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        飛蝗脂肪酸去飽和酶家族基因表達(dá)及功能分析

        2021-04-21 03:39:08楊洋張建珍趙小明
        關(guān)鍵詞:分析

        楊洋,張建珍,趙小明*

        (1.山西大學(xué) 應(yīng)用生物學(xué)研究所,山西 太原 030006;2.山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,山西 太原 030006)

        0 引言

        昆蟲(chóng)是無(wú)脊椎動(dòng)物中種類(lèi)最大、數(shù)量最多的類(lèi)群,其表皮具有天然屏障的功能能夠使蟲(chóng)體適應(yīng)不同的環(huán)境條件[1]。昆蟲(chóng)表皮脂類(lèi)的結(jié)構(gòu)和含量是決定其在干燥高溫等逆境環(huán)境中能否生存的主要因素。此外,作為昆蟲(chóng)表皮重要成分之一,脂類(lèi)物質(zhì)在避免昆蟲(chóng)體內(nèi)水分蒸發(fā)、防止外源物質(zhì)滲入和信息素合成等方面具有重要作用。然而,目前關(guān)于昆蟲(chóng)表皮脂類(lèi)合成機(jī)制尚不清楚。

        昆蟲(chóng)表皮的主要化學(xué)組分是幾丁質(zhì)和蛋白質(zhì),此外,還有酚類(lèi)和脂類(lèi)等化學(xué)物質(zhì)。昆蟲(chóng)表皮的脂類(lèi)主要存在于上表皮中,是由真皮細(xì)胞、脂肪體和絳色細(xì)胞等參與合成的,合成的原料一部分來(lái)自食物中的脂肪酸。脂肪酸的合成在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生,從線粒體運(yùn)出的乙酰CoA開(kāi)始,在乙酰CoA羧化酶(Acetyl-CoA-Carboxylase,ACC)的作用下,合成丙二酰CoA[2]。之后,在脂肪酸合成酶(Fatty acid sythetase,F(xiàn)AS)等作用下,在NADPH酶存在下催化丙二酰CoA轉(zhuǎn)化為棕櫚酸酯,隨后在脂肪酸延長(zhǎng)酶(Elongases,Elo)和去飽和酶(Desaturases,desat)的催化作用下,合成長(zhǎng)鏈乙酰輔酶A硫酯[3]。Desat在脂肪酸合成過(guò)程中起著十分重要的作用,其幾乎存在于所有生物中如藻類(lèi)、真菌、植物和動(dòng)物,且種類(lèi)眾多,能夠催化脂酰輔酶A雙鍵的形成[4]。根據(jù)desat作用底物的不同,可以將其可分為2類(lèi):可溶性的?;?酰基載體(Acyl-ACP)蛋白和膜結(jié)合蛋白[5],然而目前在昆蟲(chóng)中關(guān)于desats的研究大多集中于信息素合成中的作用。

        本文以飛蝗(Locusta migratoria)為研究對(duì)象,基于已報(bào)道的飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)和基因組序列,搜索獲得飛蝗desat家族基因cDNA序列,并對(duì)其特征進(jìn)行分析;通過(guò)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)Lmdesats家族基因在五齡期飛蝗的時(shí)空表達(dá)模式;最后基于RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)分析Lmdesats家族基因的生物學(xué)功能,為基于表皮脂類(lèi)合成關(guān)鍵基因的害蟲(chóng)防治靶標(biāo)的篩選提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 供試?yán)ハx(chóng)

        試驗(yàn)蟲(chóng)卵保存于本實(shí)驗(yàn)室昆蟲(chóng)飼養(yǎng)室,在人工氣候箱孵化后轉(zhuǎn)移至潔凈的紗籠中(30 cm×30 cm×30 cm),在光周期為14L:10D,濕度為(40±10)%,溫度為(30±2)℃的條件下,以新鮮小麥幼苗和麥麩進(jìn)行飼喂,待長(zhǎng)至五齡進(jìn)行不同組織、不同發(fā)育天數(shù)取材以及RNA干擾實(shí)驗(yàn)。

        1.2 供試藥品

        RNA提取試劑(RNAiso Plus)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑等購(gòu)于大連寶生物公司(TaKaRa);雙鏈RNA合成試劑盒購(gòu)于Promega公司;膠回收試劑盒和Taq酶等購(gòu)于天根公司(TIANGEN)。

