張吉玲，陳 鋼，曹光球，林思祖,，鄭 宏，李 勇

（1. 福建農(nóng)林大學(xué) 林學(xué)院，福建 福州 350002；2. 福建農(nóng)林大學(xué) 國(guó)家林業(yè)草原杉木工程技術(shù)研究中心，福建福州 350002；3. 福建省洋口國(guó)有林場(chǎng)，福建 順昌 353200）

杉木Cunninghamia lanceolata是中國(guó)南方最重要速生樹種之一，具有較強(qiáng)的萌芽能力[1-2]。隨著現(xiàn)代林業(yè)的發(fā)展，無性林業(yè)成為當(dāng)今社會(huì)林業(yè)發(fā)展的一個(gè)主要方向。隨著近十幾年來的杉木苗木繁育技術(shù)的研究，杉木無性繁殖取得了較大的突破，無性系造林面積越來越大。組培和扦插是杉木無性繁育的2個(gè)主要途徑。由于杉木組培工廠化育苗過程中還普遍存在增殖系數(shù)低、生根率低等問題，扦插繁殖是杉木無性繁育的最主要途徑。杉木采穗圃是提供穗條的最主要場(chǎng)所，為促進(jìn)杉木的萌蘗能力，提高穗條的產(chǎn)量，去頂、壓彎及基部損傷處理是常用的幾種措施。目前，對(duì)母樹的彎干、截干、淺栽、施肥等方面進(jìn)行了研究[3-4]。機(jī)械損傷后，植物產(chǎn)生一系列次生代謝產(chǎn)物，如酚類、黃酮類、萜類、生物堿等，它們集中在傷口及其附近，參與傷口愈合反應(yīng)，抵抗昆蟲或病原體的入侵[5]。抗氧化酶在催化這一途徑中起著非常重要的作用，對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育、紫外線輻射防治、抗蟲害和植物支持系統(tǒng)的形成具有重要的意義和價(jià)值，其活性可作為衡量植物抗逆性強(qiáng)弱的指標(biāo)[6]。酚類物質(zhì)在植物抗生物脅迫機(jī)制中起著重要作用。機(jī)械損傷也被認(rèn)為是誘導(dǎo)植物防御的重要手段之一[7]。雖然近年來對(duì)機(jī)械損傷影響植物防御酶的影響研究較多，但是關(guān)于機(jī)械損傷和不同埋土深度處理對(duì)杉木無性系萌蘗抗氧化酶活性的機(jī)制研究卻鮮少報(bào)道。本研究以萌蘗能力較強(qiáng)的杉木無性系洋020扦插苗為研究對(duì)象，通過室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，分析機(jī)械損傷和不同埋土深度對(duì)無性系萌蘗能力及不同器官抗氧化酶活性的影響，為揭示杉木萌蘗機(jī)制以及杉木人工林的高效培育奠定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

材料為福建省洋口國(guó)有林場(chǎng)提供的1年生杉木洋020扦插苗。挑選生長(zhǎng)健壯、長(zhǎng)勢(shì)一致、無病蟲害的苗木，平均苗高30 cm，地徑為5 mm。盆栽土壤為山地黃心土，有機(jī)質(zhì)49.00 g·kg-1，全氮1.09 g·kg-1，水解氮 1.32 mg·kg-1，速效磷 2.30 mg·kg-1，速效鉀 151.30 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家林業(yè)草原杉木工程技術(shù)研究中心田間實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。2019年3月中旬將杉木無性系洋020扦插苗種植于花盆(21 cm×26 cm×27 cm)中，3株·盆-1。培養(yǎng)基為黃心土。采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)，6個(gè)處理，處理1為去頂埋土深度0 cm (TP1)，處理2為去頂埋土深度3 cm (TP2)，處理3為去頂埋土深度6 cm (TP3)，處理4為未去頂埋土深度0 cm (ck1)，處理5為未去頂埋土深度3 cm (ck2)，處理6為未去頂埋土深度6 cm (ck3)；去頂處理為苗木培養(yǎng)7 d后剪去頂稍1 cm；每個(gè)處理40盆，共240盆。盆栽后定期調(diào)查不同處理杉木基部的萌芽數(shù)。培養(yǎng)期間定期給苗木澆自來水，保持土壤含水率在65%左右；定期除草。2019年6月30日(萌蘗初期)、7月31日(萌蘗中期)、8月31日(萌蘗后期)取已萌芽的洋020扦插苗的枝葉、基部皮及根尖樣品，每個(gè)處理采集9株，每3株混成1個(gè)待測(cè)樣，每個(gè)部位待測(cè)樣3個(gè)重復(fù)。不同部位樣品取樣后迅速放入液氮中，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存待測(cè)。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 萌蘗數(shù)調(diào)查 2019 年4月30日、5月31日、6月30日、7月31日、8月31日分別調(diào)查不同處理幼苗的萌蘗數(shù)。

