李思艷，劉俊蕃，李 梅

（浙江農(nóng)林大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院， 浙江 杭州 311300）

近年來，隨著納米技術(shù)的發(fā)展，碳納米管作為一種新型吸附劑被廣泛應(yīng)用于多種重金屬的去除[1-2]。碳納米管表面的羧基、羥基等官能團與重金屬相互作用，提高了碳納米管對重金屬的吸附和選擇[3-7]，是影響碳納米管吸附重金屬的重要因素。除作為吸附劑使用外，碳納米管和重金屬在環(huán)境中共存時，也會影響重金屬的生態(tài)毒性。LIU等[8-9]發(fā)現(xiàn)：多壁碳納米管本身對斑馬魚Danio rerio沒有毒性，但卻由于吸附了鉛(Pb)和鋅(Zn)，加重了兩者在斑馬魚體內(nèi)的積累和毒性。MARTINEZ等[10]發(fā)現(xiàn)：硝酸氧化后的多壁碳納米管加劇了Pb在魚體中的累積。YU等[11]發(fā)現(xiàn)：表面未處理的多壁碳納米管會抑制大型蚤Daphnia magna對重金屬的吸收，而表面具有含氧官能團的多壁碳納米管吸附了重金屬，由于“木馬效應(yīng)”，重金屬在大型蚤內(nèi)大量積累。與其他生物相比，微生物既是生態(tài)食物鏈的最底層也是分解者，因此微生物的生態(tài)風(fēng)險評價更為重要。WANG等[12]發(fā)現(xiàn)：銅(Cu)和鉻(Cr)增強了碳納米管對微生物群落的影響。付勇等[13]對3種短多壁碳納米管和鎘離子(Cd2+)的復(fù)合細菌毒性進行了初步研究，但未闡明不同官能團對碳納米管吸附機制的影響[13]。在此基礎(chǔ)上，本研究以未經(jīng)修飾、羧基化、羥基化和氨基化多壁碳納米管為材料，通過Cd2+吸附平衡實驗和細菌毒性實驗評估不同官能團多壁碳納米管對重金屬吸附及對大腸埃希菌Escherichia coli毒性的影響，從多壁碳納米管與重金屬相互作用角度揭示表面官能團在多壁碳納米管影響重金屬細菌毒性中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

未經(jīng)修飾(MWCNTs)、羥基化(O-MWCNTs)、羧基化(C-MWCNTs)和氨基化多壁碳納米管(NMWCNTs)均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，純度＞95%，內(nèi)徑為3～5 nm，外徑為8～15 nm，長度約為50 μm。用超純水配制成1 000 mg·L-1的碳納米管懸液作為母液，使用前超聲分散15 min，并用超純水稀釋至所需質(zhì)量濃度。100 mg·L-1質(zhì)量濃度下，4種不同官能團多壁碳納米管的zeta電位、含氧量、電導(dǎo)率和pH等參數(shù)見表1。

表1 不同官能團多壁碳納米管的測定參數(shù)Table 1 Determination parameters of MWCNTs with different functional groups

用分析純四水硝酸鎘[Cd(NO3)2·4H2O]配制100 mg·L-1的Cd2+儲備液作為母液，使用前超純水稀釋至所需質(zhì)量濃度。以分離自生活污水的大腸埃希菌(Genbank收錄號：MG388227)為模型微生物，菌種保存于4 ℃冰箱中。使用前接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、150 r·min-1在恒溫振蕩器中培養(yǎng)過夜，然后3 000 r·min-1離心制備菌懸液。為排除鹽度影響，細菌用超純水離心洗滌2次，利用紫外-可見分光光度計調(diào)節(jié)D(600)至1.0，菌落數(shù)量約為1×109CFU·mL-1。

1.2 方法

1.2.1 不同官能團多壁碳納米管對Cd2+的吸附 固定多壁碳納米管質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1，調(diào)節(jié)Cd2+質(zhì)量濃度為 0 (對照)、1、2、5、10 和 15 mg·L-1。150 r·min-1、25 ℃ 恒溫振蕩 3 h；4 000 r·min-1離心后取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，利用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀(ICP，Prodigy7，利曼-徠伯斯公司，美國)測定濾液中Cd2+質(zhì)量濃度，計算平衡吸附量，繪制吸附等溫線。Langmuir吸附等溫式：q=qmKlc/1+Klc。其中：q為平衡吸附量(mg·g-1)，qm為單分子層飽和吸附量(mg·g-1)，Kl為平衡吸附常數(shù)，c為溶液中吸附質(zhì)平衡濃度(mg·g-1)。Freundlich吸附等溫式：q=Kfc1/n。其中：Kf為平衡吸附常數(shù)，n為常數(shù)。用Origin 9.0繪制吸附等溫線，分別用Langmuir和Freundlich吸附等溫式進行曲線擬合，得到qm、Kl以及Kf和n。

