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        經(jīng)典名方桃核承氣湯物質(zhì)基準(zhǔn)關(guān)鍵質(zhì)量屬性研究

        2021-04-22 23:56:34關(guān)雅戈高曉燕蔣宇航劉雨涵苗家燕韓妮娜張志強(qiáng)
        中草藥 2021年8期
        關(guān)鍵詞:名方桂皮甘草酸

        關(guān)雅戈,羅 贛#,高曉燕*,蔣宇航,劉雨涵,韓 晨,苗家燕,韓妮娜,張志強(qiáng)*

        經(jīng)典名方桃核承氣湯物質(zhì)基準(zhǔn)關(guān)鍵質(zhì)量屬性研究

        關(guān)雅戈1,羅 贛1#,高曉燕1*,蔣宇航1,劉雨涵1,韓 晨1,苗家燕1,韓妮娜2,張志強(qiáng)2*

        1. 北京中醫(yī)藥大學(xué),北京 100029 2. 北京康仁堂藥業(yè)有限公司,北京 101301

        建立桃核承氣湯(Taohe Chengqi Decoction,TCD)物質(zhì)基準(zhǔn)的HPLC特征圖譜及指標(biāo)成分含量測(cè)定方法,闡明TCD物質(zhì)基準(zhǔn)的關(guān)鍵質(zhì)量屬性,構(gòu)建其質(zhì)量控制體系。特征圖譜1,色譜柱為Diamonsil鉆石二代C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),甲醇-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相,體積流量為1.0 mL/min,梯度洗脫,進(jìn)樣量為10 μL,柱溫30 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm;特征圖譜2,色譜柱為Diamonsil鉆石一代C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),甲醇-0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相,體積流量為1.0 mL/min,梯度洗脫,進(jìn)樣量為10 μL,柱溫35 ℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm。根據(jù)方中成分的極性差異,建立2張?zhí)卣鲌D譜,結(jié)果顯示,15批TCD物質(zhì)基準(zhǔn)相似度分別為0.928~0.992和0.809~0.995,共確定32個(gè)特征峰,并指認(rèn)苦杏仁苷、甘草苷、甘草酸銨、蘆薈大黃素、大黃酸5個(gè)共有成分。15批TCD物質(zhì)基準(zhǔn)的平均出膏率為19.10%,苦杏仁苷、甘草酸銨、桂皮醛、蘆薈大黃素、大黃酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.650~7.318、3.563~17.486、0.013~0.128、0.034~0.215、0.930~3.582 mg/g。為TCD物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量控制和復(fù)方制劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

        經(jīng)典名方;桃核承氣湯;物質(zhì)基準(zhǔn);關(guān)鍵質(zhì)量屬性;特征圖譜;HPLC;質(zhì)量控制;苦杏仁苷;甘草苷;甘草酸銨;蘆薈大黃素;大黃酸;桂皮醛;出膏率

        經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)是指以古代醫(yī)籍中記載的經(jīng)典名方制備方法為依據(jù)制備而得的中藥藥用物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn),除成型工藝外,其余制備方法應(yīng)當(dāng)與古代醫(yī)籍記載基本一致[1],是連接傳統(tǒng)制法與現(xiàn)代生產(chǎn)工藝的對(duì)照物質(zhì),是評(píng)價(jià)復(fù)方制劑與傳統(tǒng)湯劑一致性的準(zhǔn)繩[2-3]。經(jīng)典名方關(guān)鍵質(zhì)量屬性(critical quality attributes,CQAs)是指影響藥品安全性、有效性或一致性的物理、化學(xué)、生物活性等質(zhì)量屬性[4],在經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)研究中,CQAs主要包括特征圖譜、指標(biāo)性成分含量、出膏率。從傳統(tǒng)湯劑、物質(zhì)基準(zhǔn)到復(fù)方制劑,在經(jīng)典名方的開發(fā)研究中CQAs不可或缺。《中藥經(jīng)典名方復(fù)方制劑簡(jiǎn)化注冊(cè)審批管理規(guī)定(征求意見稿)》亦要求,經(jīng)典名方制劑的研制包括物質(zhì)基準(zhǔn)和復(fù)方制劑2個(gè)階段,應(yīng)保證二者CQAs一致[1]。

