雷 鑫，蔡璐瑤，陳 蓉，黃世偉，張 俊，吳 恒，龍 飛，呂光華,

HPLC測定川西合耳菊中黃酮類和酚酸類藥效成分的含量

雷 鑫1，蔡璐瑤1，陳 蓉2*，黃世偉1，張 俊1，吳 恒1，龍 飛1，呂光華1, 2**

1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 611137 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)民族醫(yī)藥學(xué)院，四川 成都 611137

建立藏藥川西合耳菊中黃酮類和酚酸類藥效成分含量測定的方法，并評價不同產(chǎn)地、不同部位樣品的質(zhì)量。建立HPLC測定川西合耳菊中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、煙花苷、紫云英苷、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 8種有效成分含量的方法。從西藏、四川和青海收集了19份川西合耳菊藥材樣品；將全株植物分成莖、葉、花3個部位，測定這些樣品中8種成分的含量。運(yùn)用主成分分析法比較不同產(chǎn)地藥材中的藥效成分，以及植物不同部位之間和同一部位不同產(chǎn)地樣品之間差異。這8種藥效成分在40 min內(nèi)分離良好，加樣回收率為96.3%～104.9%。19份川西合耳菊樣品中3種酚酸類成分的總量為5種黃酮類成分總量的2.77倍。酚酸類以綠原酸的含量最高（9.74 mg/g）；黃酮類以蘆丁的含量最高（3.65 mg/g）。根據(jù)藥效成分含量和主成分分析，四川道孚的樣品質(zhì)量更好。植物3個部位之間比較，總量以葉中含量最高，占59.15%～65.61%；其次為花，占30.52%～34.31%；莖中的含量最低，僅占3.9%～5.7%。金絲桃苷在花中的含量高，而其他7種成分在葉中的含量最高。建立的方法能準(zhǔn)確測定川西合耳菊中5種黃酮類和3種酚酸類成分的含量，評價其質(zhì)量。川西合耳菊葉和花的藥效成分含量高，應(yīng)于開花期、葉茂盛時采集，并防止葉和花脫落，以保證質(zhì)量。

川西合耳菊；HPLC；蘆?。唤鸾z桃苷；異槲皮苷；煙花苷；紫云英苷；綠原酸；異綠原酸A；異綠原酸C

常用藏藥葉格興嘎保來源于菊科植物川西合耳菊(Hand. -Mazz.) C. Jeffrey et Y. L. Chen的干燥地上部分，具有清肝膽諸熱、清熱解毒的功效，主治傷口發(fā)炎、腫脹、急性結(jié)膜炎、瘡癰、皮炎等疾病[1-2]。川西合耳菊主要分布于西藏東部和四川西部海拔2900～3900 m高原地區(qū)，于夏季至秋季開花期采收野生植物的地上部分入藥[3]，藥材的質(zhì)量差異很大，目前沒有質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

現(xiàn)代研究表明，川西合耳菊含黃酮類、酚酸類、倍半萜類等化學(xué)成分[4-7]。其中黃酮類成分異槲皮苷、金絲桃苷、蘆丁、紫云英苷、煙花苷和酚酸類成分綠原酸、異綠原酸等具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗衰老、抗抑郁、抗氧化等藥理作用[8-15]，與該藏藥的清熱解毒功效相符，可作為該藥材質(zhì)量評價的指標(biāo)性成分。

目前，對川西合耳菊中藥效成分的含量測定主要集中于黃酮類。蔡霞等[16]采用HPLC測定了川西合耳菊中綠原酸、金絲桃苷和木犀草苷的含量。王偉玲等[17]采用HPLC測定了紅纓合耳菊中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、煙花苷、紫云英苷等成分。然而，未見川西合耳菊中異綠原酸A、異綠原酸C的含量測定報道。同時，二者均選擇350 nm為檢測波長。由于黃酮類化合物的乙醇溶液在200～400 nm有2個主要的吸收帶，即峰帶I（300～400 nm）及峰帶II（220～280 nm），350 nm不是最大吸收波長。

