鄧森靈，蘭代群，曹雅文，符春麗，韓雪茹，蘇紅娥，閆志強(qiáng)

(海南西部中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，那大 571799)

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是臨床常見的婦科惡性腫瘤，其早期臨床癥狀不典型，病情進(jìn)展迅速，預(yù)后較差，對女性的生命健康構(gòu)成極大的威脅[1-2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類長度21～25nt的非編碼小分子RNA，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和新陳代謝等過程，在EOC的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用[3-4]。研究指出，EOC患者存在miR-222的異常表達(dá)，其通過調(diào)控多種信號(hào)通路參與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移，可能與EOC發(fā)病過程有關(guān)[5]。人附睪蛋白4(human epididymis protein 4，HE4)是一種小分子分泌性蛋白，在正常者及良性腫瘤中呈低表達(dá)，而在EOC中呈高表達(dá)，對EOC診斷具有重要價(jià)值[6]。糖類抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)是臨床上常用于EOC診斷的腫瘤標(biāo)記物，其在EOC中存在高度表達(dá)，對EOC的診斷、化療監(jiān)測及預(yù)后評估具有參考意義[7]。卵巢癌風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測模型(risk of ovarian malignancy algorithm，ROMA)是通過結(jié)合患者絕經(jīng)情況，并依據(jù)血清HE4和CA125水平，建立回歸模型計(jì)算出預(yù)測指數(shù)，可用于評估卵巢癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[8]。本研究通過檢測EOC患者血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指數(shù)，分析其診斷EOC的臨床價(jià)值，旨在為EOC的診療提供參考。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2016年1月1日至2019年12月31日海南西部中心醫(yī)院收治的EOC患者120例，年齡34～75歲，平均(55.63±10.72)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合國際婦產(chǎn)科聯(lián)合會(huì)(FIGO)分類標(biāo)準(zhǔn)和WHO分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，且經(jīng)病理確診為EOC；(2)患者在術(shù)前采血，未經(jīng)手術(shù)治療或未行新輔助化療者；(3)能配合本次研究及病歷資料完整者。排除合并其他惡性腫瘤及自身免疫疾病者。另取同期上皮性卵巢良性腫瘤患者100例(卵巢囊腫53例、卵巢漿液性囊腺瘤10例、卵巢黏液性囊腺瘤16例、卵巢畸胎瘤21例)為良性組和正常健康女性60例為對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 miR-222檢測 采集空腹靜脈血5ml，3500r/min離心10min，分離血清，加1ml miRNeasy試劑。按總miRNA快速提取試劑盒(miRNeasy血漿提取試劑盒)說明書提取總miRNA。在ABI 7500型熒光定量PCR儀(美國ABI公司)上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)。以U6為實(shí)驗(yàn)內(nèi)參，逆轉(zhuǎn)錄總反應(yīng)體系為15μl：5μl RNA模板，3μl U6及miRNA特異性莖環(huán)引物，0.15μl 100mmol/L脫氧核糖核苷酸(dNTPs)，1.00μl逆轉(zhuǎn)錄酶(50U/μl)，1.50μl 10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液，0.19μl RNase抑制劑(20U/μl)，4.16μl雙蒸水；條件設(shè)定：16℃ 30min、42℃ 30min、85℃ 5min。PCR總反應(yīng)體系為20μl：1μl引物及探針Mix(20×)，10μl TaqMan通用混合物溶液(2×)，1.33μl反向轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核酸，7.67μl雙蒸餾水。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性10min、95℃變性15s、60℃復(fù)性60s進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。2-△△Ct法計(jì)算miR-222-3p相對表達(dá)水平，△Ct=Ct目的基因-CtU6。

1.2.2 HE4及CA125檢測 采用羅氏E601電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套試劑，化學(xué)發(fā)光法測定血清HE4及CA125水平，HE4>150pmol/L為陽性，CA125>35U/ml為陽性，操作過程嚴(yán)格按試劑說明書及儀器操作規(guī)程進(jìn)行。

1.2.3 ROMA指數(shù)計(jì)算 ROMA指數(shù)應(yīng)用ROMA分析軟件進(jìn)行計(jì)算，絕經(jīng)前預(yù)測指數(shù)(PI)=-12.0+2.38×LN(HE4)+0.0626×LN(CA125)；絕經(jīng)后預(yù)測指數(shù)(PI)=-8.09+1.04×LN(HE4)+0.732×LN(CA125)。ROMA(%)=[exp(PI)×100]/[1+exp(PI)]，絕經(jīng)前≥13.1%或絕經(jīng)后≥27.7%提示高風(fēng)險(xiǎn)。

2 結(jié) 果

2.1 3組患者的一般資料比較 EOC組、良性組和對照組的一般資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組患者的一般臨床資料比較

2.2 各組血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指數(shù)比較 EOC組的血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指數(shù)均明顯高于良性組和對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；良性組與對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Ⅲ～Ⅳ期EOC患者的血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指數(shù)均明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表2。