        桃核承氣湯(Taohe Chengqi Decoction,TCD)出自東漢張仲景所著《傷寒論》,主治下焦蓄血證。全方由桃仁、大黃、桂枝、甘草和芒硝組成[5]。其中桃仁與大黃并用,活血破瘀瀉熱;芒硝助大黃下瘀、瀉熱;桂枝助桃仁活血化瘀;甘草和中,緩和諸藥峻烈之性;5藥合用共奏破血下瘀之效。TCD常用于閉經(jīng)、子宮內(nèi)膜異位癥、崩漏以及不孕癥,同時(shí)在治療慢性腎功能衰竭、糖尿病等疾病應(yīng)用廣泛[6-11]。

        目前未見關(guān)于TCD物質(zhì)基準(zhǔn)CQAs研究的報(bào)道,針對(duì)此問題,本實(shí)驗(yàn)建立TCD物質(zhì)基準(zhǔn)HPLC特征圖譜,依據(jù)處方配伍和文獻(xiàn)研究,確定桃仁中苦杏仁苷、甘草中甘草酸銨、桂枝中桂皮醛、大黃中蘆薈大黃素及大黃酸作為TCD物質(zhì)基準(zhǔn)指標(biāo)成分并建立其含量測(cè)定方法,聯(lián)合HPLC特征圖譜和出膏率共同構(gòu)建TCD物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量控制體系,以期為其復(fù)方制劑的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

        1 儀器與材料

        1.1 儀器

        Thermo Fisher Ultimate 3000高效液相色譜儀,DAD檢測(cè)器,CM7.2色譜工作站,美國(guó)Thermo- Fisher公司;Sorvall ST 8R高速冷凍離心機(jī),賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;XP-6型百萬分之一精密天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;KQ5200DA超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司;Milli-Q超純水系統(tǒng),美國(guó)Millipore公司;陶瓷鍋,曼達(dá)尼旗艦店;LC-E013S電陶爐,廣東順德忠臣電器有限公司;SHB-III循環(huán)水式多用真空泵,鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

        1.2 試藥

        TCD中各藥材產(chǎn)地信息見表1。經(jīng)前期研究確定大黃、桃仁、甘草的炮制方法后,由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供各批次藥材和飲片。方中各藥材經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)楊瑤珺教授鑒定分別為薔薇科桃屬植物山桃(Carr.) Franch.的干燥成熟種子,蓼科大黃屬植物唐古特大黃Maxim. ex Balf.的干燥根和根莖,豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖,樟科樟屬植物肉桂Presl的干燥嫩枝,硫酸鹽類礦物芒硝族芒硝,經(jīng)加工精制而成的結(jié)晶體。

        對(duì)照品苦杏仁苷(批號(hào)DST190829-004)、甘草苷(批號(hào)DST190702-009)、甘草酸銨(批號(hào)DST190702-008)購(gòu)自成都德思特生物技術(shù)有限公司;對(duì)照品桂皮醛(批號(hào)110710-201418)、大黃酸(批號(hào)110757-201607)、蘆薈大黃素(批號(hào)110795- 201710)、大黃素(批號(hào)110756-201913)、大黃酚(批號(hào)110796-201621)、大黃素甲醚(批號(hào)110758- 201616)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院,上述對(duì)照品均為HPLC含量測(cè)定用,質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于98%。色譜純乙腈、甲醇,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;實(shí)驗(yàn)室自制超純水,其他試劑均為分析純。

