guān)蛋白表達的調(diào)控，旨在探討Pur對乳房脂肪組織的影響及其機制。方法：采用體外培養(yǎng)3T3-L1前脂肪細胞測定不同濃度Pur對3T3-L1脂肪細胞分化過程中胞漿脂滴積累的影響，通過Western blot、免疫熒光實驗檢測Pur對解偶聯(lián)蛋白（Uncoupling protein 1，UCP-1）、重組人CCAAT增強子結(jié)合蛋白（CCAA Tenhancer-binding protein α，C/EBP-α）表達水平;進一步考察大鼠乳房涂抹不同濃度的Pur對脂肪組織增殖的影響，通過HE染色檢測乳腺脂肪細胞體積、免疫組化檢測乳腺脂肪蛋白，分析其增殖機制。結(jié)果：Pur通過上調(diào)3T3-L1細胞中脂肪分化相關(guān)蛋白UCP-1、C/EBPα的表達，顯著促進3T3-L1脂肪細胞分化過程中胞漿脂滴積累。此外，體內(nèi)實驗結(jié)果顯示Pur能促進大鼠乳房脂肪細胞增多，脂肪細胞直徑增大，且促進乳腺UCP-1、C/EBPα的表達。結(jié)論：Pur顯著促進大鼠乳房脂肪組織增殖，其作用機制可能與上調(diào)脂肪分化相關(guān)的蛋白 UCP-1、C/EBPα的表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]葛根素;大鼠乳房脂肪組織;3T3-L1前脂肪細胞;增殖

[中圖分類號]R622? ? [文獻標(biāo)志碼]A? ? [文章編號]1008-6455（2021）03-0093-06

Effects of Puerarin on Rat Breast Adipose Tissue Proliferation and its Mechanism

CHEN Yu1，2，WEN Jie-yi3，HAN Ping3，LIU Guan-ting1，ZHANG Guang-yao1，DU Zhi-yun1

[1.School of Biomedicine，Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，Guangdong，China;2.Infinitus （China） Co.， Ltd. R & D Center，Guangzhou 510653，Guangdong，China;3.Foshan Allan Conney Biotechnology Co.， Ltd.，F(xiàn)oshan 523281，Guangdong，China]

Abstract： Objective? To study the effect of puerarin （Pur） on the proliferation and differentiation of 3T3-L1 preadipocytes and rat breast adipose tissue and the regulation of related protein expression， aiming to explore the effect of puerarin on breast adipose tissue And its mechanism. Methods 3T3-L1 preadipocytes were cultured in vitro to determine the effect of different concentrations of puerarin on the accumulation of cytoplasmic lipid droplets during the differentiation of 3T3-L1 adipocytes. The expression level of the uncoupling protein and the recombinant human CCAAT enhancer binding protein （C/EBP-α） was detected by Western blot and immunofluorescence experiments. Further， to investigate the effect of applying different concentrations of puerarin on the proliferation of adipose tissue in rat breasts， The volume of mammary fat cells was detected by HE staining， and the mammary adipose protein was detected by immunohistochemistry， and the proliferation mechanism was analyzed. Results? Pur up-regulated the expression of UCP-1 and C/EBPα in 3T3-L1 cells， which significantly promoted the accumulation of cytoplasmic lipid droplets during the differentiation of 3T3-L1 cells. In addition， in vivo experiments show that Pur can promote the increase of rat breast fat cells， increase the diameter of fat cells， and promote the expression of breast UCP-1 and C/EBPα. Conclusion Pur significantly promotes the proliferation of rat breast adipose tissue， and its mechanism may be related to the up-regulation of the expression of UCP-1 and C/EBPα， which are related to fat differentiation.

Key words： puerarin; rat breast adipose tissue; 3T3-L1 preadipocytes; proliferation

乳房是女性的第二性征，也可展示女性美與自信，但仍有不少女性有乳房發(fā)育不良的困擾。目前對改善乳房發(fā)育不良的方法，包括藥物、激素、手術(shù)填充、針灸等[1]，但可能存在誘發(fā)內(nèi)分泌失調(diào)等疾病的副作用。近年來，食療及體外涂抹含有美乳功效的天然成分受到廣大女性的歡迎，主要采用葛根、啤酒花、紅花等天然植物制備而成。研究表明，葛根可以有效增大胸圍，改善胸部毛細血管微循環(huán)，產(chǎn)生美乳豐胸的功能。云巾宴等研究發(fā)現(xiàn)葛根中活性成分Pur能促進3T3-L1細胞分化成脂，可能具有促進脂肪形成的作用[2-3]，體內(nèi)實驗通過激素水平途徑證實Pur能促進小鼠乳房發(fā)育[4]。截止目前，關(guān)于Pur促進乳房發(fā)育的具體分子通路機制尚未清晰，因此，有必要闡明Pur促進脂肪細胞及乳房發(fā)育的分子通路機制。前體脂肪細胞的分化促進脂肪的形成并堆積，通過研究脂肪組織中調(diào)控前體脂肪細胞轉(zhuǎn)化為脂肪細胞的分子機制，有助于調(diào)控脂肪的增殖，具有重要意義。研究表明，3T3-L1前脂肪細胞模型常用作研究脂肪生成的分子機制[5]。因此，本研究通過以Pur為原料，研究其對3T3-L1細胞分化成脂作用，并采用SD大鼠模型，在大鼠乳房外涂Pur，測試其對乳房脂肪增殖的影響，并進一步探討其作用機制，為葛根類的美乳豐胸產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：Pur由無限極（中國）公司提供，市售美胸乳（Bea）由無限極（中國）公司提供，胎牛血清胎牛血清購自美國gibco公司，DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國gibco公司，青鏈霉素混合液購自北京索萊寶科技有限公司，胰蛋白酶消化液購自北京索萊寶科技有限公司，牛胰島素購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，地塞米松購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，油紅O購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，4%多聚甲醛固定液購自碧云天有限公司，Triton-X100購自北京索萊寶科技有限公司，DAPI染色液購自北京索萊寶科技有限公司，羊抗兔IgG-FITC購自北京索萊寶科技有限公司，UCP-1、C/EPB-α一抗購自美國Aiffinity公司，羊抗兔IgG-HRP購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 細胞株：3T3-L1前脂肪細胞株，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞庫。