為此，本實(shí)驗(yàn)通過優(yōu)化色譜條件，建立了HPLC同時測定川西合耳菊中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、煙花苷、紫云英苷、綠原酸、異綠原酸A和異綠原酸C 8種有效成分含量的方法；并從四川、西藏、青海不同產(chǎn)地或藥材市場收集了19份川西合耳菊樣品，將藥材分為莖、葉、花不同部位，測定和比較這8種藥效成分在不同產(chǎn)地和不同部位之間的差異，以期為川西合耳菊的質(zhì)量評價、采收、加工等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Dionex Ulti-Mate 3000高效液相色譜儀（包括四元泵處理器、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器以及Chromeleon7色譜工作站，美國賽默飛公司）；KH-250DB型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；HC-2518型高速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；PHS-3C＋智能酸度計（成都世紀(jì)方舟科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

蘆丁（批號CHB190110）、異槲皮苷（批號CHB180628）、煙花苷（批號CHB190102）、紫云英苷（批號CHB181115）、綠原酸（批號CHB190121）、異綠原酸A（批號CHB180921）、異綠原酸C（批號CHB180925）均購于成都克洛瑪生物科技有限公司；金絲桃苷（批號PS011441）購于成都普思生物科技股份有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。乙醇為分析純，甲酸、乙腈均為色譜純，購于成都市科隆化學(xué)品有限公司。超純水由默克Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)制備。

1.3 樣品

19份川西合耳菊樣品分別從西藏、四川和青海采收（表1），由成都中醫(yī)藥大學(xué)呂光華教授鑒定為菊科植物川西合耳菊(Hand. -Mazz.) C. Jeffrey et Y. L. Chen的干燥地上部分。

2 方法

2.1 樣品處理

將12份花、葉較多的藥材全株樣品分為莖、葉、花3個部位；所有采集樣品陰干后，與從藥材市場上購買的樣品，分別粉碎，過三號篩，待用。

表1 川西合耳菊樣品的來源及收集時間

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取川西合耳菊樣品粉末1.0 g，置于100 mL的錐形瓶中，加70%乙醇20 mL，稱定質(zhì)量；超聲（700 W、40 kHz）提取85 min，稱定質(zhì)量；加70%乙醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻。吸取上清液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，濾液即為供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸10.0 mg、蘆丁5.0 mg、金絲桃苷2.0 mg、異槲皮苷2.0 mg、煙花苷1.0 mg、異綠原酸A 10.0 mg、紫云英苷1.0 mg、異綠原酸C 3.0 mg置于10 mL量瓶中，加70%乙醇溶解，定容至刻度，搖勻，即得到1.0 mg/mL綠原酸、0.5 mg/mL蘆丁、0.2 mg/mL金絲桃苷、0.2 mg/mL異槲皮苷、0.1 mg/mL煙花苷、1.0 mg/mL異綠原酸A、0.1 mg/mL紫云英苷、0.3mg/mL異綠原酸C的對照品混合溶液。

2.4 色譜條件

色譜柱為Ultimate C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（pH值2.56，B），洗脫梯度（0～8 min，11% A；8～10 min，11%～16% A；10～25 min，16% A；25～36 min，16%～18% A；36～40 min，18%～20% A；40～50 min，20%～24% A）；體積流量1.0 mL/min；柱溫40 ℃；檢測波長265 nm；進(jìn)樣量10 μL。在此條件下，川西合耳菊樣品中這8種藥效成分的色譜峰分離良好（圖1）。

1-綠原酸 2-蘆丁 3-金絲桃苷 4-異槲皮苷 5-煙花苷 6-異綠原酸A 7-紫云英苷 8-異綠原酸C

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 吸取上述8個成分的對照品混合溶液0.1、0.5、1、2、3、4、5 mL置于5 mL量瓶中，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，得到7個質(zhì)量濃度梯度的對照品混合溶液。再依選定的色譜條件進(jìn)樣（10 μL），測定各成分的峰面積。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），以峰面積為縱坐標(biāo)（），計算回歸方程（表2）。這8種成分的相關(guān)系數(shù)（2）在0.999 1～0.999 9。