        2 方法與結(jié)果

        2.1 TCD物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)應(yīng)實(shí)物的制備

        《傷寒論》記載TCD的處方及制法為“桃仁五十個(gè)(去皮尖),大黃四兩,桂枝二兩(去皮),甘草二兩(炙),芒硝二兩,右五味,以水七升,煮取二升半,去滓,內(nèi)芒硝,更上火,微沸下火,先食溫服五合,日三服,當(dāng)微利?!苯?jīng)文獻(xiàn)考證[11-13]確定東漢一兩相當(dāng)于今之13.8 g,一升相當(dāng)于200 mL,故確定處方劑量為燀桃仁50枚、大黃55.2 g、炙甘草27.6 g、桂枝27.6 g、芒硝27.6 g。取處方量的各飲片,置3 L陶瓷鍋中,加入1400 mL去離子水,武火煮沸后,轉(zhuǎn)文火煎煮至約500 mL,濾過,加入芒硝27.6 g,文火煮至微沸,放冷后定容至500 mL,即得標(biāo)準(zhǔn)煎液。取上述標(biāo)準(zhǔn)煎液適量,4 ℃、9000 r/min離心20 min后,精密量取上清液50 mL,冷凍干燥,即得。

        表1 TCD藥材來源及批號(hào)信息

        將表1中各批次各單味飲片隨機(jī)取樣組合得15批TCD物質(zhì)基準(zhǔn)S1~S15。

        2.2 TCD物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜研究

        2.2.1 色譜條件

        (1)特征圖譜1:Diamonsil鉆石二代C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脫:0~3 min,20%~30%甲醇;3~30 min,30%~45%甲醇;30~55 min,45%~70%甲醇;55~80 min,70%~80%甲醇;80~85 min,80%甲醇;85~90 min,80%~95%甲醇;90~95 min,95%~100%甲醇;95~100 min,100%甲醇;柱溫30 ℃;體積流量1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

        (2)特征圖譜2:Diamonsil鉆石一代C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相甲醇-0.2%磷酸水溶液,梯度洗脫:0~10 min,10%甲醇;10~50 min,10%~25%甲醇;柱溫35 ℃;體積流量1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

        2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取苦杏仁苷對(duì)照品適量,加70%甲醇制得質(zhì)量濃度為1.770 mg/mL的苦杏仁苷對(duì)照品溶液;精密稱取甘草苷和甘草酸銨對(duì)照品適量,加甲醇制得質(zhì)量濃度分別為16.72、42.20 μg/mL的甘草苷、甘草酸銨混合對(duì)照品溶液;精密稱取桂皮醛對(duì)照品適量,加甲醇制得質(zhì)量濃度為942.58 μg/mL的桂皮醛對(duì)照品溶液;取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量,加甲醇制得質(zhì)量濃度分別為213、660、205、209、244 μg/mL的大黃蒽醌類成分混合對(duì)照品溶液。

        2.2.3 供試品溶液的制備

        (1)TCD物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液制備:取適量物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉,加去離子水定容至10 mL,4 ℃、13 000 r/min離心20 min,取上清液,即得。

        (2)各單味藥及陰性樣品供試品溶液制備:取處方劑量各單味藥飲片及分別缺桃仁、大黃、甘草、桂枝、芒硝的處方量飲片,按“2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)煎液制備方法制備后,按上述供試品溶液制備方法制備,即得。

        2.2.4 方法學(xué)考察

        (1)參照峰的選擇:特征圖譜1中,大黃酸含量較高,色譜峰較穩(wěn)定,故選擇大黃酸的色譜峰(23)作為特征圖譜1的參照峰,計(jì)算特征圖譜1中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積;特征圖譜2中,27號(hào)共有峰含量較高,色譜峰較穩(wěn)定,故選擇27號(hào)共有峰作為特征圖譜2的參照峰,計(jì)算特征圖譜2中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

        (2)精密度試驗(yàn):同一批物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄譜圖,結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均<0.27%,相對(duì)峰面積RSD均<3%,表明儀器精密度良好。

        (3)重復(fù)性試驗(yàn):同一批次6份物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件,測(cè)定特征圖譜,結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均<0.56%,相對(duì)峰面積RSD均<3%,表明方法重復(fù)性良好。

        (4)穩(wěn)定性試驗(yàn):同一批物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液,按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件,將樣品置于室溫下,于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣,結(jié)果顯示各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD均<0.58%,相對(duì)峰面積RSD均<3%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        2.2.5 TCD物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜的建立