1.2.2 細菌毒性實驗 參考付勇等[13]、李梅等[14]進行細菌毒性實驗，采取染毒和生長抑制實驗相結(jié)合的方法。量取Cd2+母液，調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度至0(對照)、1、2、4、8、10 mg·L-1，定容至9 mL。量取各官能團多壁碳納米管懸液母液，調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度至0(對照)、10、20、50、100、200 mg·L-1，定容至9 mL。固定Cd2+質(zhì)量濃度至1 mg·L-1，分別加入0(對照)、10、20、50、100、200 mg·L-1的各官能團多壁碳納米管懸液，定容至9 mL。往各樣品中加入1 mL細菌懸液[D(600)=1.0]，150 r·min-1、25 ℃恒溫培養(yǎng)3 h進行染毒實驗。染毒結(jié)束后，取1 mL混合液轉(zhuǎn)移至9 mL滅菌后的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)，每隔1 h測定混合液600 mn波長處的吸光度[D(600)]。為避免顆粒沉降造成的影響，每次吸光度測定前樣品均先渦旋混合10 s。計算細菌存活率(%)：S=[D(600)t-s-D(600)o-s]/[D(600)t-c-D(600)o-c]。其中：D(600)o-c為對照組初始時刻600 nm下吸光度，D(600)t-c為對照組t時刻600 nm下吸光度，D(600)o-s為樣品組初始時刻600 nm下吸光度，D(600)t-s為樣品組t時刻600 nm下吸光度。根據(jù)對照組遲滯期長短，t時刻選取2或3，各組取的t時刻與對照組相同。利用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同官能團多壁碳納米管對 Cd2+的吸附

25 ℃條件下不同官能團多壁碳納米管對Cd2+的吸附等溫線見圖1，Langmuir和Freundlich等溫式擬合參數(shù)見表2。從圖1可以看出：相同條件下，不同官能團多壁碳納米管對Cd2+的吸附能力大小依次為羧基化多壁碳納米管、羥基化多壁碳納米管、多壁碳納米管、氨基化多壁碳納米管。結(jié)合表2可知：4種多壁碳納米管對Cd2+的吸附均可以用Langmuir和Freundlich方程較好地擬合，其中羥基化和羧基化多壁碳納米管的Langmuir和Freundlich擬合相關(guān)系數(shù)R2均達到了0.95以上。對于未修飾的多壁碳納米管和氨基化多壁碳納米管，F(xiàn)reundlich方程擬合效果更好。

圖1 不同官能團多壁碳納米管對Cd2+的吸附等溫線Figure 1 Adsorption isotherm of Cd2+ on MWCNTs with different functional groups

Langmuir吸附等溫式適用于表面均勻吸附劑的吸附，可預(yù)測最大吸附量，擬合相關(guān)系數(shù)R2值越接近于1，預(yù)測得到的最大吸附量將越接近于真實值。Freundlich吸附等溫式適用于不均勻表面吸附劑的吸附，n值越小代表越難吸附。由表2可以看出：羧基化多壁碳納米管吸附量最大，是羥基化多壁碳納米管的約2倍，是未修飾多壁碳納米管的約4倍；Langmuir吸附等溫式擬合的氨基化多壁碳納米管吸附方程對應(yīng)的R2值偏低，其計算最大吸附量比實際值要大；平衡吸附常數(shù)的大小也在一定程度上代表了吸附劑的吸附性能，4種碳納米管的Freundlich平衡吸附常數(shù)Kf與其最大吸附量相一致，說明Freundlich吸附等溫式更適用于分析不同多壁碳納米管對Cd2+的吸附。

表2 不同碳納米管對 Cd2+的吸附等溫線方程擬合參數(shù)Table 2 Regression parameters of adsorption isotherms of Cd2+ onto different MWCNTs

2.2 不同官能團多壁碳納米管對Cd2+細菌毒性的影響

2.2.1 Cd2+對大腸埃希菌的毒性 由圖2可知：1 mg·L-1的Cd2+處理下，大腸埃希菌存活率約為70%；隨著Cd2+質(zhì)量濃度升高(10 mg·L-1)，大腸埃希菌存活率緩慢但持續(xù)下降(50%)。為減少因Cd2+質(zhì)量濃度變化對多壁碳納米管毒性實驗的影響，后續(xù)實驗中固定Cd2+質(zhì)量濃度為1 mg·L-1。