1.3.2 抗氧化酶活性測(cè)定 參照李合生的方法[8]取葉片、基部皮及根尖0.2 g，加入0.05 mol·L-1pH 7.8磷酸緩沖液228.75 mL，母液B(NaH2PO4)21.25 mL，用蒸餾水稀釋至1 000 mL。在冰浴中用研缽研磨成勻漿，稀釋至4 mL刻度離心管，在4 ℃下以10 000 r·min-1的速度冷凍離心20 min，并將上清液置于4 ℃冰箱中冷藏。超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定參照丁紅等[9]方法，以抑制氮藍(lán)四唑(NBT)光還原的50%為1個(gè)酶活性單位。過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性參照SHALATA等[10]的方法測(cè)定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Excel 2010和SPSS 22.0軟件進(jìn)行整理和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 機(jī)械損傷和埋土深度對(duì)杉木無性系萌蘗的影響

表1結(jié)果顯示：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，杉木萌蘗均呈上升趨勢(shì)，隨著埋土深度的增加，杉木萌蘗能力呈逐漸下降的趨勢(shì)，在相同埋土深度條件下，去頂處理比未去頂處理杉木萌蘗能力更強(qiáng)。萌蘗后期(8月)，埋土深度0、3、6 cm去頂處理苗的萌蘗數(shù)與同一埋土深度未去頂處理相比分別提高15.11%、6.73%及3.49%；去頂處理苗埋土深度6 cm處理的萌蘗數(shù)分別比埋土深度3及0 cm處理降低5.67%及34.29%，未去頂處理苗埋土深度6 cm處理的萌蘗數(shù)分別比埋土深度3及0 cm處理降低4.21%及25.87%。

表1 機(jī)械損傷和不同埋土深度處理下杉木無性系萌蘗差異Table 1 Difference of tillering of Chinese fir clones treated by mechanical damage and different soil depth

2.2 機(jī)械損傷和埋土深度對(duì)杉木無性系不同部位抗氧化酶活性的影響

2.2.1 SOD活性 由圖1看出：在萌蘗后期，杉木幼苗基部皮SOD活性除TP2較低外，其余處理均顯著高于前期和中期。ck1、ck2、ck3、TP1、TP3的杉木幼苗枝葉萌蘗后期SOD活性相比于前期分別提高36.08%、45.76%、63.65%、31.56%、57.27%，相比于中期分別提高了41.99%、25.77%、49.59%、49.00%、21.23%。杉木幼苗枝葉SOD活性普遍以TP1較低，在萌蘗前期、中期和后期分別為300.99、343.08、354.89×16.67 nkat·g-1。在后期，ck3、ck2和TP3的杉木幼苗枝葉SOD活性相比于前期和中期顯著上升，其中相比于前期分別提升了40.57%、54.06%和76.00%，相比于中期分別提升了18.28%、46.95%和45.86%。而杉木幼苗不同機(jī)械損傷和不同埋土深度間處理下的杉木幼苗根尖SOD活性則不具有明顯規(guī)律。

圖1 機(jī)械損傷和不同埋土深度處理下杉木幼苗SOD活性Figure 1 SOD activity of Chinese fir seedlings under mechanical damage and different soil depth treatments