        (1)特征圖譜1的建立:取15批物質(zhì)基準(zhǔn)、各單味藥及陰性對(duì)照樣品,按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,按“2.2.1(1)”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè),將數(shù)據(jù)導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012年版)軟件,以第1批的HPLC圖譜為參照,采用平均數(shù)法,進(jìn)行多點(diǎn)校正和色譜峰匹配,自動(dòng)匹配得到15批物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜疊加圖及共有模式,如圖1所示,以生成的共有模式為參照,15批物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均大于0.92。

        根據(jù)特征圖譜分析結(jié)果,將TCD物質(zhì)基準(zhǔn)與各單味藥及其陰性樣品HPLC譜圖進(jìn)行比對(duì),確定出峰情況良好、無陰性干擾的色譜峰為各藥味特征峰。特征圖譜1共確定23個(gè)特征峰,特征峰1~4、6~21、23為大黃特征峰,特征峰5、22為甘草特征峰。經(jīng)與對(duì)照品比對(duì),指認(rèn)出4個(gè)共有成分,分別是5號(hào)峰甘草苷、21號(hào)峰蘆薈大黃素、22號(hào)峰甘草酸銨和23號(hào)峰大黃酸。

        (2)特征圖譜2的建立:按“2.2.1(2)”項(xiàng)下色譜條件檢測(cè),同“2.2.5(1)”項(xiàng)操作,結(jié)果如圖2所示,以生成的共有模式為參照,15批TCD物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度均大于0.8。

        根據(jù)特征圖譜分析結(jié)果,將TCD物質(zhì)基準(zhǔn)與各單味藥及其陰性樣品HPLC譜圖進(jìn)行比對(duì),確定出峰情況良好、無陰性干擾的色譜峰為各藥味特征峰。特征圖譜2共確定9個(gè)特征峰,特征峰24~27、30~32為大黃特征峰,特征峰28為甘草特征峰,特征峰29為桃仁特征峰。經(jīng)與對(duì)照品HPLC圖譜比對(duì),指認(rèn)出2個(gè)共有成分,分別是24號(hào)峰沒食子酸、29號(hào)峰苦杏仁苷。

        2.3 指標(biāo)成分含量測(cè)定研究

        2.3.1 色譜條件

        (1)大黃蒽醌類成分和甘草酸銨含量測(cè)定:Diamonsil C18鉆石二代色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液,梯度洗脫:0~3 min,20%~30%甲醇;3~30 min,30%~45%甲醇;30~55 min,45%~70%甲醇;55~80 min,70%~80%甲醇;80~85 min,80%甲醇;85~90 min,80%~95%甲醇;90~95 min,95%~100%甲醇;95~100 min,100%甲醇;柱溫30 ℃;體積流量1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

        (2)苦杏仁苷含量測(cè)定:Diamonsil C18鉆石一代色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為甲醇-0.2%磷酸水溶液,梯度洗脫:0~10 min,10%甲醇;10~50 min,10%~23%甲醇;柱溫38 ℃;體積流量1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

        5-甘草苷 21-蘆薈大黃素 22-甘草酸銨 23-大黃酸 a-桂皮醛 b-大黃素 c-大黃酚 d-大黃素甲醚

        圖2 15批TCD物質(zhì)基準(zhǔn)的HPLC特征圖譜2 (S1~S15)、對(duì)照?qǐng)D譜2 (R)、混合對(duì)照品HPLC色譜圖(X)

        (3)桂皮醛含量測(cè)定:Diamonsil C18鉆石二代色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相為乙腈- 0.1%磷酸水溶液,梯度洗脫:0~15 min,3%~32%甲醇;15~60 min,32%甲醇;柱溫30 ℃;體積流量1 mL/min;進(jìn)樣量10 μL;檢測(cè)波長(zhǎng)290 nm。

        2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

        (1)甘草酸銨對(duì)照品溶液制備:精密稱取甘草酸銨對(duì)照品適量,加甲醇制得質(zhì)量濃度分別為1.235 mg/mL的甘草酸銨對(duì)照品溶液。