圖2 Cd2+的細菌毒性Figure 2 Bacterial toxicity of Cd2+

2.2.2 多壁碳納米管對大腸埃希菌的毒性 從圖3可知：與對照相比，質(zhì)量濃度不大于200 mg·L-1時，不同官能團多壁碳納米管對大腸埃希菌存活不存在抑制作用，甚至不同程度提高了細菌的存活率，其中羧基化碳納米管對大腸埃希菌的存活最有利。

圖3 不同官能團多壁碳納米管的細菌毒性Figure 3 Bacterial toxicity of MWCNTs with different functional groups

2.2.3 多壁碳納米管對Cd2+細菌毒性的影響 固定Cd2+質(zhì)量濃度為1 mg·L-1，考察不同質(zhì)量濃度的4種官能團多壁碳納米管對Cd2+大腸埃希菌毒性的影響。從圖4可以看出：隨著多壁碳納米管質(zhì)量濃度的增大，4種官能團多壁碳納米管-Cd2+復(fù)合物處理下的大腸埃希菌存活率緩慢增加。與1 mg·L-1的Cd2+相比，當(dāng)復(fù)合物中多壁碳納米管質(zhì)量濃度達到200 mg·L-1時，細菌存活率提高了11%(未修飾多壁碳納米管)～14%(羧基化多壁碳納米管)，可見4種官能團多壁碳納米管均顯著降低了Cd2+的細菌毒性。

圖4 不同官能團多壁碳納米管對Cd2+細菌毒性的影響Figure 4 Effect of MWCNTs with different functional groups on toxicity of Cd2+ to E. coli

3 討論與結(jié)論

3.1 不同官能團多壁碳納米管對 Cd2+的吸附機制

碳納米管對重金屬的吸附機制包括物理吸附、靜電引力、表面絡(luò)合、離子交換等[15]。通常認為影響物理吸附的主要因素為吸附劑表面積，表面積越大，暴露的活性吸附點位也越多，吸附能力也越強[16]。本研究中4種多壁碳納米管管長和管徑相同，物理吸附能力(有效吸附面積，即吸附點位)主要與其在水中的分散性能有關(guān)。未修飾多壁碳納米管和氨基化多壁碳納米管在水中易團聚，羧基化和羥基化多壁碳納米管分散性能較好，因此對Cd2+的物理吸附性能優(yōu)于前兩者。碳納米管與Cd2+間的靜電引力主要取決于碳納米管的表面電荷。相較于其他3種多壁碳納米管，羧基化多壁碳納米管表面的羧基解離使－COOH變成了COO-，帶負電荷更多(表1)，與帶正電荷的Cd2+靜電吸引強，是羧基化多壁碳納米管對Cd2+的吸附能力大的原因[17]。多壁碳納米管含氧官能團對重金屬的吸附主要通過絡(luò)合作用[18-19]。XU等[20]發(fā)現(xiàn)：羧基化和羥基化多壁碳納米管都可與重金屬離子產(chǎn)生表面絡(luò)合作用。本研究發(fā)現(xiàn)：4種多壁碳納米管含氧量從大到小依次為羧基化多壁碳納米管、羥基化多壁碳納米管、多壁碳納米管、氨基化多壁碳納米管；結(jié)合圖1可知：多壁碳納米管含氧量越高，與Cd2+的反應(yīng)就越劇烈。本研究中未修飾的多壁碳納米管和氨基化多壁碳納米管對Cd2+的吸附主要為物理吸附和靜電引力，而羥基化和羧基化多壁碳納米管吸附Cd2+主要為絡(luò)合作用，與羥基相比，羧基與Cd2+的化學(xué)鍵能更強，因而絡(luò)合反應(yīng)也更大，即羧基化多壁碳納米管對Cd2+的吸附性能更好。

多壁碳納米管對Cd2+的吸附?jīng)Q定了水中游離Cd2+的質(zhì)量濃度，一定程度上影響了Cd2+的生物可利用性。利用碳納米管對溶解Cd2+質(zhì)量濃度的影響可預(yù)測其對Cd2+細菌毒性的影響。若不考慮碳納米管與細菌的接觸，僅考慮Cd2+細菌毒性的變化，羧基化多壁碳納米管對Cd2+細菌毒性的降低最明顯，其次為羥基化多壁碳納米管，氨基化多壁碳納米管和未修飾的多壁碳納米管對重金屬細菌毒性影響較小。

3.2 不同官能團多壁碳納米管對Cd2+細菌毒性的影響分析

3.2.1 Cd2+對大腸埃希菌的毒性分析 超純水中Cd2+主要以游離態(tài)存在，其致毒機制主要為與大腸埃希菌表面上的吸附位點結(jié)合，通過離子通道等途徑進入大腸埃希菌內(nèi)，并在某些特定部位富集[21]。實驗室條件下，Cd2+細菌毒性隨Cd2+質(zhì)量濃度增大(1～10 mg·L-1)而增強，在菌落數(shù)為1×108CFU·mL-1時，大腸埃希菌存活率從70%降至50%左右。

