鄧登輝，段文波，王 顥，李 芬，吳少英1,**

（1.河南農業(yè)大學植物保護學院，鄭州 450000；2.海南大學植物保護學院，?？?570228）

擬果蠅Drosophilasimulans是雙翅目Diptera果蠅科Drosophilidae果蠅屬Drosophila一種世界性害蟲，主要為害楊梅、葡萄、香蕉等經(jīng)濟水果[1]。擬果蠅也是一種入侵生物，與黑腹果蠅Drosophilamelanogaster同源性很高，具有繁殖能力強、生活周期短和世代重疊等特點。擬果蠅這些特征容易造成暴發(fā)性危害，在我國云南等水果產(chǎn)區(qū)在收獲時就深受其害[2]。擬果蠅在東亞地區(qū)的首次報道是 20世紀初期日本的小笠原島，1972年在日本境內迅速擴張造成暴發(fā)，甚至在其數(shù)量上迅速超過黑腹果蠅[3,4]。我國武漢最早于1993年報道擬果蠅[5]，1996年于北京地區(qū)有發(fā)現(xiàn)，近30年的時間里就已經(jīng)擴散至我國各個省市，并逐漸適應新環(huán)境，形成具有穩(wěn)定特性的群體，這些群體以遺傳距離和地理位置大致分為南北兩大支系[6]。擬果蠅的擴散與人類貿易活動和遷移有密切關系。在生產(chǎn)上對于擬果蠅以化學防治為主，國內主要使用的是擬除蟲菊酯類農藥、印楝素農藥和多殺菌素類農藥等[7,8]。雖然國內暫時未收到擬果蠅對各類農藥產(chǎn)生抗性的報道，但在我國其近源昆蟲橘小實蠅Bactroceradorsalis和家蠅Muscadomestica已經(jīng)對擬除蟲菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生了嚴重的抗藥性[9,10]。

擬除蟲菊酯殺蟲劑的作用靶標是鈉離子通道，菊酯藥劑會引起昆蟲神經(jīng)性中毒反應，毒殺害蟲。鈉離子通道是糖基化大分子蛋白，它是由一個大分子α亞基和幾個小分子β亞基組成[11]。在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)的α亞基有9種，種類不同存在的動物組織區(qū)域也不同。昆蟲絕大部分只有一種α亞基基因，包含Ⅰ～Ⅳ共4個同源跨膜結構域和DEKA模塊，DEKA模塊指每個結構域P環(huán)上分別有D、E、K、A四個氨基酸殘基，此模塊決定了鈉離子通道的離子選擇性。鈉離子通道位于結構域ⅢS6和ⅣS1之間，存在一個疏水性氨基酸堿基構成的失活閥門，哺乳動物為異亮氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸（Ilt-Phe-Met），簡稱IFM；而昆蟲中則是甲硫氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸（Met-Phe-Met），簡稱MFM，其保守性在不同物種之間極高[12]。DEKA與MFM為昆蟲鈉離子通道的關鍵氨基酸位點。第一個被鑒定出昆蟲鈉離子通道的昆蟲是黑腹果蠅，隨后家蠅、德國小蠊Blattellagermanica、岡比亞按蚊Anophelesgambiae、煙蚜夜蛾Heliothisvirescens等也被相繼獲得[13-16]。鈉離子通道是神經(jīng)系統(tǒng)與毒素作用的重要結構，許多種神經(jīng)毒素可以與之發(fā)生作用，如河豚毒素、蛤蚌毒素、藜蘆堿、箭毒蛙毒素、多肽毒素、擬除蟲菊酯、DDT和阻斷劑茚蟲威（indoxacard）等[17]。擬除蟲菊酯殺蟲劑作用于昆蟲神經(jīng)鈉離子通道后，鈉離子通道可以有選擇地改變與殺蟲劑結合部位的結構從而引起 kdr（knock-down resistent）抗性，降低了昆蟲對擬除蟲菊酯殺蟲劑的敏感性[18]。在昆蟲體內鈉離子通道蛋白的多樣性是通過選擇性剪接和RNA編輯實現(xiàn)的，其方式是在mRNA中進行不同方式的剪接來產(chǎn)生剪接異構體[19]以及mRNA的遺傳信息通過核苷酸的變化發(fā)生改變[20]，這些受體蛋白不僅會因為選擇性剪接的不同而產(chǎn)生不同的轉錄結果，也會由于氨基酸編碼序列缺失、替換或者刪除導致蛋白氨基酸組成發(fā)生改變，二者的存在均對通道的控制性和藥理學特性產(chǎn)生影響。

