郭 玲，代彩鳳，劉 金，李 莉，劉 雯，鄧曉惠

(1.山東大學齊魯醫(yī)院婦產科不孕不育診療中心，濟南 250012；2.山東大學醫(yī)學院，濟南 250000)

反復種植失敗(repeated implantation failure，RIF)是指不孕癥患者在經歷多個體外受精(in vitro fertilization，IVF)或卵細胞漿內單精子注射(intra-cytoplasmic sperm injection，ICSI)周期并移植了多枚優(yōu)質胚胎而未能發(fā)生胚胎種植或臨床妊娠。目前國內外尚無統(tǒng)一的RIF診斷標準。Coughlan等[1]提出，40歲以下不孕患者在至少經歷3個新鮮或凍融移植周期、累計至少移植4枚優(yōu)質胚胎而未能實現(xiàn)臨床妊娠即可診斷為RIF，此定義被采用率最高。RIF在IVF/ICSI助孕治療中的發(fā)生率可達5%～10%[2]，給患者及家庭造成了巨大的經濟損失和身心壓力，是目前輔助生殖領域中亟待解決的一大難題。RIF病因繁多且復雜[3]，隨著近年來生殖免疫學的發(fā)展，越來越多的研究表明RIF可能與母-胎免疫相關[4]。研究認為，輔助性T(Th)細胞及其分泌的細胞因子參與母體妊娠免疫耐受的形成[5]，Th1/Th2細胞平衡在胚胎種植和妊娠維持中發(fā)揮重要作用[6]，自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)對胚胎種植發(fā)揮著直接或間接的調節(jié)作用[7]。因此，外周血中Th1/Th2細胞平衡以及NK細胞亞群特征是近年來母-胎免疫平衡的研究重點及熱點[8]。本研究通過研究黃體中期RIF患者與首次移植妊娠成功患者外周血中Th1、Th2型相關細胞因子及NK細胞表達差異，探討Th1/Th2細胞平衡及NK細胞對胚胎種植的影響及調節(jié)機制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2020年3月至2020年9月于山東大學齊魯醫(yī)院不孕不育診療中心就診的35例RIF患者作為RIF組，同期采用IVF/ICSI助孕的首次移植即成功獲得妊娠的29例患者作為對照組。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，患者均自愿參與本研究并簽署知情同意書。RIF組患者納入標準：(1)年齡<40歲且基礎FSH<10U/L；(2)至少經歷3個周期，新鮮或凍融移植周期累計至少移植4枚優(yōu)質胚胎而未獲得臨床妊娠者。對照組納入標準：(1)年齡<40歲且基礎FSH<10U/L；(2)第1次于本院不孕不育診療中心行IVF/ICSI-ET助孕即成功獲得妊娠的患者，且無不良孕產史。排除標準：(1)夫妻雙方染色體異常；(2)女性生殖道解剖結構異常和病變；(3)甲狀腺激素、血糖及胰島素等內分泌檢查異常；(4)凝血功能異常、血液高凝狀態(tài)或遺傳性易栓癥；(5)子宮內膜息肉、盆腔積水、輸卵管積水、子宮內膜炎等慢性盆腔炎性疾病等；(6)移植日子宮內膜厚度<7mm；(7)近3個月內無激素或免疫抑制劑類藥物治療史；(8)存在輔助生殖技術(assisted reproductive technology，ART)及妊娠的禁忌證或合并其他對妊娠有重大影響疾病的患者。

1.2 研究方法

1.2.1 標本收集 受試者于行IVF/ICSI-ET治療前的黃體中期(排卵后6～7天)，采集清晨空腹肘靜脈血，-80℃凍存。

1.2.2 Th1、Th2型細胞因子檢測 使用Aimplex流式多因子檢測試劑盒(北京曠博公司)測定外周血中Th1、Th2型細胞因子濃度，包括白細胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-4與干擾素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)，實驗操作參考說明書。使用貝克曼-NAVIOS流式細胞儀進行檢測。

1.2.3 NK細胞亞群的流式細胞術檢測 60μl全血標本中加CD3-FITC/CD(16+56)-PE組合抗體(Beckman Coulter)與CD45-PC5抗體(Beckman Coulter)各5μl，室溫避光反應15min。加溶血素室溫避光反應10min，加固定液重懸細胞，在貝克曼-NAVIOS流式細胞儀上檢測。

2 結 果

2.1 一般資料比較 RIF組與對照組患者的平均年齡比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。兩組患者的體質量指數(shù)(body mass index,BMI)、抗繆勒管激素(Anti-Müllerian Hormone,AMH)、基礎內分泌和甲功三項等指標比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表1)。

表1 對照組與RIF組患者的一般資料

2.2 外周血中Th1、Th2型細胞因子水平比較 RIF組血清中IL-6高于對照組，IL-10低于對照組(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。RIF組血清中IL-2、IL-4、IFN-γ含量高于對照組，TNF-α低于對照組，但差異無統(tǒng)計學意義(表2)。

表2 對照組與RIF組患者細胞因子水平比較(pg/ml)

