王紅坤，趙燕玲，陶 炯，徐先明

(上海交通大學附屬上海市第一人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心，上海 201620)

產(chǎn)前篩查是指用簡便、經(jīng)濟、可行、無創(chuàng)的檢查方法，篩選出胎兒患染色體疾病[(如唐氏綜合征(Down syndrome,DS)]或先天性結(jié)構(gòu)畸形[(如開放性神經(jīng)管缺陷(neural tube defects,NTD)]等的高風險人群，是避免出生缺陷的重要手段。臨床上最常用的產(chǎn)前篩查主要有血清學唐氏綜合征篩查和孕婦外周血胎兒游離DNA產(chǎn)前篩查(non-invasive prenatal testing，NIPT)。近年研究發(fā)現(xiàn)，除了篩查出胎兒染色體異常和開放性神經(jīng)管畸形的人群以外[1-2]，血清學唐氏綜合征篩查極高風險、假陽性、血清標記物的中位數(shù)倍數(shù)值(Multiple of Median，MoM值)異常以及NIPT檢測時游離胎兒DNA(cell-free fetal DNA,cffDNA)濃度或占比偏高、偏低的孕婦發(fā)生子癇前期、妊娠期糖尿病(gestational diabetes，GDM)、自然流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎/死產(chǎn)/新生兒死亡、胎兒宮內(nèi)發(fā)育不良、前置胎盤、胎盤早剝等不良妊娠結(jié)局的概率增加[2-8]。本研究通過回顧分析中孕血清學唐氏篩查和NIPT的不同風險結(jié)果以及cffDNA占比的極端值與不良妊娠結(jié)局的關(guān)系，為臨床上拓寬產(chǎn)前篩查不同結(jié)果的意義提供實踐依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2017年2月1日至2019年6月1日在上海市第一人民醫(yī)院產(chǎn)前診斷中心接受中孕期血清學唐氏篩查或NIPT，并在本院分娩，可隨訪到妊娠結(jié)局的孕婦。篩查孕周：中孕期血清學唐氏篩查為孕15～20+6周；NIPT為孕12～26+6周。納入標準：漢族、單胎、孕前無內(nèi)外科合并癥。排除標準：非漢族；多胎妊娠；孕前有內(nèi)外科慢性疾??；超聲提示胎兒結(jié)構(gòu)異常；有基因遺傳病家族史或提示胎兒罹患基因病高風險；夫婦一方有明確染色體異常；失訪者。此外，NIPT排除標準還有:1年內(nèi)接受過異體輸血、移植手術(shù)、異體細胞治療等；孕期合并惡性腫瘤。

1.2 研究方法

1.2.1 血清學唐氏篩查檢測 使用AutoDELFIA 1235時間分辨熒光免疫檢測系統(tǒng)(美國Perkin ElmerTM)測定孕婦血清學指標甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)、游離β-人絨毛促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)、游離雌三醇(unconjugated estriol，uE3)、抑制素A(Inhibin A)的水平，AFP/游離β-HCG雙標記試劑盒、uE3試劑盒由美國Perkin Elmer公司提供，抑制素A由廣州豐華生物工程有限公司提供。以超聲測定胎兒雙頂徑作為計算孕周的依據(jù)，將孕婦年齡、胎齡等信息以及檢測數(shù)值導入風險計算軟件Lifecycle 4.0(Perkin ElmerTM，美國)，轉(zhuǎn)換標記物濃度為MOM值，并計算DS和18-三體綜合征(Trisomy 18，T18)風險值。風險值≥1/270為DS高風險，風險值≥1/350為T18高風險，介于高風險切割值與1/1000之間為中風險。AFP≥2.5MoM為NTD高風險。

1.2.2 NIPT檢測 采集孕婦外周血10ml，用兩步離心法分離血漿，使用北京貝瑞和康胎兒非整倍體檢測試劑盒(可逆末終止測序法)提取胎兒游離DNA以及文庫構(gòu)建。經(jīng)羅氏480熒光定量PCR儀對文庫進行定量后，經(jīng)illumina NexSeq CN500平臺進行第二代高通量測序，通過生物信息分析，得到各染色體的Z值。21，18，13三條染色體，Z值絕對值≥3，提示異常。除上述3條以外的其他常染色體，Z值絕對值≥5，提示異常。女性胎兒X染色體，Z值絕對值≥4，提示異常。男性胎兒性染色體要綜合參考X染色體和Y染色體的Z值進行分析[9]。