表2 8種藥效成分的線性范圍

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取1份對照品混合溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定這8種成分色譜峰的峰面積。綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、煙花苷、異綠原酸A、紫云英苷、異綠原酸C峰面積的RSD值分別為0.59%、0.92%、0.92%、0.93%、0.92%、0.94%、0.91%、0.97%。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取1份供試品溶液（5號樣品），分別在制備后1、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣測定，計算這8種成分色譜峰峰面積的RSD值。綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、煙花苷、異綠原酸A、紫云英苷、異綠原酸C的RSD值分別為0.45%、1.18%、1.54%、0.60%、0.52%、0.90%、1.51%、0.99%。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 稱取同一份川西合耳菊樣品粉末1.0 g，共6份，按上述方法制備成6份供試品溶液，測定這8種成分的含量。綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、煙花苷、異綠原酸A、紫云英苷、異綠原酸C質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為3.20%、3.22%、2.77%、2.26%、2.23%、2.99%、3.36%、2.95%。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一份（5號樣品）已測定這8種成分含量的川西合耳菊樣品粉末0.50 g，共6份，分別加入與樣品中8種成分含量相當(dāng)?shù)膶φ掌啡芤海苽涑杉訕庸┰嚻啡芤?；測定8種成分的量，再計算加樣回收率。綠原酸、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、煙花苷、異綠原酸A、紫云英苷、異綠原酸C的回收率分別為96.3%、104.8%、104.2%、97.3%、104.9%、104.3%、96.7%、103.5%，RSD值分別為1.65%、1.02%、1.92%、1.19%、2.73%、1.85%、2.55%、1.74%。

2.6 樣品測定

精密稱川西合耳菊樣品粉末，每份藥材樣品稱取2份，分別按“2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按“2.4”項(xiàng)色譜條件測定這8種成分的含量；2份重復(fù)結(jié)果的平均絕對偏差（ADM，absolute deviation from the mean）不得大于5%。再計算2份平行樣品中這8種成分的平均含量。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同產(chǎn)地川西合耳菊藥材中藥效成分之間的比較

分別從西藏拉薩和林芝、四川道孚和茂縣，青海西寧收集了19份川西合耳菊藥材，測定了樣品中這8種藥效成分的含量（表3）。結(jié)果表明，在這些樣品中，綠原酸的含量最高（9.74 mg/g），其次為異綠原酸A（8.57 mg/g）、蘆丁（3.65 mg/g）；而紫云英苷的含量最低（0.34 mg/g）。3種酚酸類成分的總量（20.56 mg/g）為5種黃酮類成分總量（7.40 mg/g）的2.78倍。這些成分具有抗炎、抗菌等作用，與該藥的清熱解毒功效相符，可評價其質(zhì)量。

表3 不同產(chǎn)地川西合耳菊樣品中8種藥效成分的含量(n＝2)

從總體上看，西藏林芝和拉薩與四川道孚藥材中的藥效成分含量相近（表4），這8種成分的總量相差4.77%；這2個產(chǎn)地樣品的含量分別高于四川茂縣的樣品66.65%和74.60%。

用統(tǒng)計軟件SPSS 22對其含量進(jìn)行主成分分析。相關(guān)矩陣的特征值計算結(jié)果表明，前2個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率為85.782%。故取前2個主成分進(jìn)行主成分分析。

表4 不同產(chǎn)地川西合耳菊樣品中8種藥效成分的平均含量

將這8種藥效成分含量的標(biāo)準(zhǔn)化值代入以下主成分公式：

1＝0.3871＋0.1242＋0.3683＋0.3754＋0.3905＋0.3926 ＋0.3087＋0.3988

2＝0.1991＋0.706z2＋0.1593－0.2344－0.2075＋0.1196 －0.5447 ＋0.1678

不同川西合耳菊樣品綜合得分（）公式：

＝(5.2241＋1.6382)/8

按上述公式計算各樣品主成分，得到綜合得分（圖2）。在西藏林芝和拉薩6份樣品中，3份為正數(shù)，3份為負(fù)數(shù)；在四川道孚6份樣品中，4份為正數(shù)，2份為負(fù)數(shù)；在四川茂縣6份樣品中，1份為正數(shù)，5份為負(fù)數(shù)。西藏林芝和拉薩、四川道孚、四川茂縣川西合耳菊樣品的綜合得分分別為0.622、0.708、?3.135。表明以這8種藥效成分含量為指標(biāo)，四川道孚的樣品質(zhì)量更好，其次為西藏林芝和拉薩、四川茂縣。