3.2.2 不同官能團多壁碳納米管對大腸埃希菌的毒性分析 目前認為碳納米管與細菌直接接觸對細胞膜穿刺造成的物理損傷是碳納米管對細菌產(chǎn)生毒性的重要因素[22]。碳納米管與細菌是否能夠直接接觸不僅取決于碳納米管表面電荷，還取決于碳納米管質(zhì)量濃度及分散狀況。本研究中4種多壁碳納米管表面均帶負電荷，其中羧基化多壁碳納米管負電荷最多，因此與帶負電荷的細菌之間存在靜電斥力，不利于接觸。但羧基化多壁碳納米管和羥基化碳納米管分散性較好，與細菌接觸機會相對更多；未修飾多壁碳納米管和氨基化多壁碳納米管團聚性較強，因團聚而大部分沉降，與細菌接觸機會較少。同時多壁碳納米管外徑為8～15 nm，長度約為50 μm，因接觸造成的物理損傷僅在細胞壁產(chǎn)生；因此可以認為多壁碳納米管對細菌生長沒有抑制。相反，羧基化多壁碳納米管存在條件下，細菌存活率提高；這是由于細菌正常生長需要適合的滲透壓，等滲條件下細菌抗毒能力強，低于等滲離子強度時，離子強度越大，細菌存活率越高[23]。為排除離子強度對碳納米管影響，本研究利用超純水為背景介質(zhì)，100 mg·L-1質(zhì)量濃度下，羧基化多壁碳納米管電導(dǎo)率最高，表面負電荷最多，與細菌的靜電斥力更強，因此羧基化多壁碳納米管存在條件下，細菌存活率明顯高于其他處理。

3.2.3 多壁碳納米管對Cd2+毒性的影響分析 多壁碳納米管對Cd2+毒性的影響可以從3個方面來解釋。①多壁碳納米管的毒性。多壁碳納米管吸附Cd2+后，表面負電荷均被中和，顆粒自團聚和顆粒與細菌間的異團聚性能均增加，2種團聚對細菌的毒性影響相反，因此多壁碳納米管吸附Cd2+前后自身毒性變化可以忽略。②游離態(tài)Cd2+的毒性。游離態(tài)Cd2+質(zhì)量濃度受到多壁碳納米管類型與質(zhì)量濃度的影響[24]。對4種多壁碳納米管的吸附等溫擬合發(fā)現(xiàn)：同等初始質(zhì)量濃度時，不同官能團多壁碳納米管對Cd2+的吸附能力從大到小依次為羧基化多壁碳納米管、羥基化多壁碳納米管、多壁碳納米管、氨基化多壁碳納米管，而由游離態(tài)Cd2+造成的細菌毒性與其質(zhì)量濃度一致。③多壁碳納米管-Cd2+復(fù)合物的毒性。除游離態(tài)Cd2+外，體系中存在的多壁碳納米管-Cd2+復(fù)合物也可能會對細菌產(chǎn)生毒性[13]。多壁碳納米管吸附Cd2+后表面負電荷降低，導(dǎo)致多壁碳納米管與細菌的接觸機會增加，此時，與多壁碳納米管結(jié)合能力弱的Cd2+將可能轉(zhuǎn)移至細菌表面對細胞膜產(chǎn)生損傷。另外，其物理損傷將會促進Cd2+進入細菌細胞內(nèi)，從而產(chǎn)生傷害[25-26]。未修飾多壁碳納米管-Cd2+復(fù)合物與氨基化多壁碳納米管-Cd2+復(fù)合物對細菌的毒性不能忽略?？傮w上多壁碳納米管吸附Cd2+造成的毒性降低大于多壁碳納米管與細菌直接接觸造成的毒性增強，因此表現(xiàn)為多壁碳納米管可降低環(huán)境Cd2+的細菌毒性。

3.3 結(jié)論

多壁碳納米管內(nèi)外管徑及長度均相同時，多壁碳納米管吸附Cd2+性能與其表面官能團含氧量有關(guān)，含氧量越高，吸附能力越強。即4種多壁碳納米管對Cd2+質(zhì)量濃度降低程度從高到低依次為羧基化多壁碳納米管、羥基化多壁碳納米管、多壁碳納米管、氨基化多壁碳納米管。4種多壁碳納米管對Cd2+的吸附在不同程度上降低Cd2+生物有效性，同時碳納米管-Cd2+復(fù)合物也存在一定毒性，總體上多壁碳納米管質(zhì)量濃度越高，對Cd2+細菌毒性降低越顯著，相比之下，羧基化多壁碳納米管表現(xiàn)了更強的降毒能力。