龐天虹，錢婕妤，付建新，顧翠花，張 超

（1. 浙江農(nóng)林大學(xué) 風(fēng)景園林與建筑學(xué)院，浙江 杭州 311300；2. 浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省園林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實驗室，浙江 杭州 311300；3. 浙江農(nóng)林大學(xué) 南方園林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實驗室，浙江 杭州 311300）

桂花Osmanthus fragrans是中國十大名花之一，深受人們喜愛。前人研究報道桂花花香主要成分為α-紫羅蘭酮、β-紫羅蘭酮、芳樟醇及其氧化物、羅勒烯等揮發(fā)性物質(zhì)[1]，而桂花花色主要成分是類胡蘿卜素化合物[2]。桂花的花香和花色是其最主要的觀賞性狀，與花香和花色相關(guān)次生代謝物質(zhì)的合成與積累直接影響到桂花的觀賞品質(zhì)。植物呼吸作用不僅提供植物所需的能量，一系列的中間產(chǎn)物還為多種次生代謝化合物合成提供原料，在植物體內(nèi)有機(jī)物轉(zhuǎn)變方面起到樞紐作用。已糖激酶(hexokinase，HXK)具有己糖磷酸化功能，經(jīng)HXK磷酸化的己糖才能進(jìn)行植物呼吸代謝的糖酵解途徑，為植物生長和發(fā)育提供能量和中間代謝產(chǎn)物[3-6]。高等植物HXK基因以多基因家族形式存在[7-11]。擬南芥Arabidopsis thaliana的6個HXK家族成員中，AtHXK1～3能磷酸化葡萄糖[10]，其中AtHXK1還具有感知和傳遞己糖信號的功能[12-13]。AtHXK1在強(qiáng)光條件下對植物根、葉和花序的生長和發(fā)育有促進(jìn)作用[13]。此外，擬南芥成花轉(zhuǎn)變[14]和種子萌發(fā)[15]、植物花青素積累[16]和脂肪族硫甙生物合成[17]等植物生命活動都與HXK介導(dǎo)的己糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)息息相關(guān)。目前，未見桂花HXK基因功能有關(guān)的研究報道。本研究基于桂花不同花色品種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選OfHXKs相關(guān)Unigene序列，分析不同OfHXKs基因家族成員核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列，并與其他物種HXK蛋白進(jìn)行多重比對和進(jìn)化樹分析，同時分析不同桂花品種不同發(fā)育階段花瓣以及不同組織中OfHXKs基因表達(dá)特征，為進(jìn)一步揭示桂花不同OfHXKs基因成員功能奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選擇浙江農(nóng)林大學(xué)桂花資源圃生長狀況良好的地栽桂花‘堰虹桂’Osmanthus fragrans‘Yanhong Gui’(YHG)、‘玉玲瓏’O. fragrans‘Yulinglong’(YLL)、‘金球桂’O. fragrans‘Jinqiu Gui’(JQG)為材料，依據(jù)桂花花序不同發(fā)育階段[18]，對這3個桂花品種頂殼期(S1)、鈴梗期(S2)、初開期(S3)、盛開期(S4)花瓣分別進(jìn)行取樣，取樣時間均為10:00。同時還對‘堰虹桂’1年生莖、2年生莖、嫩葉、成熟葉和盛開時花序進(jìn)行取樣，用于不同組織中OfHXKs基因表達(dá)分析。用液氮速凍暫存樣品，后存于-80 ℃冰箱。

1.2 主要試劑和儀器

RNA提取試劑盒采用RNAprep Pure Plant Kit(天根，北京)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用PrimeScript? RT Master Mix(Perfect Real Time)(Takara，大連)；熒光定量試劑盒使用TB Green?Premix Ex Taq? Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(Takara，大連)。實時熒光定量PCR儀為 LightCycler?480 Ⅱ(Roche，德國)。