        (2)桂皮醛、苦杏仁苷、大黃蒽醌類成分混合對(duì)照品溶液制備:同“2.2.2”項(xiàng)下桂皮醛、苦杏仁苷、大黃蒽醌類成分混合對(duì)照品溶液配制。

        2.3.3 供試品溶液制備 取適量物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉,加30%甲醇定容至5 mL,4 ℃、13 000 r/min離心20 min,取上清液進(jìn)行苦杏仁苷、甘草酸銨、桂皮醛、蘆薈大黃素、大黃酸含量測(cè)定。

        2.3.4 方法學(xué)考察

        (1)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn):按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定混合對(duì)照品溶液、TCD物質(zhì)基準(zhǔn)的供試品溶液、各單味藥及其陰性樣品溶液,結(jié)果表明樣品中各指標(biāo)成分的分離度均大于1.5、理論塔板數(shù)均大于9900,且陰性無干擾,可進(jìn)行含量測(cè)定,典型圖譜如圖3~6所示。

        (2)線性關(guān)系考察:精密吸取“2.3.2”項(xiàng)下各指標(biāo)成分對(duì)照品儲(chǔ)備液,分別用倍比稀釋法配制成系列對(duì)照品溶液,按“2.3.1”項(xiàng)下各色譜條件分析,記錄色譜圖及峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(),質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(),分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,如表2所示。結(jié)果表明,苦杏仁苷、甘草酸銨、桂皮醛、蘆薈大黃素、大黃酸在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

        圖3 TCD物質(zhì)基準(zhǔn) (a)、缺大黃陰性樣品 (b)、大黃單味藥樣品 (c)、混合對(duì)照品(d) 的HPLC圖譜

        圖4 TCD物質(zhì)基準(zhǔn) (a)、甘草陰性樣品 (b)、甘草單味藥樣品 (c)、混合對(duì)照品(d) 的HPLC圖譜

        圖5 TCD物質(zhì)基準(zhǔn) (a)、桂枝陰性樣品 (b)、桂枝單味藥樣品 (c)、桂皮醛對(duì)照品(d) 的HPLC圖譜

        圖6 TCD物質(zhì)基準(zhǔn) (a)、桃仁陰性樣品 (b)、桃仁單味藥樣品 (c)、苦杏仁苷對(duì)照品(d) 的HPLC圖譜

        (3)精密度試驗(yàn):同一批物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果顯示苦杏仁苷、甘草酸銨、桂皮醛、蘆薈大黃素、大黃酸峰面積的RSD值分別為0.68%、1.32%、2.02%、0.60%、0.29%,表明儀器精密度良好。

        (4)穩(wěn)定性試驗(yàn):同一批物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件,分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析,結(jié)果顯示苦杏仁苷、甘草酸銨、桂皮醛、蘆薈大黃素、大黃酸峰面積的RSD值分別為1.96%、1.67%、2.66%、2.50%、2.66%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

        表2 TCD物質(zhì)基準(zhǔn)對(duì)應(yīng)實(shí)物中各指標(biāo)成分含量測(cè)定方法學(xué)考察

        (5)重復(fù)性試驗(yàn):同一批物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液6份,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析,結(jié)果顯示苦杏仁苷、甘草酸銨、桂皮醛、蘆薈大黃素、大黃酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD值分別為1.87%、1.40%、1.64%、1.29%、2.55%,表明該方法重復(fù)性良好。

        (6)加樣回收率試驗(yàn):取已測(cè)定各指標(biāo)成分含量的TCD第7批物質(zhì)基準(zhǔn)凍干粉適量,精密稱定,分別以指標(biāo)成分含量的50%、100%、150%加入各指標(biāo)成分對(duì)照品儲(chǔ)備液各3份,按“2.3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液;按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算苦杏仁苷、甘草酸銨、桂皮醛、蘆薈大黃素、大黃酸的回收率。結(jié)果如表2所示,各指標(biāo)成分平均加樣回收率均在95%~105%,RSD在2.65%~4.36%,結(jié)果表明加樣回收率良好。