2.2.2 CAT活性 由圖2可以看出：在萌蘗前期，杉木幼苗枝葉、基部皮和根尖CAT活性，從高到低排序均為TP3、TP2、TP1，ck1、ck2和ck3。TP3處理杉木枝葉CAT活性相比于TP2、TP1、ck3、ck2和ck1分別高出了459.29%、1 004.03%、366.34%、81.98%和20.30%，基部皮分別高出了419.75%、241.20%、204.15%、86.01%和43.44%；根尖分別高出了1 123.06%、933.10%、125.46%、63.93%和23.83%。在中期和后期，杉木幼苗枝葉、基部皮和根尖CAT活性均迅速下降，在中期，TP3、TP2、TP1、ck3、ck2和ck1的杉木葉片CAT活性相比于前期分別下降了36.35%、41.02%、57.08%、85.01%、89.90%和90.82%，杉木基部皮CAT活性相比于前期分別下降了20.56%、66.32%、84.29%、94.55%、85.56%和95.33%，杉木根尖CAT活性相比于前期分別下降了-47.49%、-18.77%、88.11%、92.36%、87.91%、4.52%。杉木幼苗枝葉CAT活性在中期ck2和ck1較高，在后期TP2、TP1、ck2和ck1較高。在中期和后期，杉木幼苗基部皮和根尖CAT活性規(guī)律較為統(tǒng)一，且總體處于較低水平?；科AT活性在中、后期從高到低排序?yàn)閏k2、TP3、ck3、ck1、TP1、TP2，根尖CAT活性在中、后期從高到低排序?yàn)閏k2、ck3、TP3、TP2、ck1、TP1。

圖2 機(jī)械損傷和不同埋土深度處理下杉木幼苗CAT活性Figure 2 CAT activity of Chinese fir seedlings under mechanical damage and different soil depth treatments

2.2.3 POD活性的影響 由圖3可以看出：在萌蘗前期，未去頂?shù)纳寄局θ~、基部皮和根尖POD活性高于中期和后期。杉木枝葉POD活性前期ck1、ck2和ck3比中期分別提高了109.85%、61.63%和102.35%，比后期分別提高了135.99%、62.85%和115.02%；杉木基部皮POD活性前期ck1、ck2和ck3比中期分別提高了147.98%、141.16%和187.70%，比后期分別提高了59.14%、22.82%和61.56%；杉木根尖POD活性前期ck1、ck2和ck3比中期分別提高了174.74%、107.14%和134.69%，比后期分別提高了143.91%、45.47%和85.89%。在萌蘗前期，未去頂?shù)纳寄久缰θ~、基部皮和根尖POD活性普遍較高，POD活性從高到低依次為ck1、ck3、ck2。在中期，杉木幼苗基部皮和根尖POD活性以TP2、TP3較高。

圖3 機(jī)械損傷和不同埋土深度處理下杉木幼苗POD活性Figure 3 POD activity of young Chinese fir treated with mechanical damage and different soil depth

2.2.4 多因素方差分析 由多因素方差分析(表2)可知：不同時(shí)期、不同機(jī)械損傷和不同部位之間SOD和POD活性具有極顯著差異(P＜0.01)，且3種因素之間具有極顯著的交互作用(P＜0.01)。不同時(shí)間、不同機(jī)械損傷、不同埋土深度和不同部位之間CAT活性具有極顯著差異(P＜0.01)，4種因素之間具有極顯著的交互作用(P＜0.01)。

表2 杉木幼苗 SOD、CAT 和 POD 活性方差分析Table 2 Variance analysis of SOD, CAT and POD enzyme activities in Chinese fir seedlings

2.3 機(jī)械損傷和不同埋土深度處理杉木無性系不同器官抗氧化酶活性相關(guān)性

由表3可見：萌蘗數(shù)與機(jī)械損傷呈極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)；萌蘗數(shù)與萌蘗時(shí)期呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，SOD活性與萌蘗時(shí)期呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)；SOD活性與萌蘗數(shù)呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，CAT活性與機(jī)械損傷呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)；CAT活性與萌蘗時(shí)期、萌蘗數(shù)和SOD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)，POD活性與萌蘗時(shí)期、萌蘗數(shù)呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)；POD活性與SOD活性呈極顯著正相關(guān)(P＜0.01)，POD與CAT活性呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。

表3 機(jī)械損傷和不同埋土深度處理杉木無性系萌蘗酶活性相關(guān)性Table 3 Correlation between mechanical damage and tillering enzyme activity of Chinese fir clones under different soil depth treatments