表2 各組血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指數(shù)比較

2.3 血清miR-222、HE4及CA125水平聯(lián)合ROMA指數(shù)對EOC的診斷價(jià)值 血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指數(shù)診斷EOC的最佳截?cái)嘀捣謩e為1.21、193.62pmol/L、165.73U/ml、35.60%，四項(xiàng)聯(lián)合診斷EOC的曲線下面積(0.970，95%CI：0.913～0.998)明顯高于單項(xiàng)miR-222(0.838，95%CI：0.780～0.896)、HE4(0.853，95%CI：0.792～0.913)、CA125(0.794，95%CI：0.736～0.855)、ROMA指數(shù)(0.890，95%CI：0.830～0.951)及HE4+CA125(0.764，95%CI：0.802～0.924)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P<0.05)，其敏感度和特異度為99.5%和88.2%。見表3。

表3 血清miR-222、HE4及CA125水平聯(lián)合ROMA指數(shù)對EOC的診斷價(jià)值

2.4 EOC患者血清miR-222水平與HE4、CA125及ROMA指數(shù)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，EOC患者血清miR-222水平與HE4、CA125、ROMA指數(shù)均呈正相關(guān)(r=0.830，P<0.001；r=0.772，P<0.001；r=0.884，P<0.001)。見圖1。

圖1 EOC患者血清miR-222水平與HE4、CA125及ROMA指數(shù)的相關(guān)性

3 討 論

EOC是女性生殖系統(tǒng)三大惡性腫瘤之一，其病死率居?jì)D科惡性腫瘤首位，因其發(fā)病隱匿，缺乏有效的早期診斷方法，大多數(shù)患者就診時(shí)已為晚期。因此，探索EOC有效的早期診斷指標(biāo)對提高患者的生存率有重要的臨床意義。miRNA是一種廣泛存在于真核生物的非編碼小RNA，參與EOC的發(fā)病過程，有望成為EOC早期診斷的潛在生物標(biāo)記物[9-10]。Chatterjee等[11]研究發(fā)現(xiàn)，與乳腺正常成纖維細(xì)胞相比，miR-222在乳腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，miR-222參與乳腺癌增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，在促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。Parizadeh等[12]研究表明，miRNA存在于不同的組織和體液中，在癌變過程中miRNA表達(dá)發(fā)生改變，miRNA表達(dá)與卵巢癌患者預(yù)后有關(guān)，可作為卵巢癌預(yù)后評估的生物標(biāo)記物。有研究認(rèn)為，miRNA參與多種生物學(xué)過程，包括增殖、凋亡、耐藥、轉(zhuǎn)移，在卵巢癌的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，可能成為卵巢癌診斷、預(yù)后預(yù)測和治療評估的生物標(biāo)記物[13]。

本研究顯示，EOC組的血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指數(shù)均明顯高于良性組和對照組，而良性組與對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示EOC患者血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指數(shù)升高，其可能參與EOC的發(fā)病過程。馮艾等[14]研究顯示，卵巢癌患者血清HE4、CA125水平及ROMA指數(shù)均高于良性腫瘤組和健康對照組，而良性組與健康對照組無顯著差異。提示血清HE4、CA125水平及ROMA指數(shù)升高可能與卵巢癌發(fā)生有關(guān)。研究表明，miR-222在EOC中表達(dá)異常，促進(jìn)了EOC的病情進(jìn)展，可能成為EOC診斷及靶向治療的生物標(biāo)記物[15]。本研究中Ⅲ～Ⅳ期EOC患者血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指數(shù)均明顯高于Ⅰ～Ⅱ期，提示血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指數(shù)升高可能與EOC進(jìn)展有關(guān)，其高表達(dá)的EOC患者，病情進(jìn)展較快。常文龍等[16]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者的臨床分期越高，血清HE4及CA125水平越高，HE4及CA125在卵巢癌病情進(jìn)展中起到重要的作用。另有研究認(rèn)為，miRNA表達(dá)水平與EOC的臨床分期及預(yù)后密切相關(guān)，可能是EOC診斷及預(yù)后預(yù)測的新型生物學(xué)指標(biāo)[17]。

本研究應(yīng)用ROC曲線分析，結(jié)果顯示miR-222對EOC診斷的特異度較高，但其敏感度較低，有一定的局限性；ROMA指數(shù)能更好地兼顧靈敏度和特異度，對EOC的診斷效能較好；血清miR-222、HE4、CA125水平及ROMA指數(shù)四項(xiàng)聯(lián)合診斷EOC的曲線下面積最大，其敏感度最高。相關(guān)分析顯示，EOC患者血清miR-222水平與HE4、CA125及ROMA指數(shù)均呈正相關(guān)(P<0.001)，可見四者之間具有良好的相關(guān)性，四項(xiàng)聯(lián)合檢測有助于提高EOC的診斷效能。包媛媛等[18]研究顯示，卵巢癌患者血清HE4、CA125水平及ROMA指數(shù)明顯升高，HE4、CA125及ROMA指數(shù)三項(xiàng)聯(lián)合比單項(xiàng)在診斷早期卵巢癌中的價(jià)值更高。Deb等[19]研究表明，血清miRNA表達(dá)水平上調(diào)與卵巢癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，可能為卵巢癌的檢測、診斷和治療提供新的思路，在未來有較好的應(yīng)用前景。

綜上所述，EOC患者的血清miR-222、HE4及CA125水平明顯升高，聯(lián)合ROMA指數(shù)對EOC診斷具有較高的價(jià)值，同時(shí)也為EOC的早期篩查及早期發(fā)現(xiàn)提供幫助。但這些研究仍處于初步探索階段，EOC的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，有待于在細(xì)胞、基因水平進(jìn)行更深層次的研究。