        1.3 實(shí)驗(yàn)方法

        1.3.1 飛蝗Desat家族基因cDNA序列獲得

        基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),搜索獲得3個(gè)Desats基因cDNA序列。結(jié)合飛蝗基因組數(shù)據(jù)庫(kù)[6],將獲得的Lmdesats基因cDNA序列與基因組序列進(jìn)行比對(duì)(http://www.locustmine.org/viroblast/viroblast.php),分析Lmdesats基因的內(nèi)含子和外顯子序列,并將其分別命名為L(zhǎng)mdesat1,Lmdesat2和Lmdesat3。通過(guò)SMART網(wǎng)站分析Lmdesats編碼蛋白結(jié)構(gòu)域以及ExPASy網(wǎng)站進(jìn)行分子量與等電點(diǎn)預(yù)測(cè),利用GENEDOC軟件與其它物種Desats進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì),最后利用TMHMM軟件分析其跨膜域。

        1.3.2 Desats聚類(lèi)分析

        將Lmdesat1、Lmdesat2和Lmdesat3序列分別在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST分析并下載黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、德國(guó)小蠊(Blattella germanica)、赤擬谷盜(Tribolium castaneum)、褐飛虱(Nilaparvata lugens)等不同昆蟲(chóng)物種Desats氨基酸序列。利用MEGA6.0軟件中鄰接法(neighborjoining,NJ)將Lmdesats氨基酸序列與其同源序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),獨(dú)立分析1 000次,數(shù)值代表bootstrap估算值。

        1.3.3 總RNA提取及Desat家族基因表達(dá)特性檢測(cè)

        摘取發(fā)育整齊的五齡第6天飛蝗若蟲(chóng)不同組織部位,包括體壁(IN)、前腸(FG)、中腸(MG)、后腸(HG)、胃盲囊(GC)、馬氏管(MT)、生殖腺(GD)、脂肪體(FB)和翅芽(WP),以及5齡每天(1-8天)翅芽或胃盲囊。利用RNA提取試劑提取不同組織和時(shí)期樣品總RNA并進(jìn)行定量(樣品稀釋成0.5 μg/μL),取1 μg總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合成并進(jìn)行10倍稀釋。利用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)Lmdesats基因和RPL32內(nèi)參基因的特異性表達(dá)引物(見(jiàn)表1,生工公司合成),利用熒光定量PCR方法檢測(cè)Lmdesats基因在不同組織和不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)特性,熒光定量PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考課題組方法進(jìn)行[7]。每個(gè)不同組織部位或發(fā)育日齡均由3頭試蟲(chóng)組成一個(gè)重復(fù),共計(jì)4個(gè)重復(fù)。以RPL32作為內(nèi)參基因,Lmdesats基因在不同組織部位或發(fā)育日齡的相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析。

        表1 Lmdesats研究中使用的引物Table 1 Primers ofLmdesatsused in this study

        1.3.4 基于RNAi的生物學(xué)功能分析

        根據(jù)Lmdesat1,Lmdesat2和Lmdesat3基因序列設(shè)計(jì)并合成含有T7啟動(dòng)子序列(表1中橫線部分)的RNAi引物(表1,生工公司合成),以5齡飛蝗cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)并利用膠回收試劑盒回收目的條帶。以1 μg回收產(chǎn)物作為模板,利用dsRNA合成試劑盒分別合成Lmdesat1,Lmdesat2和Lmdesat3基因dsRNA,同時(shí)合成綠色熒光蛋白基因(GFP)dsRNA作為對(duì)照,然后將合成的dsRNA定量并稀釋為2 μg/μL,電泳檢測(cè)其完整度。選取4齡第2天飛蝗若蟲(chóng)(共28頭試蟲(chóng),雌雄各半)用微量注射器將LmdesatsdsRNA(dsLmdesat1,dsLmdesat2和dsLmdesat3)從飛蝗第2和3腹節(jié)連接處注入體腔,注射劑量為10 μg/頭。注射等量的dsGFP作為對(duì)照(共28頭試蟲(chóng),雌雄各半),24 h后利用1.3.3中RNA提取和熒光定量PCR方法檢測(cè)Lmdesats基因沉默效率(3頭試蟲(chóng)組成一個(gè)生物學(xué)重復(fù),共計(jì)4個(gè)生物學(xué)重復(fù)),余下飛蝗(對(duì)照組和處理組各16頭)正常飼養(yǎng)用于表型觀察。