1～19-樣品編號

3.2 川西合耳菊不同部位藥效成分之間的比較

在對川西合耳菊的地上部分進(jìn)行干燥、包裝等過程中，發(fā)現(xiàn)葉、花容易脫落，造成不同樣品中莖、葉、花的比例不同，可能影響藥材質(zhì)量不同。為此，本研究將12份（編號2～5、8～12、16～18）從野外采集的花、葉較多的藥材全株分為莖、葉、花3個部位，分別測定這8種藥效成分的含量（表5）。結(jié)果表明，這些藥效成分在葉中的含量最高，這8種藥效成分的總量達(dá)到3個部位總和的59.15%～65.61%；其次為花，占30.52%～34.31%；在莖中的含量最低，僅占3.9%～5.7%。在這12份樣品的莖中，均未檢測到金絲桃苷、異槲皮苷、煙花苷、紫云英苷；多數(shù)樣品中未發(fā)現(xiàn)異綠原酸C；檢測出綠原酸、蘆丁和異綠原酸A含量較低，僅為葉和花中的9.99%和23.08%。

這8種藥效成分在莖、葉、花中的分布規(guī)律不同。總體趨勢是金絲桃苷在花中的含量高，其次為葉，在莖中的含量最低。而其他7種成分的含量在葉中最高，其次為花，莖中最低。由此可見，川西合耳菊應(yīng)在開花期采收；在采收、干燥、包裝、運(yùn)輸?shù)冗^程中，應(yīng)盡量避免葉和花脫落。同時，在制定川西合耳菊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，可參照《中國藥典》中薄荷、穿心蓮、廣藿香等藥材，規(guī)定藥材含葉量（20%～30%）[18]，以保證藥材的質(zhì)量。

3.3 不同產(chǎn)地川西合耳菊相同部位藥效成分之間的比較

由于不同產(chǎn)地川西合耳菊藥材的含葉量不同，為了比較不同產(chǎn)地樣品中這8種藥效成分之間的含量差異，對不同產(chǎn)地植株的相同部位進(jìn)行了比較（表6）。因其他產(chǎn)地樣品因花較少，故僅比較了西藏林芝、四川道孚、四川茂縣3個產(chǎn)地。

表5 川西合耳菊不同部位8種成分的含量(n＝3)

表6 川西合耳菊相同部位不同產(chǎn)地樣品中8種藥效成分總量之間的比較

結(jié)果表明，以這8種藥效成分的總量為指標(biāo)，在葉、花和莖中，四川道孚樣品中的含量均最高，分別高于西藏林芝樣品5.36%（葉）、26.99%（花）和67.9%（莖），高于四川茂縣樣品165.03%（葉）、156.11%（花）和124.85%（莖）。說明四川道孚產(chǎn)的川西合耳菊的質(zhì)量較好，其次是西藏林芝樣品和四川茂縣的樣品。這一結(jié)果與上述“3.1”項(xiàng)對川西合耳菊全株樣品的分析結(jié)果一致。

4 討論

川西合耳菊的地上部分為藏藥葉格興嘎保的基原植物。由于藥材采自于野生植物，質(zhì)量差異大。雖然文獻(xiàn)報道了對該藥材中綠原酸、蘆丁、金絲桃苷等幾種藥效成分的含量測定，但是現(xiàn)代研究中發(fā)現(xiàn)了一些新的藥效成分。本研究通過優(yōu)化提取方法和色譜條件，建立了HPLC同時測定川西合耳菊中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、煙花苷、紫云英苷、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸C 8種黃酮類和酚酸類成分含量的方法，增加了測定藥效成分的種類，分離效果好，方法操作簡便，準(zhǔn)確度高，可用于該藥材的質(zhì)量檢測。

川西合耳菊為闊葉植物，在藥材采收、加工等過程中，葉和花很容易脫落。本研究將藥材地上部分分為莖、葉、花3個部位，測定、比較了這些藥效成分的含量，發(fā)現(xiàn)這些藥效成分主要分布于葉和花中。由于植物不同部位的比例不同，藥材的質(zhì)量不同，建議川西合耳菊于開花期、葉片茂盛時采收。同時，在采收、干燥、包裝、運(yùn)輸和使用等過程中，應(yīng)盡量避免葉和花脫落。在制定川西合耳菊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)時，可規(guī)定含葉量，以保證藥材的質(zhì)量。

川西合耳菊分布于西藏東部和四川西部的高原地區(qū)，本研究比較了西藏林芝、四川道孚和四川茂縣的樣品中這8種藥效成分的含量。無論從藥材地上部分總體比較，還是莖、葉、花不同部位分別比較，四川道孚樣品的含量較高，質(zhì)量更好。