隨著擬除蟲菊酯藥劑施用，擬果蠅對其也可能產(chǎn)生抗藥性，研究擬果蠅鈉離子通道基因刻不容緩。本文根據(jù)NCBI和擬果蠅轉錄組測序獲得的數(shù)據(jù)設計引物，從擬果蠅中克隆鈉離子通道基因序列，對克隆得到的擬果蠅鈉離子通道基因進行序列對比分析，鑒定擬果蠅鈉離子通道的典型特征，構建系統(tǒng)發(fā)育樹，明確擬果蠅在進化上是否保守以及與其他昆蟲種類鈉離子通道的進化關系。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲和地點

試驗于2017年9月至2018年10月在河南農業(yè)大學植物保護學院昆蟲神經(jīng)毒理實驗室完成。供試昆蟲由本課題組長期人工飼養(yǎng)，室內飼養(yǎng)條件：溫度約25 ℃，相對濕度75%～80%，光周期16L:8D。飼料配方：玉米面17 g，蔗糖16 g，香蕉泥15 g，蘋果泥15 g，可食用瓊脂1 g，水500 mL，酵母粉3 g，丙酸0.5 mL。

1.2 主要試劑

Trizol-RNA抽提試劑盒（天根），DL10000 DNA Marker（TaKaRa）、PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa），Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase（南京Vazyme）、Clone Express?ⅡOne Step Cloning Kit（南京Vazyme），Cycle Pure Kit（美國OMEGA），StarGreen核酸染料（北京康潤），大腸桿菌XL-10（北京博邁德），Tris飽和酚、瓊脂糖、氨芐青霉素（北京索萊寶）。

1.3 擬果蠅總RNA的提取和反轉錄合成cDNA

提取羽化2～3 d的成蟲30頭，用Trizol法進行總RNA的粗提，然后對其粗提產(chǎn)物進行凝膠電泳，檢測其完整性。選取部分產(chǎn)物，檢測其OD值，選260/280值在1.8～2.0區(qū)間的樣品立即進行后續(xù)試驗。按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒要求合成cDNA，并放于-20 ℃或-80 ℃保存。

1.4 引物合成及基因序列克隆和測序

根據(jù)NCBI和轉錄組的序列數(shù)據(jù)，利用Primer 5.0 軟件設計特異性引物，設計一對擬果蠅鈉離子通道全長特異性引物（表1），進行PCR 擴增，獲得PCR產(chǎn)物。PCR反應在50 μL體系中進行，每個反應包含2×Phanta Max Buffer（Mg2+plus）25 μL、cDNA 模板2 μL、ddH2O 17 μL、Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1 μL、dNTPs（10 mmol/L）1 μL 和上下游引物各 2 μL。擴增條件：95 ℃預變性 3 min，95 ℃變性15 s，58.5 ℃復性15 s，72 ℃延伸5 min，共30 個循環(huán)，最后72 ℃延伸8 min。

表1 擬果蠅鈉離子通道基因克隆所用引物Table 1 Primers used for the cloning of Drosophila simulans sodium channel

取出部分PCR產(chǎn)物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收目的條帶，用PCR純化回收試劑盒Cycle Pure Kit，回收目的產(chǎn)物，將目的產(chǎn)物與載體PGH19連接，再轉化到XL-10感受態(tài)細胞中。經(jīng)抗氨芐培養(yǎng)基篩選，鑒定陽性克隆子進行測序，利用DNASTAR.Lasergene 7軟件進行拼接。