        1.3.5 數(shù)據(jù)分析

        Lmdesats家族基因組織、時(shí)期和沉默效率的相對(duì)表達(dá)量均采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析,采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS中Tukey’s HSD進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,P<0.05為差異顯著,字母(a,b,c,d和e)代表差異顯著性。采用Studentt-test方法進(jìn)行差異表達(dá)分析,*P<0.05表示差異顯著,**P<0.01表示差異極顯著。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 飛蝗Desat家族基因特性分析

        基于飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù),搜索獲得3條脂肪酸去飽和酶desat家族基因cDNA序列,分別命名為L(zhǎng)mdesat1,Lmdesat2和Lmdesat3,并上傳 Genbank,其登錄號(hào)分別為MN863500,MN863501和MN863502。結(jié)合基因組數(shù)據(jù)分析,Lmdesat1,Lmdesat2和Lmdesat3分別含有5個(gè),6個(gè)和6個(gè)外顯子(圖1A),開(kāi)放閱讀框1242 bp,966 bp和1083 bp,編碼413,321和361個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)Lmdesat1,Lmdesat2和Lmdesat3蛋白的分子量分別為46.7,37.4和40.3 kDa,等電點(diǎn)分別為6.34,9.03,9.22。與果蠅desat蛋白類(lèi)似,Lmdesat1和Lmdesat3均含有FA_desaturase結(jié)構(gòu)域,而Lmdesat2除了含有FA_desaturase結(jié)構(gòu)域外,還具有一個(gè)lipid_DES結(jié)構(gòu)域(圖1B)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),Lmdesat1,Lmdesat2和Lmdesat3蛋白與果蠅desat蛋白類(lèi)似均具有4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(圖1C),屬于膜結(jié)合蛋白類(lèi)型的脂肪酸去飽和酶。

        圖1 飛蝗Lmdesats基因結(jié)構(gòu)圖、編碼氨基酸結(jié)構(gòu)及跨膜域分析。A.飛蝗Lmdesats基因結(jié)構(gòu)圖;B.飛蝗Lmdesats編碼氨基酸結(jié)構(gòu);C.飛蝗Lmdesats跨膜域分析Fig.1 Genomic structure,coding amino acid structure and transmembrane domain analysis ofLmdesats A.The genomic structure ofLmdesats;B.the coding amino acid structure ofLmdesats;C.the transmembrane domain analysis ofLmdesats

        2.2 飛蝗Desat家族蛋白聚類(lèi)和序列比對(duì)分析

        在NCBI進(jìn)行BLAST分析并下載不同物種的同源desat氨基酸序列,進(jìn)行聚類(lèi)分析。結(jié)果顯示Lmdesat1,Lmdesat2和Lmdesat3分別與delta-9,delta-4和delta-11類(lèi)型的脂肪酸去飽和酶聚為一支,并且具有較高的同源性(圖2)。利用Lmdesat1,Lmdesat2和Lmdesat3序列分別與果蠅、內(nèi)華達(dá)古白蟻(Zootermopsis nevadensis)、德國(guó)小蠊、赤擬谷盜、褐飛虱的desat序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),Lmdesat1,Lmdesat2和Lmdesat3分別與delta-9,delta-4和delta-11類(lèi)型的desat具有較高的相似性,其中Lmdesat2與 delta-4 類(lèi)型的 Sphingolipid delta(4)-desaturase DES1同源性高達(dá)91%以上(圖3)。

        圖2 Lmdesats與不同昆蟲(chóng)物種間desats的系統(tǒng)聚類(lèi)分析Fig.2 Phylogenetic analysis ofLmdesatsand desats from different insect species

        圖3 Lmdesats與不同昆蟲(chóng)去飽和酶desats多序列比對(duì)Fig.3 Multiple sequence alignments ofLmdesatsand desats from different insect species

        2.3 飛蝗Desat家族基因在5齡不同組織部位和不同發(fā)育天數(shù)的表達(dá)

