李君 董立男 吳明樹 張璐

0 引言

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種復(fù)雜的關(guān)節(jié)疾病，在年齡超過(guò) 50 歲的人群中，骨關(guān)節(jié)炎在導(dǎo)致長(zhǎng)期殘疾的疾病中僅次于心血管疾病[1]。OA的初始階段沒有明顯癥狀,一旦癥狀出現(xiàn)，病變往往已經(jīng)到了晚期[2]。所以，OA的早期診斷是風(fēng)濕病學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)重大挑戰(zhàn)。

OA早期較多是以軟骨病變累積為先，在一些患者中可以觀察到軟骨的纖維化，而另一些患者會(huì)出現(xiàn)輕微的表面侵蝕[3]。軟骨內(nèi)部微結(jié)構(gòu)的改變一般早于上述兩種外在形態(tài)的變化[4-5]。因此，骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷，除了觀察軟骨表面的缺損情況，還可以根據(jù)軟骨內(nèi)部微結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)行評(píng)估。雖然，關(guān)節(jié)炎診斷方法有很多,包括無(wú)創(chuàng)的影像學(xué)檢查與有創(chuàng)的關(guān)節(jié)鏡檢查。OA常用的無(wú)創(chuàng)影像學(xué)檢查方法有X線、MRI、超聲，但由于成像分辨率與對(duì)比度受限無(wú)法診斷關(guān)節(jié)早期病理性的改變[6]。關(guān)節(jié)鏡使用過(guò)程中需要高灌注壓和輔助麻醉技術(shù)，具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。其次關(guān)節(jié)鏡僅適用關(guān)節(jié)間隙較大的關(guān)節(jié)，并且觀察視野范圍較小，借助光鏡觀察存在一定的盲區(qū)。因此，以上檢測(cè)手段對(duì)于骨關(guān)節(jié)炎的早期診斷，特別是亞臨床骨關(guān)節(jié)炎的診斷依然比較困難。同軸相襯成像(in-line phase contrast imaging,IL-PCI)技術(shù)是一種基于菲涅爾衍射的X射線相位成像方法，可以無(wú)創(chuàng)探測(cè)低吸收物體內(nèi)部不同組織的精細(xì)結(jié)構(gòu)信息。由于該技術(shù)成像條件簡(jiǎn)單，圖像分辨率高而成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。有研究利用IL-PCI技術(shù)對(duì)金屬及光纖等材料進(jìn)行成像實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明該成像技術(shù)擁有微米級(jí)別的高空間分辨率[7-8]。也有研究通過(guò)該技術(shù)分析生物組織微結(jié)構(gòu)的變化，通過(guò)微結(jié)構(gòu)的改變來(lái)預(yù)測(cè)或診斷疾病[9-12]。這些研究表明對(duì)于生物軟組織樣本的可觀察最小尺寸在1～10 μm范圍，可分辨出密度在0.000 3～0.002 g/cm3的不同組織。由于軟骨組織主要由軟骨細(xì)胞、基質(zhì)與纖維構(gòu)成，軟骨組織微結(jié)構(gòu)一般在10～100 μm范圍之間。因此，采用IL-PCI技術(shù)觀察軟骨組織微結(jié)構(gòu)的改變具有一定的可行性。

圖像通過(guò)紋理分析，可以得到更多的宏觀和微觀信息。所以，在圖像處理中，紋理特征的分析越來(lái)越受到人們青睞。圖像紋理最明顯的視覺特征是粒度、方向性與重復(fù)性。這些屬性與圖像的局部灰度變化有關(guān)，并且具有較高的敏感性。通過(guò)紋理測(cè)度量化，能夠有效、準(zhǔn)確地識(shí)別圖像紋理改變。因此，本研究將利用IL-PCI技術(shù)對(duì)正常及早期OA患者的體外軟骨組織進(jìn)行成像，通過(guò)提取軟骨紋理特征，定量分析正常和早期OA軟骨的紋理差異，研究結(jié)果將為早期OA的臨床鑒別診斷提供一種無(wú)創(chuàng)量化判別的手段。