        2.3.5 樣品含量測(cè)定 采用“2.3.3”項(xiàng)下方法分別制備15批物質(zhì)基準(zhǔn)供試品溶液,按“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見表3。15批物質(zhì)基準(zhǔn)中苦杏仁苷、甘草酸銨、桂皮醛、蘆薈大黃素、大黃酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2.650~7.318、3.563~17.486、0.013~0.128、0.034~0.215、0.930~3.582 mg/g。

        2.4 出膏率測(cè)定

        按“2.1”項(xiàng)下方法制備15批物質(zhì)基準(zhǔn)樣品,測(cè)定其出膏率,計(jì)算公式為出膏率=/[14],式中表示物質(zhì)基準(zhǔn)樣品的質(zhì)量,表示飲片投料量,結(jié)果見表3。結(jié)果表明15批物質(zhì)基準(zhǔn)的平均出膏率為19.10%,RSD為11.90%,均未出現(xiàn)離散數(shù)據(jù)(平均值的70%~130%以外)。

        3 討論

        CQAs是保證產(chǎn)品質(zhì)量的物理、化學(xué)、生物或微生物的性質(zhì)或特征,這些性質(zhì)或特征應(yīng)有適當(dāng)?shù)南薅?、范圍或分布[15]。在經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)研究中CQAs指影響藥品安全性、有效性或一致性的質(zhì)量屬性[2]。特征圖譜從整體層面對(duì)藥材、飲片質(zhì)量穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)和控制,在一定程度上可以較全面地反映經(jīng)典名方中各藥味有效成分的數(shù)與量[16],進(jìn)而反映經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)質(zhì)量信息的完整概貌。經(jīng)典名方藥效的發(fā)揮是多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的結(jié)果,僅單一成分含量不足以反映經(jīng)典名方的整體質(zhì)量,多指標(biāo)成分含量測(cè)定可完善經(jīng)典名方質(zhì)量控制體系[17]。出膏率是考察制備工藝是否穩(wěn)定、均一的整體性指標(biāo)參數(shù)[18],直接影響中藥復(fù)方質(zhì)量穩(wěn)定性和均一性,其波動(dòng)對(duì)含量有極大影響。因此確定經(jīng)典名方物質(zhì)基準(zhǔn)的CQAs為特征圖譜、指標(biāo)成分含量測(cè)定和出膏率。

        表3 15批TCD物質(zhì)基準(zhǔn)中5種指標(biāo)成分的含量及出膏率

        經(jīng)典名方的CQAs具有安全性、有效性、一致性的特性[2]。本方共5味中藥,根據(jù)中藥復(fù)方君、臣、佐、使的配伍原則,優(yōu)先選擇方中君藥(桃仁、大黃)、臣藥(桂枝)、佐藥(甘草)的指標(biāo)成分作為質(zhì)量控制的指標(biāo)[19]。有研究表明,桃仁水提物、苦杏仁苷、桃仁脂肪油對(duì)二磷酸腺苷誘導(dǎo)的血小板聚集有不同程度的抑制作用[20]。大黃中的蒽醌類化合物具有抗炎、抗腫瘤、保護(hù)心血管、保肝、護(hù)肺等生物活性[21]。甘草酸類具有抗病毒、抗癌、免疫調(diào)節(jié)[22]等作用。比較桂枝、桃仁配伍與單味藥給藥小鼠后對(duì)小鼠出、凝血時(shí)間和凝血酶時(shí)間影響,證實(shí)桂枝-桃仁配伍后較單藥桂枝抗凝血作用更強(qiáng),臨床上用來治療瘀血內(nèi)結(jié)的各種病證,桂枝中主要揮發(fā)性成分為桂皮醛,具有一定的抗凝血作用[23]。

