劉 琪，耿麗麗，劉春琴，王慶雷，張 杰，柏 錫，束長龍*

（1.東北農業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱 150030；2.中國農業(yè)科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193；3.滄州市農林科學院，滄州 061001）

蠐螬是鞘翅目Coleoptera金龜總科Scarabaeoedea幼蟲的統(tǒng)稱，按食性可分為植食性、糞食性和腐食性3類，其中植食性以鰓金龜科Melolonthidae和麗金龜科Rutelidae的一些種類為主[1]，其幼蟲為害作物地下部分，成蟲取食作物地上部分，并返回土壤中產(chǎn)卵。我國為害作物的蠐螬種類主要有暗黑鰓金龜Holotrichia parallela、大黑鰓金龜Holotrichiaoblita和銅綠麗金龜AnomalacorpulentaMotschulsky[2]，大黑鰓金龜2年發(fā)生1代，暗黑鰓金龜和銅綠麗金龜1年分別發(fā)生1代；大黑鰓金龜幼蟲期一般在330～450 d、暗黑鰓金龜幼蟲期一般在300～330 d、銅綠麗金龜幼蟲期一般在300～330 d，因此蠐螬在花生、大豆等作物的整個生育期都會發(fā)生為害；蠐螬成蟲不集中產(chǎn)卵，并且產(chǎn)卵地點也不固定，這些生物學特性使得蠐螬防治極為困難?；ㄉ镌獾较擉楹螅p則減產(chǎn)20%左右，重則減產(chǎn)60%～70%，甚至顆粒無收[3,4]。目前，蠐螬防治的主要手段是在作物根部施用化學農藥，截止到2020年2月，國內登記的防治蠐螬的351個農藥產(chǎn)品中化學農藥占350個（http://www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml），而生物農藥只有1個（球孢白僵菌可濕性粉劑PD20102133，江西天人生態(tài)股份有限公司）[5]。

微生物殺蟲劑具有安全無毒、無殘留和對環(huán)境友好等優(yōu)點[6,7]。目前，國內圍繞防治蠐螬的微生物殺蟲劑已經(jīng)開展了深入的研究，分離評估了大量的微生物菌株，其中效果較好的有蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）[8-12]、球孢白僵菌（Beauveriabassiana，Bb）[13,14]、綠僵菌Metarhiziumspecies等[15,16]，然而登記防治蠐螬的微生物產(chǎn)品卻很少，原因在于在實際應用過程中，生防微生物有著諸如在土壤環(huán)境中適應能力較弱、持效期較短和速效性普遍低于化學農藥等問題，并且很難準確把握害蟲的防治時期，導致防治效果不理想。這些問題阻礙了相關生物殺蟲劑的推廣應用。對生防微生物來說，目前缺少一種可以提升防治效果，又可以延長作用時間的有效劑型。與可濕性粉劑相比，農藥顆粒劑（Granule）具有可控釋放速度、持效期長和使用方便等特點，并且目前我國尚無登記防治蠐螬的微生物顆粒劑型農藥，因此研制顆粒劑型的微生物殺蟲劑具有廣闊的前景和應用價值。

為了提高對地下害蟲的防治效果，德國學者Pascal等[17]利用了金針蟲對CO2的趨性，開發(fā)了一種以印楝素為主要殺蟲活性的物質，利用“玉米粉-酵母”發(fā)酵釋放CO2進行誘殺的顆粒劑，取得了較好的效果。近年來，有研究表明蠐螬對 CO2也存在較強的趨性[18]；此外，本實驗室前期研究表明，對蠐螬有效的 Bt菌株（Bt185）可以在花生粕壓制的顆粒內增殖生長，正常產(chǎn)生殺蟲蛋白，并且菌體在土壤中能夠增殖 40倍左右[19]，這些研究結果為進一步研制具有誘殺功能的防治蠐螬的病原微生物顆粒劑型奠定了基礎。本研究在實驗室前期研究的基礎上，進一步研究了適于目前農業(yè)機械施用的Bt、白僵菌顆粒載體。具體研究內容包括優(yōu)化顆粒載體制備工藝與配方，分析顆粒載體增殖生防微生物能力，以及評估顆粒載體對Bt、白僵菌防治蠐螬效果的影響等幾個方面，相關研究結果為防治蠐螬的生物農藥的研究與應用提供了新思路，對推進蠐螬等地下害蟲的綠色防控具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 顆粒載體原料 玉米粉、花生粕和鈣基膨潤土（400目）等均購自北京冰達生物技術有限公司。