1.2.3 計算cffDNA占比的方法 挑選男胎樣本作為訓練集，通過比對到Y(jié)染色體的方法計算得到cffDNA在母血總游離DNA中的占比(cffDNA/總游離DNA*100%=cffDNA%)。根據(jù)以下公式計算大小比例(size ratio,SR):SR=P(100-150)/P(163-169)，其中，P(100-150)是指長度為100～150bp片段的百分比，P(163-169)是指長度為163～169bp片段的百分比。根據(jù)訓練集每個樣本的片段分布結(jié)果與cffDNA%，用最小二乘法一次線性函數(shù)擬合，即SR=a+b*cffDNA%，其中a是截距，b是斜率。其中擬合參數(shù)截距0.7890，斜率0.0328，相關(guān)系數(shù)R=0.768。根據(jù)以上擬合得到的參數(shù)可用于計算cffDNA占比，即cffDNA%=(SR-a)/b。

1.2.4 cffDNA占比過高或過低 cffDNA%≥95th百分位，數(shù)值≥20.0%，定為cffDNA%偏高;cffDNA%≤5th百分位，數(shù)值≤5.82%，定為cffDNA%偏低。cffDNA%適中組：5th百分位

1.3 隨訪妊娠結(jié)局 通過查閱門診和住院病歷以及電話隨訪，獲得妊娠結(jié)局。如2020年3月1日前沒有隨訪到妊娠結(jié)局視為失訪。各種不良妊娠結(jié)局的診斷標準參考《婦產(chǎn)科學》第9版[10]，包括GDM、妊娠期高血壓疾病(hypertensive disorder of pregnancy，HDP)、流產(chǎn)、早產(chǎn)、死胎、羊水過多、羊水過少、前置胎盤、胎盤早剝,新生兒窒息及新生兒死亡等。

2 結(jié) 果

2.1 血清學唐氏篩查孕婦基本特征 于中孕期行血清學唐氏篩查的孕婦共2483例，其中DS高風險181例、T18高風險16例、NTD高風險19例；DS中風險320例、T18中風險17例；DS、T18、NTD均為低風險的孕婦1930例。NTD高風險組平均預產(chǎn)期年齡為(26.6±3.0)歲，明顯低于其他各組(P<0.01)。DS高風險組合并胰島素依賴型糖尿病者占2.21%，高于低風險組(0.26%)(P<0.01)。各組的采樣孕周、體重及受孕方式均無統(tǒng)計學差異。見表1。

表1 血清學唐氏篩查孕婦基本特征

2.2 血清學唐氏篩查不同風險情況妊娠結(jié)局的差異 DS中風險組和T18中風險組發(fā)生各種不良妊娠結(jié)局的概率與低風險組孕婦均無明顯差異。DS高風險組的妊娠期糖尿病發(fā)生率為14.92%，遠高于低風險組(9.95%)(P=0.032);前置胎盤發(fā)生率為2.76%，高于低風險組(0.66%)(P=0.012)。T18高風險組胎兒染色體病發(fā)生率(6.25%)高于低風險組(0.15%)(P=0.024)。NTD高風險組早產(chǎn)發(fā)生率(21.05%)顯著高于低風險組(4.67%)(P=0.010)，自然流產(chǎn)率(10.53%)遠高于低風險組(1.02%)(P=0.015)，死胎/死產(chǎn)/新生兒死亡率(10.53%)明顯高于低風險組(0.3%)(P=0.001)。NTD組發(fā)生任一種妊娠并發(fā)癥和胎兒/新生兒異常的概率(47.37%和15.79%)均遠高于其他各組(P<0.01和P=0.032)。各組發(fā)生胎兒附屬物異常的概率均無差異。見表2～4。

表2 血清學唐氏篩查各組妊娠結(jié)局(妊娠并發(fā)癥)比較[n(%)]

表3 血清學唐氏篩查各組妊娠結(jié)局(胎兒/新生兒異常)比較[n(%)]

表4 血清學唐氏篩查各組妊娠結(jié)局(胎兒附屬物異常)比較[n(%)]

2.3 NIPT組孕婦基本特征 2322例行NIPT的孕婦中，高風險(包括常染色體三體，性染色體單體和三體，以及微缺失/微重復綜合征的高風險)共88例，低風險共2234例，其中cffDNA%偏低組106例，cffDNA%適中組2019例，cffDNA%偏高組109例。cffDNA%偏高組采樣孕周[(17.42±3.46)周]較其他三組大。cffDNA%偏低組年齡[(31.21±4.04)歲]和高風險組年齡[(31.57±4.60)歲]略高于其他兩組[(30.26±4.33)歲，(30.11±4.19)歲]。4組的BMI、受孕方式、既往不良孕產(chǎn)史差異無統(tǒng)計學意義。見表5。