        本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行關(guān)鍵質(zhì)量屬性研究以各藥味均有質(zhì)控指標(biāo)為原則,《中國(guó)藥典》2020年版將甘草苷、甘草酸銨均作為甘草的質(zhì)控指標(biāo),在進(jìn)行特征圖譜研究時(shí)發(fā)現(xiàn),經(jīng)過多次色譜條件優(yōu)化,甘草苷出峰仍不滿足分離度大于1.5要求且陰性干擾嚴(yán)重,因此只對(duì)甘草酸銨進(jìn)行含量測(cè)定。同時(shí),桂皮醛是《中國(guó)藥典》2020年版桂枝的質(zhì)控指標(biāo),在特征圖譜研究中,桂皮醛存在陰性干擾,無法對(duì)其進(jìn)行特征峰指認(rèn),因此,本實(shí)驗(yàn)建立了桂皮醛含量測(cè)定方法,排除陰性干擾,對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制。綜上所述,指標(biāo)成分的選擇以《中國(guó)藥典》2020年版中各單味藥含量測(cè)定指標(biāo)性成分為依據(jù),結(jié)合TCD方解與藥效,基于CQAs有效性特性綜合分析確定TCD指標(biāo)性成分為苦杏仁苷、蘆薈大黃素、大黃酸、桂皮醛、甘草酸銨。

        目前,對(duì)TCD化學(xué)成分研究鮮有報(bào)道,多為提取工藝的優(yōu)化及對(duì)某些指標(biāo)成分的含量測(cè)定[24-26],缺乏對(duì)其質(zhì)量的整體評(píng)價(jià)研究。本研究中,由于處方組成及成分信息繁雜,大黃與桃仁共為君藥,劑量相差4倍,各成分峰面積差異很大,為了更全面地反映全方藥味信息,兼顧強(qiáng)、弱極性成分在色譜圖上的保留情況,本研究建立了2張?zhí)卣鲌D譜。

        本研究分別考察了在甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸水溶液、甲醇-0.2%磷酸水溶液3種不同的流動(dòng)相體系下色譜峰的分離情況,結(jié)果顯示甲醇-0.1%磷酸水溶液對(duì)于極性小成分有較好的色譜峰峰形,分離度較好,無明顯拖尾,故將甲醇-0.1%磷酸水溶液應(yīng)用于特征圖譜1,用于中等偏弱極性成分的分析;甲醇-0.2%磷酸水溶液對(duì)于極性大成分有較好的色譜峰峰形,分離度較好,無明顯拖尾,故將甲醇-0.2%磷酸水溶液應(yīng)用于特征圖譜2,用于中等偏強(qiáng)極性成分的分析。

        本研究同時(shí)考察不同柱溫對(duì)TCD各指標(biāo)成分分離度的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在30~35 ℃,柱溫升高,大黃酸與甘草酸銨分離度變差,苦杏仁苷與周圍成分的分離度改善,這表明溫度升高不利于大黃酸和甘草酸銨的分離,但能夠改善苦杏仁苷的分離情況。因此,選擇30、35 ℃分別作為物質(zhì)基準(zhǔn)特征圖譜1、2的柱溫。

        由于TCD中大黃的處方量為4兩(55.2 g),水煎液非常渾濁,為防止HPLC分析出現(xiàn)管路堵塞的問題,因此TCD水煎液凍干前進(jìn)行離心處理,除去大部分沉淀。本實(shí)驗(yàn)考察4、25 ℃ 2個(gè)離心溫度,發(fā)現(xiàn)2種溫度處理所得供試品溶液的特征圖譜差異較小,為盡量避免溫度對(duì)成分產(chǎn)生的潛在影響,確定4 ℃為離心溫度。

        特征圖譜結(jié)果顯示15批物質(zhì)基準(zhǔn)的特征圖譜2相似度均大于0.8。其中僅第4批物質(zhì)基準(zhǔn)樣品相似度為0.809,其余批次的相似度均大于0.90。經(jīng)比對(duì)發(fā)現(xiàn),27號(hào)共有峰所對(duì)應(yīng)的化學(xué)成分對(duì)整體評(píng)價(jià)貢獻(xiàn)較大,使得第4批物質(zhì)基準(zhǔn)的相似度相比其他批次有明顯的降低。第4批物質(zhì)基準(zhǔn)的大黃來源于青海海西,結(jié)果顯示該產(chǎn)地所產(chǎn)大黃和其余批次的大黃相比具有明顯的質(zhì)量差異,這表明產(chǎn)地對(duì)大黃質(zhì)量具有非常明顯的影響,進(jìn)而影響物質(zhì)基準(zhǔn)的整體質(zhì)量。