1.1.3 動物：雌性SD大鼠[許可證號：SCXK（粵）2018-0002]購自廣東省醫(yī)學(xué)動物實驗中心。

1.2 方法

1.2.1 Pur對3T3-L1細胞脂肪分化影響的實驗

1.2.1.1 細胞誘導(dǎo)：使用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基在5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3T3-L1細胞，每天更換培養(yǎng)基，待細胞長滿90%，用0.25%胰蛋白酶消化液消化傳代。將3T3-L1細胞接種到24孔板、6孔板或者共聚焦小皿中，24h后加入誘導(dǎo)液（含10% FBS、胰島素20μg/ml、IBMX 1mM，地塞米松2μM的DEME培養(yǎng)基，藥物組Pur濃度分別為2.5、5μg/ml），培養(yǎng)48h后更換誘導(dǎo)液（含10% FBS、胰島素20μg/ml的DEME培養(yǎng)基），培養(yǎng)48h后加入藥液（Pur濃度分別為2.5、5μg/ml的10% FBS DMEM培養(yǎng)基），再培養(yǎng)4d，每2d更換一次藥液。另設(shè)空白組，不加誘導(dǎo)液，2d更換一次培養(yǎng)基。

1.2.1.2 油紅〇實驗：3T3-L1細胞接種于24孔板中，誘導(dǎo)8d后，去除舊培養(yǎng)基，加入PBS清洗后，加入4%多聚甲醛固定30min，去除多聚甲醛，加入PBS清洗后，加入油紅〇染色液染色2h。去除油紅〇染色液，用60%的異丙醇洗去浮色，PBS漂洗后在顯微鏡下觀察拍照。

1.2.1.3 Western Blot實驗：3T3-L1細胞接種于6孔板中，誘導(dǎo)8d后，去除培養(yǎng)基，加入預(yù)冷PBS清洗后，加入RIPA裂解液于冰上裂解10min，10min后轉(zhuǎn)移至離心管，于超聲清洗儀中超聲4次，每次10s，每次間隔10s。再進行離心，使用BCA試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度后，按比例加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液。將稀釋好的蛋白樣品沸水煮10min，冷卻后加入聚丙烯酰胺預(yù)制凝膠，特定電壓下進行電泳，電泳結(jié)束后進行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后用5% BSA封閉液，室溫封閉2h，封閉后，4℃孵育一抗過夜，一抗孵育后，于搖床上用TBST清洗4次，每次10min，清洗后室溫孵育二抗2h。孵育結(jié)束后，于搖床上用TBST清洗4次，每次10min。清洗結(jié)束后，加入ECL發(fā)光液，于全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)進行顯影。

1.2.1.4 免疫熒光實驗：3T3-L1細胞接種于共聚焦小皿中，誘導(dǎo)8d后，去除舊培養(yǎng)基，加入PBS清洗后，加入4%多聚甲醛固定30min，去除多聚甲醛，加入PBS清洗后，加入5% BSA封閉液，室溫封閉2h。封閉后，去除封閉液，加入稀釋后的UCP-1或C/EPB-α抗體液，4℃冰箱孵育過夜。過夜后，回收抗體，于搖床上PBS清洗5次，每次5min。清洗后加入稀釋后的IgG-FITC工作液，室溫避光孵育2h。2h后，去除IgG-FITC，于搖床上避光PBS清洗5次，每次5min。清洗后，加入DAPI染色液染色10min。染色結(jié)束后，去除DAPI，于搖床上避光PBS清洗5次，每次5min。清洗后，于熒光倒置顯微鏡和高分辨率激光共聚焦顯微鏡下拍照。

1.2.2 Pur對SD大鼠乳房脂肪組織增殖影響的實驗

1.2.2.1 造模與給藥：SD雌性大鼠于SPF級動物房飼養(yǎng)，分為空白對照組、Bea高劑量組、Bea低劑量組、Pur高劑量組、Pur低劑量組，每組8只。每只大鼠第4對乳房進行脫毛，每天進行涂藥，其中空白組涂橄欖油（每只乳房各20μl），Bea高劑量組和Bea低劑量組（每只乳房）分別涂Bea 20、40mg。Pur高劑量組、Pur低劑量組分別涂Pur 20、40mg。連續(xù)涂藥60d。

[4]巴音吉日嘎拉.葛根素對小白鼠乳房發(fā)育的影響及其作用機理的研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

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[收稿日期]2020-05-06

本文引用格式：陳宇，溫潔儀，韓萍，等.葛根素對大鼠乳房脂肪組織增殖的影響及其機制研究[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2021，30（3）：93-98.