表5 NIPT各組基本特征

2.4 NIPT高風險及cffDNA%偏低和cffDNA%偏低組偏高發(fā)生不良妊娠結(jié)局的比較 cffDNA%偏低組發(fā)生妊娠并發(fā)癥的概率最高，發(fā)生其中一種者占30.19%，同時出現(xiàn)兩種及以上者6.6%，其次為NIPT高風險組，出現(xiàn)一種妊娠并發(fā)癥者有21.59%，出現(xiàn)兩種及以上為4.55%，均高于cffDNA%適中組和偏高組(P<0.01)。NIPT高風險組和cffDNA%偏低組發(fā)生妊娠期高血壓疾病的概率(9.09%和8.49%)高于cffDNA%適中組和偏高組(2.63%和0%)(P<0.01)，發(fā)生妊娠期糖尿病的概率(12.5%和16.98%)也明顯高于其他兩組(8.62%和7.34%)(P=0.017)。cffDNA%偏低組自然流產(chǎn)發(fā)生率為8.49%，明顯高于其他三組(P<0.01)。NIPT高風險組沒有出現(xiàn)胎兒/新生兒合并癥的僅有51.14%，遠低于其他三組(P<0.01)，發(fā)生染色體異常者為40.91%、胎兒畸形為9.09%、新生兒疾病為13.64%，顯著高于其他三組(P均<0.01)。四組發(fā)生胎兒附屬物異常的概率無差異。見表6。

表6 NIPT各組妊娠結(jié)局比較[n(%)]

3 討 論

多年來，血清學唐氏篩查在全球范圍內(nèi)被廣泛用于產(chǎn)前篩查胎兒DS、T18、NTD的高風險人群。血清學唐氏篩查陽性的人群，除了DS、T18和NTD外，還易出現(xiàn)其他染色體異常如13-三體綜合征[11]和各種先天性結(jié)構(gòu)畸形[12]，而且患子癇前期、前置胎盤、胎盤早剝、妊娠丟失、早產(chǎn)、低出生體重兒、死胎、新生兒死亡等不良妊娠結(jié)局的概率增加[3，11-12]。

血清學唐氏篩查生化標記物AFP、β-HCG、uE3等主要由胎盤和(或)胎兒參與合成，它們在血清中的水平可以反映胎盤功能以及胎兒宮內(nèi)發(fā)育情況，因此對存在胎兒和胎盤生理功能改變的不良妊娠結(jié)局均有預測作用。HCG由胎盤合體滋養(yǎng)層細胞分泌，胎盤灌注不良、胎盤發(fā)育不全等病理狀態(tài)可導致滋養(yǎng)細胞反應性增生，進而導致HCG分泌量改變，母親血清中HCG也隨之改變。孕婦血清β-HCG水平過高或過低與胎兒宮內(nèi)發(fā)育遲緩、早產(chǎn)、自然流產(chǎn)、低出生體重兒、GDM等發(fā)生相關(guān)[13]。uE3合成前體大部分來自胎兒，借助胎兒肝臟和腎上腺中的酶，最終在胎盤完成合成。胎盤功能受損缺血缺氧，可致血管內(nèi)皮細胞損傷，并釋放化學因子，誘導滋養(yǎng)細胞凋亡，uE3合成減少，血清uE3降低。孕婦血清低uE3時胎兒宮內(nèi)生長受限和低出生體重兒發(fā)生風險增加[14]。AFP早期產(chǎn)生于卵黃囊，晚期來自于胎兒肝臟和胃腸道，少量AFP穿過胎盤，可在母體血清中測定。胎兒缺陷如NTD等可導致羊水中AFP濃度增加以及胎盤損傷引起從胎兒到母體的循環(huán)轉(zhuǎn)移增加均可導致母親血清AFP增加。AFP升高的婦女中除了胎兒神經(jīng)管缺陷外，發(fā)生子癇前期、小于胎齡兒、死產(chǎn)/新生兒死亡的概率均增加[5]。

當胎兒為DS時，母親血清β-HCG升高，而在胎兒為T18時降低；胎兒為DS或T18時母親血清學AFP、uE3均降低；胎兒發(fā)生NTD時，孕婦血清AFP升高[15]。Baer等[3]將9051例血清學唐氏綜合征高風險孕婦的妊娠結(jié)局與30928例低風險孕婦比較，發(fā)現(xiàn)高風險組子癇前期、前置胎盤、胎盤早剝以及小于20周的胎兒丟失均高于低風險組；兩項及以上高風險的孕婦，出現(xiàn)胎兒和新生兒死亡的概率會增加。有研究發(fā)現(xiàn)，DS血清學篩查結(jié)果為極高風險(風險值≥1/20)者出現(xiàn)胎兒染色體異常、胎兒超聲結(jié)構(gòu)異常、自然流產(chǎn)、死胎和早產(chǎn)的概率均高于普通高風險孕婦(1/20>風險值≥1/270)[2]。NTD高風險的截斷值是AFP≥2.5MoM，而Allen等[5]研究中，當AFP>2.0MoM時，發(fā)生子癇前期、小于胎齡兒、死產(chǎn)/新生兒死亡風險就明顯增大。