1.1.2 供試病原菌株與昆蟲 Bt菌株Bt185-gfp為實驗室前期構建[19]，具有卡那霉素抗性，增殖時可表達綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）；Bt185[20]粉劑由本實驗室分離、制備、保存；球孢白僵菌粉劑由中國農業(yè)科學院植物保護研究所草地害蟲研究組惠贈；暗黑鰓金龜幼蟲由河北省滄州市農林科學院植物保護研究所提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 液體LB培養(yǎng)基、固體LB培養(yǎng)基均購自北京酷來搏科技有限公司；固體PDA培養(yǎng)基購自美國BD公司。

1.1.4 抗生素 卡那霉素購自Amresco公司：水溶液50 mg/mL，配制時過0.22 μm濾膜，過濾除菌，-20 ℃保存，使用時按照1‰比例加入；可溶性兩性霉素B購自北京索萊寶科技有限公司：2.5 mg/mL，-20 ℃保存，使用時用去離子無菌水稀釋1000倍。

1.1.5 儀器設備 為了快速制備無菌基礎顆粒，本研究采用了單螺桿膨化造粒機（模具孔徑3 mm），型號為DFM-80，購自河北新星機械廠；為了檢測Bt在顆粒劑上增殖情況，本研究采用了奧林巴斯熒光體視顯微鏡，型號為SZX16。

1.2 顆粒載體的制備、直徑和重量的測量及吸水后形態(tài)穩(wěn)定性評估

將玉米粉、花生粕、膨潤土按照1:0:0、3:1:0、1:1:0、1:3:0、1:3:2五種配比并分別以15%和20%兩種加水量（質量:體積）進行混合，攪拌均勻后經(jīng)膨化機高溫膨化、切制成顆粒；隨機分別取30粒顆粒，進行直徑和重量測量，計算每種顆粒的直徑和重量；將顆粒放在1.4%水瓊脂表面上，通過吸水后的形態(tài)變化來評估顆粒的形態(tài)穩(wěn)定性，最終篩選確定最佳的顆粒載體配比。

1.3 對蠐螬有效的生防菌株在顆粒載體上增殖情況檢測

1.3.1 菌株Bt185在顆粒載體上的活菌增殖情況檢測 將菌株Bt185-gfp接種于LB瓊脂平板，過夜活化。挑取綠色單克隆，轉接于1/2 LB液體培養(yǎng)基，30 ℃、220 r/min恒溫培養(yǎng)至芽胞釋放。進一步離心收集芽胞，用滅菌水洗滌去除可溶性蛋白，進一步將上述芽胞配制成1.3×105CFU/μL的懸浮液。每個顆粒接種10 μL Bt185-gfp菌液后，置于1.4%的水瓊脂表面上，30 ℃恒溫培養(yǎng)。利用熒光體視顯微鏡分別檢測在無菌液及接種菌液0、48、96 h后顆粒上的熒光強度，以判斷Bt185的增殖情況。

1.3.2 球孢白僵菌在顆粒載體上的生長情況觀測 將1 g球孢白僵菌粉劑均勻懸浮于10 mL滅菌水中，每粒顆粒接種10 μL菌液，將顆粒放入滅菌的1.4%水瓊脂表面，28 ℃條件培養(yǎng)，觀測白僵菌生長情況。

1.4 菌株Bt185與球孢白僵菌間的對峙培養(yǎng)