1 研究方法

1.1 樣本及分組

研究測(cè)試樣本為體外的人體膝關(guān)節(jié)軟骨組織，來(lái)自于北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科接受人工關(guān)節(jié)置換手術(shù)患者的廢棄關(guān)節(jié)組織。其中正常關(guān)節(jié)軟骨樣本取自創(chuàng)傷性關(guān)節(jié)損傷患者，此類患者的部分關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)相對(duì)完整因此可用于入組研究。所有患者均知情同意,簽署知情同意書,并經(jīng)北京大學(xué)第三醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

依照國(guó)際軟骨修復(fù)協(xié)會(huì)軟骨損傷分級(jí)系統(tǒng)(ICRS),將樣本分為正常組與早期OA組。表面光滑、無(wú)損的膝關(guān)節(jié)軟骨組織分在正常組，共計(jì)18例；具有表淺、鈍性缺口和表淺開裂的軟骨組織分在早期OA組，共計(jì)18例。

1.2 樣本處理

將新鮮的人體膝關(guān)節(jié)軟骨樣本置于4%福爾馬林溶液(pH 7.0)中固定24 h。流動(dòng)水沖洗30 min后,分別置于不同濃度乙醇進(jìn)行梯度脫水。IL-PCI成像后再將樣品重新置于4%福爾馬林溶液中進(jìn)行保存。對(duì)樣本進(jìn)行組織切片的制備，經(jīng)過(guò)常規(guī)脫水、石蠟包埋后制成4 μm厚的切片,隨后進(jìn)行HE染色與相襯CT圖像進(jìn)行對(duì)比。

1.3 IL-PCI掃描成像及處理

1.3.1 IL-PCI技術(shù)

如圖1所示，同步輻射X射線由儲(chǔ)能環(huán)反射出來(lái)，經(jīng)兩塊單色晶體[Si(311)晶體]折射后變成一束相干的單色光。單色光穿透樣本時(shí)，X 射線相位發(fā)生改變，在不同組織表面發(fā)生菲涅耳衍射，當(dāng)樣本與探測(cè)器達(dá)到合適距離時(shí)，探測(cè)器所在位置接收信號(hào)的強(qiáng)度會(huì)出現(xiàn)明顯的邊緣增強(qiáng)效應(yīng)，從而形成相位襯度圖像。

圖1 同步輻射同軸相位襯度成像原理圖Figure 1 Schematic diagram of IL-PCI principle

1.3.2 膝關(guān)節(jié)軟骨IL-PCI掃描成像

人體膝關(guān)節(jié)軟骨成像實(shí)驗(yàn)于上海光源(Shanghai Synchrotron Radiation Facility,SSRF)的BL13W1線站進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)采用2倍放大倍數(shù)的高頻探測(cè)器，分辨率3.7 μm×3.7 μm，樣品至光源的距離為15 cm，輻射能量15 keV，掃描曝光時(shí)間2.5 s，掃描投影圖 720張，暗場(chǎng)圖像10張，背景圖像10張。在成像過(guò)程中，由于成像系統(tǒng)內(nèi)部或外部多種因素的干擾，會(huì)產(chǎn)生背景噪聲,降低圖像質(zhì)量,影響圖像后續(xù)處理和量化分析。去除或最大程度地減少這種噪聲是十分必要的。課題組首先利用圖像歸一化的方法去除投影圖的本底噪聲，接著采用濾波反投影算法進(jìn)行CT重建，最后利用紋理特征算法提取CT圖像紋理特征。

1.3.3 紋理特征提取

根據(jù)臨床專家的意見，軟骨的輻射層在早期OA軟骨纖維化樣病變的表征較為突出，是感興趣區(qū)最佳選擇部位。同時(shí)，為提高計(jì)算速度、減少工作量，通過(guò)手動(dòng)選取128×128像素的矩陣作為紋理特征參數(shù)計(jì)算的感興趣區(qū)。紋理特征參數(shù)基于行程長(zhǎng)度矩陣與分形維數(shù)兩種方法進(jìn)行提取。

(1) 基于行程長(zhǎng)度矩陣的紋理特征提取。行程長(zhǎng)度矩陣定義為某個(gè)方向上連續(xù)j個(gè)點(diǎn)，具有相同灰度值i出現(xiàn)的次數(shù)，記為P(i,j)，其中i=0，1，…，M-1；j= 0，1，…，N-1；M為灰度級(jí)數(shù)，N為最長(zhǎng)的行程長(zhǎng)度。基于行程長(zhǎng)度矩陣沿4個(gè)方向分別計(jì)算特征參數(shù)：長(zhǎng)行程加重(long run emphasis,LRE)、短行程加重(short run emphasis,SRE)、程分?jǐn)?shù)(run percentage,RP)、灰度級(jí)的非均勻性(gray level non-uniformity,GLN)、行程長(zhǎng)度的非均勻性(run length non-uniformity,RLN)[13-14]。