由于超聲提取法的操作簡單，提取效果好，本研究選擇超聲提取法，以70%乙醇為提取溶劑，以這8種藥效成分的總量為指標(biāo)，比較了提取時間30、45、60、70、85、100 min的提取效果，分別為17.52、20.31、21.81、22.18、22.23、22.07 mg/g。表明提取85 min為最高值，作為樣品的提取時間。

由于黃酮類化合物的乙醇溶液在200～400 nm范圍內(nèi)有2個主要紫外吸收帶，峰帶I位于300～400 nm，峰帶II位于220～280 nm。文獻(xiàn)中測定川西合耳菊中綠原酸、金絲桃苷、木犀草苷、蘆丁等成分的檢測波長為350 nm。本研究比較了這8種藥效成分各自的最大吸收波長，并結(jié)合各成分在樣品中的含量差異，選擇265 nm為檢測波長，獲得了較好的準(zhǔn)確度。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Determination of bioactive compounds belonging to flavonoids and phenolic acids inby HPLC

LEI Xin1, CAI Lu-yao1, CHEN Rong2, HUANG Shi-wei1, ZHANG Jun1, WU Heng1, LONG Fei1, LYU Guang-hua1, 2

1. School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China

To develop a method for quantifying the bioactive compounds belonging to the types of flavonoids and phenolic acids in the herb of, and to assess the quality of this herbal samples among different cultivating areas and plant parts.An HPLC method was developed to quantify the amounts of eight bioactive compounds, i.e. rutin, hyperoside, isoquercitrin, nicotiflorin, astragalin, chlorogenic acid, isochlorogenic acid A, and isochlorogenic acid C in this herb. A total of 19 herbal samples were collected from Tibet, Sichuan, and Qinghai in China. The whole plant was divided into three parts including stem, leaf, and flower. The amounts of the eight bioactive compounds in these samples were quantified. Principal component analysis (PCA) was used to compare the bioactive compounds in this herbal samples among different cultivating areas, various plant parts and same plant parts collected from different cultivating areas.The eight peaks of these bioactive components were separated well within 40 min. The recoveries of the eight compounds were 96.3%—104.9%. The total amount of three phenolic acids in 19 herbal samples was 2.77 folds of five flavonoids. The content of chlorogenic acid was the highest in phenolic acids (9.74 mg/g). The highest content among flavonoid compounds was rutin (3.65 mg/g). Both the content of bioactive components and the result of PCA indicated that the quality of herbal samples collected from Daofu of Sichuan was best among the three cultivation areas. Comparing the total amounts of eight bioactive compounds among the three parts of this plant, leaf was top one accounting for 59.15%—65.61%, flower was second accounting for 30.52%—34.31%, stem was third only accounting for 3.9%—5.7%. More amount of hyperoside was found in flowers, whilst the other seven components were found in high levels in leaves.The developed method is accurate to quantifying the levels of five flavonoids and three phenolic acids in this herb and can be used to assess its quality. The leaves and flowers of this herb contain high amount of bioactive components. This herb should be harvested during flowering and flourishing leaves. Moreover, the leaves and flowers should be prevented from lost for quality assurance.

(Hand. -Mazz.) C. Jeffrey et Y. L. Chen; HPLC; rutin; hyperoside; isoquercitrin; nicotiflorin; astragalin; chlorogenic acid; isochlorogenic acid A; isochlorogenic acid C

R286.2

A

0253 - 2670(2021)08 - 2414 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.026

2020-12-21

四川高?？蒲袆?chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計劃項(xiàng)目（18TD0017）；四川省藥品監(jiān)督管理局中藥（民族藥）標(biāo)準(zhǔn)提升項(xiàng)目（510201201904914）；成都中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)者學(xué)科人才科研提升計劃項(xiàng)目（CXTD2018018）

雷 鑫（1995—），男，碩士研究生，從事中藥品種、品質(zhì)及資源研究。Tel: 17844597995 E-mail: 1032332793@qq.com

呂光華，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中藥/民族藥鑒定及資源利用。Tel: (028)61800066 E-mail: lughcd@aliyun.com

陳 蓉，講師，碩士生導(dǎo)師，主要從事民族藥鑒定研究。Tel: (028)61801093 E-mail: chenrong@cdutcm.edu.cn.

[責(zé)任編輯 時圣明]