1.5 鈉離子通道核苷酸序列編碼的氨基酸序列分析和系統(tǒng)進化樹構建

鈉離子通道核苷酸序列利用在線網(wǎng)站NCBI進行Blast比對，使用DNASTAR.Lasergene 7和Gene.doc軟件進行同源比對分析，通過Protparam 軟件分析編碼蛋白的氨基酸序列組成、相對分子質量等理化性質。

采用28種昆蟲的鈉離子通道氨基酸序列，通過Mega 7.0[21]對昆蟲氨基酸數(shù)據(jù)集進行進化模型的選擇，應用鄰接法構建分子系統(tǒng)發(fā)育樹，并進行2000次的檢驗評估。

2 結果與分析

2.1 擬果蠅鈉離子通道基因序列分析

克隆獲得擬果蠅完整鈉離子通道基因，命名為Drosophilasimulans-soudium channel（DsNav1）（圖1），其GenBank登錄號為MT113357。該基因編碼區(qū)長為6270 bp，共編碼2090個氨基酸，蛋白分子量為235 kD，等電點4.73（圖2）。擬果蠅鈉離子通道與黑腹果蠅和家蠅的鈉離子通道基因相似度分別為96.86%和88.75%。對DsNav1的跨膜結構進行分析發(fā)現(xiàn)，該基因包含鈉離子通道的典型結構特征含有4個同源跨膜結構域I、II、III和IV，每個結構域都含有6個跨膜疏水性螺旋體S1～S6，其中，S1～S4為電壓感受模塊，感受電壓變化，S5、S6以及連接他們的LOOP組成孔模塊，電壓模塊和孔模塊之間是通過短肽連接的，由于其結構域上LOOP的氨基酸殘基不同，形成其獨特的離子選擇性，這4個氨基酸殘基分別是D、E、K、A且具有高度保守性。在結構域IIIS6和IVS1間的多肽鏈是昆蟲鈉離子通道快速失活所必須的MFM模塊，具有昆蟲鈉離子通道的典型特征，鑒定為擬果蠅鈉離子通道（圖3）。

圖1 擬果蠅鈉離子通道全長基因電泳圖（1,2,3,4為鈉離子通道全長基因電泳圖）Fig.1 Electrophoresis map of full-length gene of sodium channel of Drosophila simulans (1,2,3,4 are full-length electrophoresis maps of sodium ion channels)

圖2 擬果蠅鈉離子通道氨基酸序列圖Fig.2 Sodium channel amino acid sequences of Drosophila simulans

圖3 擬果蠅鈉離子通道拓撲圖Fig.3 Topological diagram of Drosophila simulans sodium channel

2.2 分子系統(tǒng)進化分析

用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建DsNav1與其他昆蟲種群電壓門控鈉離子通道基因的氨基酸序列進化樹（圖4），從結果上可以看出，擬果蠅鈉離子通道基因與黑腹果蠅鈉離子通道遺傳距離最近，與瓜實蠅Bactroceracucurbitae和橘小實蠅鈉離子通道基因遺傳距離稍遠，且雙翅目昆蟲鈉離子通道基因聚為一支，其次鱗翅目昆蟲鈉離子遺傳通道與其比較接近。該系統(tǒng)進化樹分支與昆蟲分類學上物種分類十分吻合，昆蟲鈉離子通道基因具有高度保守的特性。

圖4 部分昆蟲鈉離子通道構建系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.4 Partial insect sodium channel builds phylogenetic tree

2.3 選擇性剪切

在擬果蠅鈉離子克隆的結果中，發(fā)現(xiàn)了3個選擇性剪接分別是exon i、exon a和exon b，這三個選擇性剪接均位于結構域I～II的連接肽區(qū)域，其氨基酸及核苷酸序列如圖5。exon b單獨存在，exon i和exon a相鄰，但不同時缺失。

圖5 擬果蠅鈉離子通道3個選擇性剪接氨基酸及其核苷酸序列Fig.5 Three alternative splicing amino acids and nucleotide sequences of Drosophila simulans sodium channel