(2) 基于分形維數(shù)的紋理特征提取。本研究采用差分盒維數(shù)法，以三維立方體網(wǎng)格直接覆蓋CT圖像計(jì)算分形維數(shù)。對(duì)于M×N像素，灰階為Hk的CT圖像,可將其視為底邊為δk×δk、高度為Hk的盒子。以δk為尺度將底面劃分為(1 /δk)×(1 /δk)的網(wǎng)格,用(M/δk)× (N/δk)×(Hk/δk)的立方體進(jìn)行覆蓋，計(jì)算的立方體個(gè)數(shù)Nδk， 通過(guò)改變灰階Hk的大小,可以得到一系列不同的Nδk值,在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)下擬合lgNδk=a(-lgδk)+b直線,其斜率即為該CT圖像的分形維數(shù)。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

基于行程長(zhǎng)度矩陣與分形維數(shù)兩種紋理提取算法共得到六維紋理特征參數(shù)，分別是LRE、SRE、RP、GLN、RLN與分形維數(shù)。通過(guò)比較正常組與OA組這6項(xiàng)參數(shù)，分析IL-PCI技術(shù)用于早期OA鑒別診斷的可行性。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。正常組與早期OA組間的比較，釆用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析方法。檢驗(yàn)水平a=0.01，P<0.01時(shí)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 組織學(xué)病理切片

HE染色病理切片結(jié)果如圖2所示，正常軟骨組織的軟骨細(xì)胞分布均勻，序列整齊，層次清楚；潮線完整；基質(zhì)染色均勻無(wú)失染。早期OA軟骨組織的軟骨細(xì)胞排列紊亂，部分區(qū)域細(xì)胞缺失；潮線不規(guī)則；可見纖維化樣改變。從組織切片中可見，正常軟骨組織以塊狀結(jié)構(gòu)和點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)居多，早期OA軟骨組織以條狀結(jié)構(gòu)和梁狀結(jié)構(gòu)居多。

圖2 HE染色病理切片F(xiàn)igure 2 Pathological sections with HE staining

2.2 IL-PCI成像結(jié)果

圖3是正常軟骨組織及早期OA軟骨組織的IL-PCI投影圖。相比于正常軟骨組織，早期OA軟骨組織的紋理結(jié)構(gòu)更加豐富并且表面可見軟骨表面的細(xì)小磨損。

圖3 軟骨組織同軸相襯投影圖(標(biāo)尺長(zhǎng)度：500 μm)Figure 3 IL-PCI projection of cartilage tissue(scale length:500 μm)

圖4(a)與(b)分別是正常軟骨組織及早期OA軟骨組織的冠狀面的IL-PCI CT圖像。如圖4(a)所示，在未使用造影劑的條件下，膝關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨的結(jié)構(gòu)依舊清晰可辨。可以觀察到軟骨的完整結(jié)構(gòu)(包含表層、過(guò)渡層、輻射層和鈣化層)，并能探測(cè)到骨細(xì)胞分布均勻的情況，實(shí)現(xiàn)了相襯技術(shù)在細(xì)胞水平的成像。圖4(b)中軟骨層的潮線部分缺失，軟骨細(xì)胞分布均勻性也被破壞。圖4(c)與(d)分別是正常與早期OA膝關(guān)節(jié)軟骨輻射層的橫斷面CT細(xì)節(jié)圖。圖4(c)中軟骨細(xì)胞分布均勻，序列整齊，層次清楚。相比之下，圖4(d)中可以觀察到軟骨的紋理十分不規(guī)則，有些區(qū)域呈現(xiàn)梁狀結(jié)構(gòu)，軟骨細(xì)胞分布不均，局部有軟骨細(xì)胞缺失。IL-PCI成像結(jié)果跟組織病理分析結(jié)果基本一致。

圖4 軟骨組織相襯CT圖(標(biāo)尺長(zhǎng)度：500 μm)Figure 4 IL-PCI CT of cartilage tissue(scale length:500 μm)