2.3 Th1、Th2型細胞因子測定結果比值比較 兩組患者血清中IL-2/IL-10、IFN-γ/IL-10和TNF-α/IL-10比值比較，差異均有統(tǒng)計學意義(表3)。

表3 對照組與RIF組患者相關細胞因子比值比較

2.4 NK細胞百分比比較 RIF組與對照組黃體中期外周血中NK細胞比例比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖1)。

圖1 RIF組與對照組NK細胞比例

3 討 論

胚胎著床是一個步驟繁雜且易受多個因素影響的過程，包括定位、黏附、植入等多個階段，任何步驟出現(xiàn)問題都有著床失敗的可能。胚胎作為一種同種半異體抗原[9]，其成功種植關鍵在于母胎界面的免疫耐受，此過程有賴于免疫系統(tǒng)的調節(jié)，若免疫微環(huán)境發(fā)生免疫失衡，將導致胚胎著床失敗或流產，而其具體機制目前尚不明確。在“種植窗口期”[10](排卵后6～7天)，外周血免疫細胞及相關細胞因子在母-胎交流和母體重塑方面發(fā)揮著重要的作用，但其在RIF患者及首次行IVF-ET助孕治療即成功妊娠患者外周血中的表達差異仍有待進一步研究。本研究選取了在胚胎著床過程中具有重要作用的6種Th1、Th2型細胞因子以及NK細胞作為研究對象，通過檢測其在“種植窗口期”外周血中的表達差異，初步探討Th1/Th2細胞平衡及NK細胞對胚胎種植的影響及調節(jié)機制。輔助性T(Th)細胞在母胎免疫調節(jié)中發(fā)揮著重要作用，參與了RIF的發(fā)病機制[11]，根據(jù)自身分泌的細胞因子不同分為Th1、Th2及Th17細胞等[12]。Th1細胞主要分泌白細胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)、干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等細胞因子，介導細胞免疫和炎癥反應。Th2細胞分泌IL-4、IL-6和IL-10等，參與體液免疫反應[13]。外周血Th1/Th2平衡對于成功的胚胎種植及妊娠維持非常重要[6,14]，可作為種植免疫狀態(tài)的一個有效標記。目前針對Th1/Th2平衡對妊娠影響的研究多集中于動物實驗或子宮局部等，而女性外周血中Th1、Th2的變化及其意義尚不明確，仍缺乏大樣本的臨床研究資料。Liang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與第1次行IVF/ICSI-ET助孕即成功妊娠的不孕癥患者相比，RIF患者外周血中促炎細胞因子IFN-γ、IL-1β和IL-6水平升高，并且IFN-γ/IL-4、IFN-γ/IL-10和IL-6/IL-10比值顯著升高，提示外周血Th1/Th2失衡可能與RIF發(fā)生相關。

本研究結果顯示，RIF組患者外周血中促炎性細胞因子IL-6及IL-2/IL-10、IFN-γ/IL-10和TNF-α/IL-10比值明顯高于對照組，而抑炎性細胞因子IL-10水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。IL-6作為一種炎性細胞因子，主要由Th2細胞分泌，正常情況下可激活基質金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)，并參與調節(jié)多種細胞因子、血管生成因子及某些重要酶的合成，對胚胎植入起到重要調節(jié)作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn)，IL-6異常高表達常與不良妊娠相關[17],其具體機制尚不清楚，可能通過多種機制影響胚胎著床。IL-6過高可加強體液免疫反應，促進B細胞分化，通過促進抗體的產生加大NK細胞的自然殺傷能力[18]；也可誘導Th17細胞的分化，促進炎癥反應，參與RIF的發(fā)生[19]。既往由于研究方法的限制，能同時檢測出的Th細胞相關細胞因子數(shù)量有限，并且結果通常是以百分比的形式呈現(xiàn)。本研究通過流式細胞術微球陣列法對血漿中的相關細胞因子進行定量檢測和分析，得出的結論與上述研究基本一致，RIF組總體趨勢向于Th1型等具有促炎活性的細胞因子水平升高，而Th2型抑炎性細胞因子水平降低。

NK細胞是一種固有免疫細胞，表達特定的細胞表面標記物CD56，在人類外周血和子宮內膜中均存在，根據(jù)表達程度不同可分為CD56dim(低表達型)和CD56bright(高表達型)細胞亞群。大多數(shù)子宮NK(uNK)細胞表型為CD56brightCD16-，細胞毒性較低，通過分泌相關細胞因子，在胚胎植入早期直接或間接地發(fā)揮免疫調控作用[20-21]。外周血NK細胞約占外周血淋巴細胞的10%～15%[22]，主要表達CD56dim和CD16+，具有較高的細胞毒性，可通過復雜的免疫因子作用影響母胎對話造成胚胎著床失敗[7]。目前NK細胞與RIF的相關性研究主要集中在uNK細胞，發(fā)現(xiàn)其在血管生成、胚胎發(fā)育及妊娠的建立等起到積極的作用[23]，而外周血中NK細胞水平與RIF關系的研究較少。有研究發(fā)現(xiàn)[24]，外周血中NK細胞可反應uNK的變化，并呈一定的相關性。另有研究發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠女性相比，RIF患者外周血中NK細胞水平更高[25]。同時Fukui等[26]研究發(fā)現(xiàn)，RIF患者外周血NK細胞表達異常與Th1/Th2細胞因子免疫失衡相關。本研究結果表明，RIF組患者與對照組患者黃體中期外周血中NK細胞比例無明顯統(tǒng)計學差異。考慮單一周期胚胎著床及機體免疫狀態(tài)受多種因素調控，這可能與本研究樣本量偏小有關，未來尚需更多大樣本前瞻性的研究來加以論證。

綜上所述，IL-6、IL-10可能參與種植窗口期外周血中Th1/Th2細胞平衡調節(jié)，從而影響胚胎種植。本研究結果為RIF致病原因評估開拓新的思路，為臨床干預治療提供依據(jù)和指導。