        為了探討desats家族基因組織表達(dá)特性,根據(jù)已經(jīng)得到的Lmdesats基因cDNA序列,合成特異性的表達(dá)引物,利用熒光定量PCR分析了Lmdesat1,Lmdesat2和Lmdesat3在5齡第6天飛蝗若蟲(chóng)的9個(gè)不同組織部位的表達(dá)。結(jié)果表明:Lmdesats組織表達(dá)具有多樣性,在多個(gè)組織中均有表達(dá),如體壁(IN)、中腸(MG)、后腸(HG)、脂肪體(FB)、胃盲囊(GC)、生殖腺(GD)、馬氏管(MT)和翅芽(WP)(圖4),其中Lmdesat1在胃盲囊、生殖腺和體壁中高表達(dá)(圖4A),Lmdesat2在馬氏管和翅芽中高表達(dá)(圖4B),而Lmdesat3在胃盲囊、中腸、后腸和馬氏管中高表達(dá)(圖4C)。

        圖4 熒光定量PCR檢測(cè)Lmdesats基因在5齡若蟲(chóng)不同組織和不同發(fā)育天數(shù)的表達(dá)特性A-C.Lmdesats基因在5齡飛蝗不同組織部位的表達(dá)水平;D-F.Lmdesats基因在5齡飛蝗不同發(fā)育天數(shù)的表達(dá)水平Fig.4 Expression ofLmdesatsin different tissues and different days of the fifth instar nymphs ofL.migratoriaby qPCR analysisA-C.The mRNAlevel ofLmdesatsin different tissues of fifth instar nymphs ofL.migratoria;D-F.The mRNAlevel ofLmdesats in different days of fifth instar nymphs ofL.migratoria.

        同樣方法對(duì)這3個(gè)基因在5齡期若蟲(chóng)不同發(fā)育天數(shù)的表達(dá)進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示:Lmdesat1和Lmdesat3在5齡第6天具有較高的表達(dá)而Lmdesat2在蛻皮前(第8天)高表達(dá)(圖4D-F)。

        2.4 飛蝗Desat家族基因的生物學(xué)功能分析

        將合成的dsLmdesats注射至5齡第2天飛蝗若蟲(chóng)(10 μg每頭蟲(chóng)),以注射等量的dsGFP為對(duì)照,正常飼養(yǎng)24 h后收集整蟲(chóng)提取總RNA,利用熒光定量PCR技術(shù)分別檢測(cè)Lmdesat1,Lmdesat2和Lmdesat3基因的沉默效率。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,注射dsLmdesats組中Lmdesats的表達(dá)量顯著降低,沉默效率均在50%以上(圖5A,B和D)。表型觀察顯示,84.2%的注射dsLmdesat3的飛蝗無(wú)法蛻皮,在蛻皮前致死;42.8%的注射dsLmdesat1的飛蝗能夠正常發(fā)育,但羽化為成蟲(chóng)后出現(xiàn)翅型紊亂的表型,而注射dsLmdesat2的飛蝗與對(duì)照組一樣未能出現(xiàn)可見(jiàn)表型,均能正常蛻皮、羽化(圖5C)。

        圖5 注射dsRNA后對(duì)Lmdesats基因表達(dá)及飛蝗發(fā)育的影響A:Lmdesat1沉默效率檢測(cè);B:Lmdesat2沉默效率檢測(cè);C:Lmdesat1和Lmdesat2沉默后的表型圖;D:Lmdesat3沉默效率檢測(cè)和沉默后的表型圖Fig.5 Effects of dsLmdesatson the expression ofLmdesats and the development ofL.migratoria

        3 討論

        脂類(lèi)是昆蟲(chóng)表皮重要成分之一,其具有避免昆蟲(chóng)體內(nèi)水分蒸發(fā)和防止外源物質(zhì)滲入的作用[8]。除此之外,脂類(lèi)在昆蟲(chóng)信息素合成、防御、生殖等方面同樣具有重要作用[9]。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,結(jié)合表皮形態(tài)學(xué)和蛋白分離等生物化學(xué)技術(shù),國(guó)內(nèi)外學(xué)者逐步開(kāi)展了昆蟲(chóng)表皮脂代謝關(guān)鍵酶基因的鑒定和功能解析,如脂肪酸合成酶基因FAS[10-11],延伸酶基因 ELO[12-13],還原酶基因 FAR[15]以及參與碳?xì)浠衔锖铣傻募?xì)胞色素P450(CPY4G)等[14-18],然而昆蟲(chóng)脂肪酸去飽和酶desat研究報(bào)道較少。Desat根據(jù)其結(jié)構(gòu)特性可分為可溶性?;??;d體蛋白和膜結(jié)合蛋白,研究報(bào)道可溶性Desat蛋白大多分布于植物質(zhì)體的基質(zhì)中[5]。膜結(jié)合蛋白根據(jù)其作用底物不同可以分為酰基輔酶A去飽和酶、‘front-end’-?;o酶A去飽和酶和脂酰脂去飽和酶[4]。本文識(shí)別的3個(gè)飛蝗desat均含有脂肪酸去飽和酶結(jié)構(gòu)域和4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域,屬于膜結(jié)合蛋白類(lèi)型的脂肪酸去飽和酶。