將球孢白僵菌接種在PDA固體培養(yǎng)基上生長，待生長出分生菌絲與分生孢子后，取直徑5 mm的菌塊，將其置于直徑90 mm的LB固體培養(yǎng)基中心，距離中心25 mm處分別放置3片滅菌直徑6 mm圓形濾紙片，分別滴加Bt185菌液（或Bt185-gfp）10 μL，兩性霉素B及LB液體培養(yǎng)基各10 μL作為對照，28 ℃培養(yǎng)5 d后檢測結果。

1.5 顆粒載體對Bt和球孢白僵菌殺蟲活性的影響

1.5.1 Bt懸液的制備 將1 g Bt185粉劑加入50 mL滅菌水中，配制成Bt懸液，放入冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 Bt顆粒劑的制備 將配置好的Bt懸液吸取20 μL，加到一粒顆粒載體表面，制成顆粒載體＋Bt的顆粒劑，現(xiàn)用現(xiàn)制。

1.5.3 Bb懸液的制備 將1 g Bb粉劑加入50 mL滅菌水中，配制成Bb懸液，放入冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 Bb顆粒劑的制備 將配置好的Bb懸液吸取20 μL，加到一粒顆粒載體表面，制成顆粒載體＋Bb的顆粒劑，現(xiàn)用現(xiàn)制。

1.5.5 Bt＋Bb顆粒劑的制備 將配制好的Bt懸液和Bb懸液各吸取10 μL，加到一粒顆粒表面，制成顆粒載體＋Bt＋Bb的顆粒劑，現(xiàn)用現(xiàn)制。

1.5.6 顆粒劑對暗黑鰓金龜幼蟲的殺蟲活性測定 將馬鈴薯條（5 mm×5 mm×40 mm）作為飼料放入6孔生測板中，設置5組處理：每孔加入20 μL Bt懸液、每孔加一粒Bt顆粒劑、每孔加入20 μL Bb懸液、每孔加一粒Bb顆粒劑、每孔加一粒Bt＋Bb顆粒劑，分別以每孔加20 μL滅菌水、每孔加含有20 μL滅菌水的顆粒載體作為對照，每個生測孔內上面覆蓋含水量20%的土壤，并接入1頭健康、個體大小均勻的7～10 d齡暗黑鰓金龜幼蟲，每12頭試蟲為一組，3次重復。在溫度為（28±1）℃，光周期為16L:8D，相對濕度70%～80%的人工氣候箱中飼養(yǎng)7 d后，分別統(tǒng)計各自活蟲數(shù)、死蟲數(shù)，計算校正死亡率，校正死亡率（%）＝（對照存活率―處理存活率）/對照存活率，并利用SPSS 17.0對所得數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 顆粒載體的制備、直徑和重量的測量及吸水后形態(tài)穩(wěn)定性

為了篩選出最佳的顆粒載體配方，本研究將玉米粉、花生粕、膨潤土設置了5種配比及兩種加水量（15%和20%），通過單桿螺旋膨化設備制備成顆粒，并對顆粒的顏色、大小及密度進行了統(tǒng)計。結果顯示，玉米粉、花生粕、膨潤土的比例不同，膨化后顆粒大小顏色也不相同；隨著花生粕含量的增加，顆粒的密度逐漸增加；20%加水量的顆粒略小于15%加水量的顆粒（圖1）。

圖1 不同營養(yǎng)成分配比的顆粒載體制備及吸水后形態(tài)變化Fig.1 Preparation of granular carriers with different proportion of nutrients and morphological change after water absorption

進一步精確測量了不同配方顆粒的直徑和重量。結果顯示，隨著花生粕含量的增多，顆粒的直徑和重量均呈現(xiàn)下降的趨勢（圖2、3）。在目前農業(yè)生產(chǎn)中，有專門用于撒播尿素等肥料顆粒產(chǎn)品的機械，因此本研究參照尿素顆粒直徑規(guī)格（2.0～4.8 mm）進行顆粒載體篩選，結果表明，玉米粉、花生粕、膨潤土比例在1:1:0、1:3:0、1:3:2三種顆粒（圖1C、D、E）的直徑大小符合要求。此外，本研究還測定了不同顆粒載體在吸水條件下的結構穩(wěn)定性，將顆粒置于水瓊脂表面吸脹24 h后進行觀測，發(fā)現(xiàn)玉米粉含量高的顆粒以及加入膨潤土的顆粒沒有開裂（圖 1A、B、E），并且在顆粒制備過程中發(fā)現(xiàn)，20%的加水量擠壓膨化出顆粒過程更加流暢，不易損傷機器。綜合以上指標分析，最終確定玉米粉、花生粕、膨潤土比例為1:3:2，20%加水量為最佳的顆粒載體配比，用于進行下一步研究。