本研究發(fā)現(xiàn)，血清學唐氏篩查的陽性預測值(positive predictive value,PPV)并不高，216例高風險中，只有1例T18高風險為真陽性。此外，高風險孕婦發(fā)生不良母胎結(jié)局的概率大大增加，如：DS高風險組妊娠期糖尿病和前置胎盤發(fā)生率遠高于低風險組；NTD高風險組發(fā)生任一種妊娠并發(fā)癥的概率可高達47.37%，發(fā)生任一胎兒/新生兒異常的概率也有15.79%，均遠高于低風險組；早產(chǎn)率、自然流產(chǎn)率、死胎/死產(chǎn)/新生兒死亡率與低風險組相比都是增加的。因此，血清學唐氏篩查高風險人群，尤其是NTD高風險，即便是假陽性，都應密切注意各項產(chǎn)檢指標，加強孕期健康指導，降低不良妊娠結(jié)局的發(fā)生率。

與傳統(tǒng)的血清學唐氏篩查相比較，NIPT具有更高的PPV，目前在臨床得到越來越多的應用。除了DS、T18和13-三體綜合征外，NIPT還可用于篩查其他常染色體和性染色體非整倍體以及微缺失/微重復綜合征[1]。在妊娠期間，胎盤細胞滋養(yǎng)細胞和合胞滋養(yǎng)細胞經(jīng)歷了融合和凋亡的生理周期，DNA片段從胎盤釋放到母體循環(huán)中。NIPT是對含有母體和胎盤的游離DNA片段的母體血漿樣本進行測序和生物信息分析。胎盤與總(由母體和胎盤組成)游離DNA比率稱為胎兒分數(shù)(fetal fraction of cell-free DNA,cffDNA%)[16]。妊娠相關(guān)的病理狀態(tài)可導致孕婦外周血總的游離DNA和胎兒游離DNA水平變化，cffDNA%亦可反映胎盤功能和體積。如在早發(fā)性子癇前期患者中，外周血總的游離DNA和胎兒游離DNA濃度增加，cffDNA%降低[17]。這可能是由于胎盤局部缺血引發(fā)滋養(yǎng)細胞凋亡加速、血管和終末器官損傷導致炎癥因子釋放、胎盤功能障礙時母體循環(huán)中游離DNA的清除率降低等。胎兒游離DNA能否成為一種新的生物標記物來預測子癇前期等不良妊娠結(jié)局將成為研究的新方向。Rolnik等[6]研究發(fā)現(xiàn)，cffDNA%越低，晚孕期發(fā)生子癇前期和胎兒生長受限的風險越大。日本一項關(guān)于5582例NIPT低風險孕婦的多中心研究發(fā)現(xiàn)，孕晚期出現(xiàn)妊娠期高血壓疾病的孕婦在孕早期進行NIPT檢測時的cffDNA%偏低[7]。在一項NIPT檢測失敗率為1.1%的研究中，發(fā)現(xiàn)因cffDNA過低而致NIPT檢測失敗的孕婦晚期流產(chǎn)、染色體異常、先兆子癇和妊娠期糖尿病的發(fā)生率都顯著增加[8]。

本研究顯示，cffDNA%偏低組最易發(fā)生妊娠并發(fā)癥，其次是NIPT高風險組，這兩組發(fā)生妊娠期高血壓疾病和GDM的概率均明顯高于cffDNA%適中組和偏高組。此外，cffDNA%偏低組孕婦還易出現(xiàn)自然流產(chǎn)。而NIPT高風險組胎兒/新生兒結(jié)局最差，真陽性36例(占40.91%)，其中29例選擇引產(chǎn)，7例(均為性染色體異常)決定繼續(xù)妊娠。除去引產(chǎn)的孕婦外，該組發(fā)生胎兒畸形和各種新生兒疾病的概率顯著高于其他三組。因此，NIPT高風險人群孕期除應重點排除染色體疾病和胎兒畸形以外，還需監(jiān)測和預防妊娠期高血壓疾病和GDM，胎兒娩出后應注意是否會出現(xiàn)新生兒窒息等疾病。NIPT低風險當cffDNA%≤5.82%時需要關(guān)注是否出現(xiàn)HDP、GDM和自然流產(chǎn)等妊娠并發(fā)癥。

綜上所述，除了目標疾病以外，產(chǎn)前篩查還可對妊娠并發(fā)癥和胎兒/新生兒不良結(jié)局做出評估。本研究樣本量偏少，但也得出了相對可靠和有意義的結(jié)論，可為臨床有針對性地監(jiān)測和預防不良妊娠結(jié)局的發(fā)生提供一定依據(jù)。后續(xù)我們?nèi)詴^續(xù)研究，并把血清學唐篩篩查和NIPT兩者結(jié)合，以期獲得更好的預測效果。