2.3 紋理特征提取結(jié)果

2.3.1 基于行程長(zhǎng)度矩陣的紋理特征提取

結(jié)果如圖5所示，條形圖中可以觀察到，正常組的LRE明顯高于早期OA組(P<0.01)，而早期OA組的GLN、RLN遠(yuǎn)高于正常組(P<0.01)。這說(shuō)明早期OA組的行程長(zhǎng)度的均勻性較差，圖像灰度變化較大，圖像紋理比正常組粗糙。對(duì)于SRE和RP，早期OA組只是略高于正常組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

“#”表示P < 0.01，正常組與早期OA組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖5 基于行程長(zhǎng)度矩陣方法提取的正常組與早期OA組軟骨紋理特征Figure 5 Cartilage texture features extracted from the normal group and the early OA group based on stroke length matrix method

2.3.2 基于分形維數(shù)的紋理特征提取

“#”表示 P < 0.01，正常組與早期OA組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。圖6 正常組與早期OA組的分形維數(shù)Figure 6 Fractal dimensions of normal group and early OA group

正常組軟骨與早期OA組軟骨的分形維數(shù)的結(jié)果如圖6所示，正常組的分形維數(shù)要小于早期OA組(P<0.01)，說(shuō)明早期OA組軟骨結(jié)構(gòu)比正常軟骨結(jié)構(gòu)更為復(fù)雜。

3 討論

對(duì)于骨性關(guān)節(jié)炎疾病，軟骨內(nèi)部結(jié)構(gòu)的改變遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于軟骨外部形態(tài)的改變。而軟骨內(nèi)微結(jié)構(gòu)的變化主要表現(xiàn)在軟骨細(xì)胞的分布改變及纖維化樣病變的產(chǎn)生[15]。如果在臨床體檢時(shí)，能夠?qū)浌墙M織微結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)行評(píng)估與監(jiān)測(cè)，將對(duì)骨關(guān)節(jié)疾病的早期診斷和提早預(yù)防具有重要意義。

相襯成像技術(shù)對(duì)軟骨組織成像具有很高的襯度，已有研究證實(shí)，在不使用造影劑的前提下，仍有能力實(shí)現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨的清晰成像[16-17]。同樣有研究利用該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了牛關(guān)節(jié)軟骨中膠原纖維分布的定向測(cè)量[18]。上述研究雖然說(shuō)明了IL-PCI技術(shù)對(duì)軟骨成像定量分析的能力，但沒有利用該技術(shù)用于臨床疾病的預(yù)測(cè)及診斷。因此，本研究利用X射線同軸相襯技術(shù)，對(duì)早期OA以及正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織進(jìn)行成像。本研究結(jié)果不僅獲得了軟骨組織的整體外觀的形態(tài)圖像，更意外的是探測(cè)到軟骨內(nèi)部骨細(xì)胞的分布情況。從軟骨組織相襯CT圖中發(fā)現(xiàn)，在正常軟骨組織，骨細(xì)胞的相對(duì)大小與位置的分布基本一致，表現(xiàn)出一定的自相似性。利用該技術(shù)的高分辨率成像結(jié)果，可以探測(cè)到OA膠原纖維的走向以及表層纖維化樣的改變，這與組織學(xué)染色非常吻合。說(shuō)明該技術(shù)對(duì)關(guān)節(jié)軟骨微觀結(jié)構(gòu)的改變具有很強(qiáng)的敏感性和特異性。

同時(shí)，本研究分別采用行程長(zhǎng)度矩陣、分形維數(shù)紋理提取方法量化正常軟骨組織與早期OA軟骨組織的差異。研究結(jié)果表明，基于行程長(zhǎng)度矩陣、分形維數(shù)的紋理特征提取，可以有效區(qū)分早期軟骨的退變。如果在特征提取的基礎(chǔ)上進(jìn)行疾病分類，對(duì)關(guān)節(jié)炎鑒別診斷具有重要意義。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)了IL-PCI技術(shù)對(duì)于生物樣本具有高分辨率可視化軟組織結(jié)構(gòu)的能力。通過(guò)可視化軟骨組織內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)并創(chuàng)建分類模型，對(duì)研究關(guān)節(jié)炎早期發(fā)病機(jī)制具有非常重要的價(jià)值，為今后的臨床診斷及治療提供可靠、有效的依據(jù)。