圖2 不同營養(yǎng)成分配比的顆粒載體直徑測量Fig.2 Measurement of the diameter of granular carriers prepared with different proportion of nutrients

圖3 不同營養(yǎng)成分配比的顆粒載體重量測量Fig.3 Measurement of the weight of granular carriers prepared with different proportion of nutrients

2.2 菌株Bt185在顆粒載體上的增殖情況

為了檢測Bt菌株在顆粒載體上增殖的情況，本研究利用對暗黑鰓金龜幼蟲有效的Bt菌株（Bt185-gfp）進行了增殖測試。結果顯示，隨著培養(yǎng)時間增加，熒光體視顯微鏡檢測到顆粒載體上熒光逐漸增加；當剛剛接種Bt185-gfp菌液時，觀察不到明顯的熒光；培養(yǎng)48 h后，觀察到明顯的熒光；培養(yǎng)到96 h時，熒光強度進一步增加（圖4）。上述結果說明Bt可以在本研究制備的顆粒載體上增殖生長。

圖4 Bt185-gfp菌株在顆粒載體上的增殖情況熒光檢測Fig.4 Fluorescence detection of Bt185-gfp proliferation on granular carrier

2.3 球孢白僵菌在顆粒載體上的生長情況觀測

為了檢測球孢白僵菌在顆粒上生長情況，本研究將球孢白僵菌懸液接種到顆粒表面，并將顆粒置于水瓊脂表面上進行觀測。結果表明，球孢白僵菌可以利用顆粒載體營養(yǎng)萌發(fā)生長，72 h后菌絲體長至5～10 mm，進一步培養(yǎng)可以形成孢子（圖5）。

圖5 球孢白僵菌在顆粒載體上的生長情況Fig.5 Growth of B.bassiana on granular carrier

2.4 Bt185與球孢白僵菌間的對峙培養(yǎng)分析

為了評估Bt與球孢白僵菌之間是否存在相互抑制作用，本研究進行了白僵菌與Bt185菌株的對峙培養(yǎng)試驗。結果顯示，白僵菌的菌絲體從培養(yǎng)基中心向周圍擴散生長，Bt185對白僵菌的菌絲無抑制作用，而兩性霉素B周圍形成了明顯的抑菌圈；同時，從培養(yǎng)皿底部可以觀察到Bt185正常生長，周圍形成菌苔（圖6）。上述結果表明，Bt185與球孢白僵菌之間沒有拮抗作用，兩種生防菌株可以協(xié)同使用。

圖6 Bt185與球孢白僵菌間的對峙培養(yǎng)Fig.6 Bt185 and B.bassiana by confrontation culture

2.5 顆粒載體對Bt和球孢白僵菌殺蟲活性的影響

為了分析顆粒載體對 Bt和球孢白僵菌殺蟲效果的影響，本研究測定了Bt185粉劑、Bb粉劑、顆粒載體＋Bt185、顆粒載體＋Bb以及顆粒載體＋Bt185＋Bb五個處理對暗黑鰓金龜7～10日齡幼蟲的校正死亡率。結果顯示，顆粒載體與Bt185結合后，對暗黑鰓金龜幼蟲的校正死亡率由單獨使用Bt185粉劑的（25.22±6.07）%提升至（51.47±2.65）%，殺蟲效果是粉劑的2倍；顆粒載體與白僵菌結合后，校正死亡率由單獨使用白僵菌粉劑的（34.61±6.47）%提升至（64.57±5.04）%，殺蟲效果同樣提升了近2倍；并且顆粒載體與兩種生防菌株聯(lián)合使用的校正死亡率達（77.55±4.16）%，顯著高于Bt185或白僵菌的單一粉劑（圖7），上述結果表明顆粒載體能夠提升Bt和白僵菌的殺蟲效果。