3 討論

本研究表明：隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，杉木萌蘗均呈上升趨勢(shì)；隨著埋土深度的增加，杉木萌蘗能力逐漸呈下降的趨勢(shì)。在萌蘗后期，TP1、TP2和TP3的萌蘗數(shù)與同一埋土深度ck1、ck2和ck3相比分別提高15.11%、6.73%及3.49%。說明適度的機(jī)械損傷對(duì)杉木萌蘗影響較大，利于無性系的繁殖。植物通過自然選擇和人工選擇，逐漸形成相應(yīng)的防御機(jī)制，有助于損傷部位的愈合，并誘發(fā)全株反應(yīng)，防止進(jìn)一步損傷的發(fā)生?？梢愿鶕?jù)植物對(duì)機(jī)械損傷的特殊反應(yīng)強(qiáng)化植物的抗蟲抗病能力，減少施藥對(duì)人類健康以及生態(tài)環(huán)境的損害，也可以探索防御反應(yīng)的發(fā)生機(jī)制，以期遏制植株的“過度反應(yīng)”，減少生產(chǎn)上的經(jīng)濟(jì)損失[11-12]。

生物轉(zhuǎn)化是利用細(xì)胞、器官或酶等生物體系進(jìn)行催化的反應(yīng)。由于生物轉(zhuǎn)化的多樣性涉及到許多酶，SOD活性過高，會(huì)影響某些正常的氧化代謝過程[13]。由于SOD具有親核性和還原性，一定微環(huán)境下，具有很強(qiáng)的氧化損傷作用[14]。低CAT活性的植株對(duì)過氧化氫(H2O2)脅迫更加敏感，CAT作為植物體內(nèi)重要活性氧清除酶，可與質(zhì)膜透性一起表征植物受逆境傷害的程度，兩者在脅迫發(fā)生后一段時(shí)間內(nèi)的變化態(tài)勢(shì)，可反映植物自身修復(fù)過程中的一些信息[15-16]。POD在回收過程中具有雙重功能。一方面，POD可以在逆境或衰老的早期表達(dá)以去除H2O2，是活性氧保護(hù)酶系統(tǒng)的成員之一；另一方面，POD也可以在逆境或衰老的后期表達(dá)以參與活性氧的產(chǎn)生和葉綠素的降解，引起膜脂過氧化，這是植物衰老的產(chǎn)物，可以作為衰老的指標(biāo)。本研究表明：去頂后埋土3 cm和去頂后埋土6 cm處理下的杉木幼苗葉片SOD活性相比于萌蘗前期和后期明顯上升，不同部位中CAT活性總體呈下降趨勢(shì)，葉、基部皮和根尖中POD活性呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。李惠梅等[17]研究了增強(qiáng)UV-B輻射對(duì)麻花龍膽Gentiana straminea抗氧化酶系統(tǒng)的影響。結(jié)果表明：UV-B處理后，麻花龍膽葉片中SOD和POD活性在處理初期升高，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，SOD和POD活性降低，CAT活性顯著降低。這與本研究結(jié)果有一致和不同之處。生物代謝中酶活性的變化反映了環(huán)境物理化學(xué)變化，可以為環(huán)境變化提供早期預(yù)測(cè)。因此，越來越多的學(xué)者關(guān)注逆境下植物體內(nèi)酶的變化，試圖利用酶的變化來判斷植物對(duì)環(huán)境的響應(yīng)[18]。不同植物對(duì)逆境的應(yīng)激方式不盡相同，適應(yīng)逆境的機(jī)制十分復(fù)雜。

4 結(jié)論

隨著埋土深度的增加，不同埋土深度杉木無性系苗萌蘗能力均呈降低的趨勢(shì)，同一埋土深度下機(jī)械損傷處理無性系苗萌蘗力高于未機(jī)械損傷。隨著埋土深度的增加，杉木幼苗枝葉SOD活性呈上升趨勢(shì)，CAT活性呈下降趨勢(shì)；埋土6 cm處理有利于枝葉及根尖POD的積累；杉木幼苗不同器官植物抗氧化酶活性的差異應(yīng)與杉木對(duì)機(jī)械損傷和埋土深度處理的生理應(yīng)答機(jī)制有關(guān)。本研究結(jié)果在一定程度上反映機(jī)械損傷和不同埋土深度處理后杉木無性系萌蘗SOD、CAT和POD活性的變化規(guī)律，但在杉木萌蘗過程中抗氧化酶活性之間如何維持平衡，以及如何協(xié)同作用調(diào)控杉木萌蘗等的機(jī)制尚不清楚，這有待于今后進(jìn)一步深入研究。