        昆蟲(chóng)desat首先在果蠅被報(bào)道[19],隨后發(fā)現(xiàn)該酶(Dmdesat1)具有Δ9功能特異性[20]。本文Lmdesat1與Dmdesat1聚為一支且具有較高相似性,同屬于Δ9類(lèi)型的脂肪酸去飽和酶,可能具有類(lèi)似的功能。Bonsquet等[21]研究發(fā)現(xiàn)Dmdesat1主要表達(dá)于果蠅脂肪體和絳色細(xì)胞,除此之外,在前腦中部、malpighi小管、直腸乳突、生殖系統(tǒng)組織(包括精囊、附腺和卵巢)中具有一定量的表達(dá),表現(xiàn)出組織表達(dá)多樣性。Falcon等在意大利蜜蜂(Apis mellifera)表皮轉(zhuǎn)錄組中識(shí)別了6個(gè)在表皮中高表達(dá)的desat相關(guān)基因[22]。Badouin等在螞蟻(Formica exsecta)轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)了6個(gè)Δ9 desat,可能在螞蟻間的信息交流中具有重要作用[23]。在家蠶(Bombyx mori)中鑒定到14個(gè)desats編碼蛋白,研究發(fā)現(xiàn)家蠶desat1和desat5~8具有Δ11酶活性,而desat3和desat4具有Δ9活性[24]。Haritos等從赤擬谷盜基因組中鑒定出15個(gè)Tcdesats基因,其中有8個(gè)編碼蛋白具有去飽和酶活性[4]。綜上所述,昆蟲(chóng)desat家族蛋白在數(shù)量、類(lèi)型和表達(dá)上均具有多樣性,并且大多具有去飽和活性。本文根據(jù)飛蝗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)和基因組數(shù)據(jù)獲得3個(gè)desat家族基因,分別屬于Δ4,Δ9和Δ11類(lèi)型的去飽和酶,可能具有不同的活性。Lmdesats組織和時(shí)期表達(dá)同樣顯示出多樣性,暗示其可能具有不同的生物學(xué)功能。

        在果蠅Dmdesat1突變體中,雌雄果蠅表皮不飽和烴含量顯著降低[20],表明其在烴類(lèi)合成中具有重要作用。除果蠅之外,目前關(guān)于昆蟲(chóng)desat的研究大多集中在信息素合成中的作用。如Albre等[25]從4種卷葉蛾(leafroller)中鑒定到6個(gè)desats去飽和酶,研究發(fā)現(xiàn)其中2個(gè)Δ9和1個(gè)Δ10去飽和酶參與信息素的合成。Hagstrom等[26]在斜紋卷蛾(Ctenopseustis obliquana)中鑒定出一種desat7去飽和酶,該酶僅對(duì)豆蔻酸的Δ5具有去飽和功能。此外,在鱗翅目昆蟲(chóng)玉米螟(Ostrinia)中,研究發(fā)現(xiàn)不同種間(亞洲玉米螟和歐洲玉米螟)的desat作用雙鍵位置不同(Δ11或Δ14),使產(chǎn)生的信息素種類(lèi)也不相同[27]。本文利用RNAi方法研究發(fā)現(xiàn)Lmdesat2不影響飛蝗的正常生長(zhǎng)發(fā)育,Lmdesat1影響成蟲(chóng)翅的發(fā)育,而沉默Lmdesat3則影響若蟲(chóng)的發(fā)育且80%以上若蟲(chóng)致死,但其具體活性及作用機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。本文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為desats基因在昆蟲(chóng)脂類(lèi)物種合成中的功能研究提供了基礎(chǔ),并為基于脂合成基因?yàn)榘袠?biāo)的害蟲(chóng)防治奠定理論依據(jù)。

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