        綜上,本實(shí)驗(yàn)通過建立TCD物質(zhì)基準(zhǔn)HPLC特征圖譜及各指標(biāo)成分含量測(cè)定方法,明確其出膏率范圍,初步闡明TCD物質(zhì)基準(zhǔn)的CQAs,構(gòu)建了TCD物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量控制體系,為TCD物質(zhì)基準(zhǔn)的質(zhì)量控制和復(fù)方制劑開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

        利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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        Study on critical quality attributes of classical prescription substance benchmarks of Taohe Chengqi Decoction

        GUAN Ya-ge1, LUO Gan1, GAO Xiao-yan1, JIANG Yu-hang1, LIU Yu-han1, HAN Chen1, MIAO Jia-yan1, HAN Ni-na2, ZHANG Zhi-qiang2

        1. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029, China 2. Beijing Tcmages Pharmaceutical Co., Ltd., Beijing 101301, China

        To establish the HPLC characteristic chromatogram and content determination method of index components in Taohe Chengqi Decoction (TCD) substance benchmarks, which clarified the critical quality attributes and constructed the quality control system.For characteristic chromatogram 1, the separation was performed on the Diamonsil diamond second- generation C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm) at 30 ℃. The mobile phase consisted of methanol and water with 0.1% phosphoric acid at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 254 nm; Characteristic chromatographic 2 analysis was performed using the Diamonsil diamond first-generation C18column (250 mm × 4.6 mm, 5 μm). Methanol and 0.2% phosphoric acid aqueous solution were utilized as the mobile phases. The flow rate was set at 1.0 mL/min using a gradient program. The temperature of the column was maintained at 35 ℃, and the signal was detected at 210 nm. For these two methods, the injection volume of the standard and sample was kept as 10 μL.According to polarity differences among these components of TCD, two HPLC characteristic chromatograms were established. The similarities for the two HPLC characteristic chromatograms of 15 batches of substance benchmarks of TCD were 0.928—0.992 and 0.809—0.995, respectively. A total of 32 characteristic peaks were identified and five common components were identified as amygdalin, glycyrrhizin, ammonium glycyrrhizinate, aloe-emodin, and rhein. The average dry extract yield of 15 batches of TCD was 19.10%. The contents of amygdalin, ammonium glycyrrhizinate, cinnamaldehyde, aloe-emodin and rhein were 2.650—7.318, 3.563—17.486, 0.013—0.128, 0.034—0.215, 0.930—3.582 mg/g, respectively.This study could provide scientific basis for the quality control of substance benchmarks and the development of compound preparations of TCD.

        classical prescription; Taohe Chengqi Decoction; substance benchmarks; critical quality attributes; characteristic chromatogram; HPLC; quality control; amygdalin; liquiritin; ammonium glycyrrhizinate; aloe-emodin; rhein; cinnamaldehyde; dry extract rate

        R286.02

        A

        0253 - 2670(2021)08 - 2267 - 09

        10.7501/j.issn.0253-2670.2021.08.009

        2020-11-27

        國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81673562)

        關(guān)雅戈(1995—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制。E-mail: gyg1421@163.com

        高曉燕(1967—),博士,教授,主要從事中藥分析及藥效物質(zhì)研究。Tel: 13439727699 E-mail: gaoxiaoyan@bucm.edu.cn

        張志強(qiáng)(1981—),男,正高級(jí)工程師,主要從事中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及產(chǎn)業(yè)化研究。E-mail: zhangzhiqiang@tcmages.com

        #共同第一作者:羅 贛(1986—),男,博士,講師,主要從事中藥質(zhì)量控制研究。E-mail: luna049@126.com

        [責(zé)任編輯 鄭禮勝]

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