2.4 RNA編輯

分析擬果蠅鈉離子通道基因序列，鑒定出17個核苷酸變化（表2），其中10個引起氨基酸改變，這10個氨基酸變化中有8個是由A至I的RNA編輯導致的，另外兩種則是由U至C的RNA編輯引起。大部分的編輯位點在于各結構域之間和結構域模塊的短肽鏈上。

表2 擬果蠅鈉離子通道RNA編輯的氨基酸位點及核苷酸變化Table 2 Amino acid sites and nucleotide changes in RNA editing of Drosophila simulans sodium channel

3 討論

世界上首次分離的昆蟲鈉離子通道基因是黑腹果蠅的para基因，它與脊椎動物鈉離子通道有極高的同源性。雖然在此之前也克隆獲得與哺乳動物同源性很高的DSC1基因[22]，但隨后研究證明其編碼為鈣離子家族陽離子通道。para基因的輔助亞基tipE對para基因表達有幫助，比para基因單獨表達電位上升和失活速率都快[23]。目前為止，在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)9種鈉通道蛋白亞型，而且存在時空和組織部位上的表達差異性[24]，使哺乳動物鈉離子通道具有不同的蛋白亞型，并具有不同生理和藥理的功能特性。而昆蟲絕大部分只有一種鈉離子通道基因，蚜蟲如麥長管蚜[25]等是利用兩個離子鈉通道基因行使鈉通道功能。

昆蟲鈉離子通道通過選擇性剪接和RNA編輯兩種形式增加蛋白多樣性。目前為止，鈉離子通道的選擇性剪接已在家蠅、黑腹果蠅、綠盲蝽Apolyguslucorμm[26]等多種昆蟲物種中被發(fā)現(xiàn)。雙翅目昆蟲黑腹果蠅的鈉離子通道基因有9個可剪接的外顯子，有7個在細胞內連接肽上的選擇性外顯子a、b、e、f、h、i、j，有2個在結構域II、III的跨膜區(qū)的互斥外顯子c/d、l/k[27]。其近似種擬果蠅中也存在選擇性剪接，發(fā)現(xiàn)3種選擇性外顯子i、a、b，其中exon i 和exon a 相鄰，并出現(xiàn)連鎖現(xiàn)象，此現(xiàn)象在半翅目昆蟲綠盲蝽的鈉離子通道中也有呈現(xiàn)。綠盲蝽鈉通道發(fā)現(xiàn)外顯子n、o、a和p有7種選擇性剪接類型。四外顯子連鎖頻率較低（2.08%），三外顯子連鎖僅發(fā)生在外顯子o、a、p，有三種類型的雙外顯子連鎖（外顯子a和p，o和p，o和a），外顯子a和p單獨存在，外顯子p的頻率（40.63%）高于其他外顯子。這對于外顯子s和q一起出現(xiàn)或單獨出現(xiàn)，缺失外顯子q和s的選擇性剪接類型的頻率（63.55%）高于其他類型[26]。關于外顯子的剪接情況，在不同物種中剪接結果是不同的，如exon i在直翅目、半翅目、膜翅目、鱗翅目等常見昆蟲中均有發(fā)現(xiàn)，在較低級物種類群尚未發(fā)現(xiàn)，如哲水蚤目[28]。各類型外顯子會對鈉通道造成不同的影響，如外顯子f會促進離子通道向超極化方向偏移，外顯子j和e則會導致鈉離子通道活化向去極化移動，外顯子h會使鈉離子通道失活去極化偏移，外顯子b則會影響鈉離子通道的表達程度，不存在外顯子b的鈉離子通道表達量會比存在外顯子 b的通道類型顯著增加[29,30]?；コ馔怙@子 k/l存在差異，含有外顯子 l的鈉通道電流持續(xù)大一些[31]。兩對互斥外顯子在很多物種中都具有保守性，但是在德國小蠊中只存在外顯子c，并沒有外顯子d[29]。德國小蠊中存在的三個外顯子，分別是G1、G2、G3，且G1、G2對應于果蠅外顯子l和k，外顯子G3包含一個終止密碼子，產(chǎn)生只有前兩個結構域的蛋白[32]。在哺乳動物中也有類似的G3外顯子，也具有終止密碼子，并產(chǎn)生類似的截短蛋白。在已報道的文獻中黑腹果蠅存在的選擇性剪接在綠盲蝽AlNav基因[26]、家蠅Vssc1基因[33]、德國小蠊BgNav基因[32]、埃及伊蚊AedesaegyptiAaNav基因[34]等中具有一定保守性，但即使同一種選擇性外顯子，其利用率在不同種群中也有差別，如黑腹果蠅和家蠅中外顯子b的利用率有60%[33]，德國小蠊鈉離子通道中的外顯子b的使用率卻低于20%，在綠盲蝽中外顯子b占有50%以上的使用頻率[26]。隨著測序技術不斷提高，昆蟲選擇性剪切信息越來越多的呈現(xiàn)，對于其在昆蟲鈉通道中發(fā)揮的作用會越來越清晰。