圖7 顆粒載體與Bt和球孢白僵菌結合對暗黑鰓金龜幼蟲的生物活性影響Fig.7 Effects of the combination of the granular carrier with B.thuringiensis and B.bassiana on the biological activity of the H.parallela larvae

3 討論

微生物殺蟲劑具有環(huán)境友好和對靶標生物安全等優(yōu)點，但是，其目前在蠐螬防控方面存在防治成本高、環(huán)境適應性差、持效期短等問題，限制了其應用。本研究研制的可增殖多種對蠐螬有效的生防微生物的顆粒載體，通過增加土壤中殺蟲微生物及殺蟲蛋白的量，提高殺滅蠐螬的機會。此外，本研究研制的顆粒在吸水條件下有較好的結構強度，使得內部營養(yǎng)可以緩慢釋放，可以延長殺蟲微生物在土壤中宿存的時間，進一步提高蠐螬防治效果。因此，本研究研制的顆粒載體可以用于降低蠐螬的防治成本、提升防治效果，為蠐螬生物防治提供了新思路。

Bt、白僵菌和綠僵菌等是最常用的生物殺蟲劑。Bt通過消化道作用于靶標害蟲，Bt產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白（Insecticidal Crystal Proteins，ICPs）被取食后，在昆蟲腸道中被蛋白酶激活，活化的殺蟲蛋白進一步與中腸上皮細胞表面特異性受體結合、形成穿孔、并導致細胞凋亡，Bt與腸道細菌進入血腔，引起敗血癥，進一步殺滅靶標害蟲[21]。白僵菌和綠僵菌的分生孢子直接通過體表作用于靶標昆蟲。分生孢子在昆蟲體表附著萌發(fā)，形成的芽管穿透昆蟲表皮進入血腔，菌絲在血腔內不斷生長并釋放毒素，最終殺滅靶標害蟲[22]。因為Bt和白僵菌作用機制不同，兩者聯(lián)合使用可以提高殺蟲效果[23,24]。本研究評估了對暗黑鰓金龜有效的Bt與白僵菌菌株，兩者沒有拮抗作用，并且都可以在顆粒載體上增殖，進一步的殺蟲活性測定顯示兩者協(xié)同使用可以顯著提升殺蟲效果。相關研究結果為蠐螬生防產(chǎn)品的研發(fā)與使用提供了參考資料。但本研究只測試了 Bt與白僵菌兩種菌株，更多對蠐螬有效的生防微生物能否利用顆粒載體營養(yǎng)增殖生長，以及不同接菌量對殺蟲效果的影響，仍然需要進一步的研究。

此外，花生粕是花生仁經(jīng)榨油后的產(chǎn)物[25]，富含蛋白質與多糖，可用作生產(chǎn)有機肥的原料。有研究表明，花生粕發(fā)酵后對植物的生長具有顯著的促進作用[26]。本研究中的顆粒載體是以花生粕作為主要原料，搭載生防微生物后施于植物根部附近。有研究表明，生防微生物在增殖過程中分泌的水解酶分解有機質產(chǎn)生的小分子以及代謝形成的化合物可誘導植物抗病、促進植物生長[27]。因此，今后在防治蠐螬等地下害蟲過程中，顆粒載體對植物的生長發(fā)育是否存在積極的影響具有進一步研究的價值。

綜上所述，本研究通過優(yōu)化工藝與配方，制備了一種可以利用現(xiàn)代農用機械施用、結構穩(wěn)定、可增殖、對蠐螬有效的生防微生物的顆粒載體，明確了其提升 Bt與白僵菌殺蟲活性的作用，相關研究結果對開發(fā)蠐螬高效生物殺蟲劑提供了新思路，對突破蠐螬生物防治的瓶頸有重要意義。