RNA編輯是擴大生物遺傳信息的另一種方式[35]。由于核苷酸的缺失、插入和置換，基因轉錄序列與編碼不符，使產(chǎn)生的蛋白質氨基酸組成發(fā)生變化。對RNA進行編輯的酶稱為RNA編輯酶，研究最多的是ADAR1（RNA依賴性腺嘌呤脫氨酶），該酶可以將特殊位點的腺苷（A）去氨基轉化為次黃嘌呤（I），導致核苷酸序列發(fā)生變化，甚至蛋白質也產(chǎn)生改變，這類編輯稱為A至I編輯。在擬果蠅鈉離子通道的分析中發(fā)現(xiàn)，由A至I的RNA編輯的位點有三個位點Q52R、C189Y和N1260D，這三個位點在黑腹果蠅[36-39]也曾被報道。然而這些編輯位點是否會帶來電壓門控以及藥劑的結合程度的變化仍需確定[12]。在德國小蠊的鈉離子通道中的K184R位點，會使鈉離子通道激活向去極化方向偏移，與其相似的C189Y位點是否會有類似的作用還有待證明。RNA編輯也會改變鈉離子通道門控性質，在其表達上會有微小差別，也可引起巨大的行為反差，如棉鈴蟲鈉離子通道的A-I編輯引起I951V位點的突變，降低了與擬除蟲菊酯類藥劑結合的敏感性[40]。

擬除蟲菊酯類殺蟲劑作用于鈉離子通道會引起興奮、抽搐、運動失調甚至死亡等癥狀。擊倒抗性是鈉離子通道敏感度降低引起對DDT和擬除蟲菊酯抗性的重要機制。已報道的抗性相關位點在4個結構域均有分布，常見的kdr突變位點如結構域IIS6的L1014F，該突變在不同昆蟲種類中會突變?yōu)椴煌陌被幔绫奖彼?、色氨酸、絲氨酸等[41]，這些突變引起IIS6構象發(fā)生變化，使鈉通道與擬除蟲菊酯類藥劑的結合能力減弱。突變位置在IS6的V410M，該突變點在抗性煙蚜夜蛾和果蠅中被發(fā)現(xiàn)，會極大地降低通道的敏感程度[42]。同一個突變位點對于不同類型的擬除蟲菊酯類藥劑造成的結果也是不同的，如F1534C位點，極大降低了與I型擬除蟲菊酯類藥劑的結合，可對于II型擬除蟲菊酯藥劑無效[43]。由此可見鈉通道氨基酸突變能影響與藥劑結合，藥劑構型的不同也會影響與鈉通道的結合。

本研究成功克隆擬果蠅鈉離子通道基因，并發(fā)現(xiàn)的3個選擇性剪接外顯子和17個RNA編輯。后續(xù)研究中抗性突變位點的確定是重要方向，及時發(fā)現(xiàn)擬果蠅鈉離子通道kdr抗性突變，研究其與藥劑的結合能力及篩選合適藥劑，對擬除蟲菊酯殺蟲劑使用壽命的延長具有重要意義，也可以極大程度上延緩抗性品種的產(chǎn)生。