1.3 方法

1.3.1OfHXKs序列分析 從轉(zhuǎn)錄組中篩選得到HXK相關(guān)的Unigene序列，首先使用美國國家生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫中的BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對得到的基因序列進(jìn)行對比；利用ORF FINDER (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)尋找開放閱讀框；用DNAMAN 6.0軟件對不同品種相同HXK基因成員進(jìn)行核苷酸相似性比較，使用‘堰虹桂’的4個HXK基因成員序列開展后續(xù)序列分析，包括應(yīng)用Prot-Param在線軟件(http://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測所編碼蛋白的分子量、理論等電點(diǎn)(PI)、不穩(wěn)定系數(shù)、總平均親水性等；使用YLoc (https://abi-services.informatik.uni-tuebingen.de/yloc/webloc.cgi)進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；使用SOPMA分析軟件(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl)對OfHXKs家族的蛋白序列進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，判斷目的基因的氨基酸殘基是否處于于α-螺旋、β折疊(或其他狀態(tài))的二級結(jié)構(gòu)；用SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測OfHXKs的三級結(jié)構(gòu)；應(yīng)用SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對信號肽進(jìn)行預(yù)測；利用TMHMM在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測分析桂花蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；使用NetPhos 3.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對桂花花瓣OfHXKs蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測；采用MEGAX軟件中的鄰位相鄰法(neighbor-joining，NJ)進(jìn)行同源聚類，建立系統(tǒng)發(fā)育樹，并采用Bootstrap法(重復(fù)1 000次)評估檢測系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3.2 總RNA提取與cDNA的合成 采用RNAprep pure Plant Kit(天根，北京)多糖多酚植物總RNA提取試劑盒按照說明書步驟提取各樣品的總RNA。使用紫外分光光度計和質(zhì)量濃度為1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度和質(zhì)量。反轉(zhuǎn)錄體系為總RNA 1.0 μL，5×PrimeScript RT Master Mix(TaKara，大連)2.0 μL，無RNA酶雙蒸水7.0 μL，PCR反應(yīng)的程序設(shè)定為：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃ 1 min。反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA儲存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 熒光定量PCR 根據(jù)熒光定量PCR引物設(shè)計原則利用Primer Premier 5進(jìn)行引物設(shè)計，以桂花OfACT為內(nèi)參基因[19]，引物序列見表1。熒光定量PCR反應(yīng)體系為：TB Green Premix Ex TaqⅡ(TaKaRa，大連) 5.0 μL，上下游引物 (10 μmol·L-1)各 0.4 μL，cDNA 模板(反轉(zhuǎn)錄 cDNA 稀釋20 倍)2.0 μL，雙蒸水2.2 μL，每個樣品設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。反應(yīng)程序為兩步法：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性30 s，重復(fù)40個循環(huán)；然后以95 ℃持續(xù)5 s，60 ℃持續(xù)1 min，95 ℃持續(xù)15 s作為溶解曲線程序。

表1 OfHXKs基因表達(dá)分析所用引物序列Table 1 Primer sequences of OfHXK genes of O. fragrans

2 結(jié)果與分析

2.1 桂花花瓣 OfHXKs基因序列分析

根據(jù)桂花不同花色品種轉(zhuǎn)錄組Unigene序列分析，篩選得到4個HXK基因的同源基因(OfHXK1～OfHXK4)，3個品種中均含有這4個HXK基因的同源基因。利用DNAMAN對不同品種OfHXK1～OfHXK4核苷酸序列進(jìn)行多序列比對，核苷酸序列相似性比較結(jié)果見表2。不同品種桂花OfHXK1、OfHXK3和OfHXK4基因核苷酸序列相似性均高于99%，而不同品種桂花OfHXK2基因核苷酸序列相似性為94.42%～98.26%。選擇‘堰虹桂’的OfHXK1～OfHXK4基因推測的氨基酸序列進(jìn)行后續(xù)分析。

表2 桂花 OfHXKs核苷酸相似性比較表Table 2 Comparison of nucleotide sequences of OfHXKs in O. fragrans

利用DNAMAN對‘堰虹桂’OfHXK1～OfHXK4氨基酸序列比對。由圖1可知：不同OfHXKs間具有高度保守的結(jié)構(gòu)域，均包含2個保守的磷酸化作用位點(diǎn)phosphate 1和phosphate 2以及1個底物結(jié)合位點(diǎn)sugar binding。預(yù)測OfHXK1與OfHXK2序列中均包含12個疏水通道和11個甘氨酸殘基，而OfHXK3包含11個疏水通道和10個甘氨酸殘基，OfHXK4則包含12個疏水通道和10個甘氨酸殘基。與其他序列相比，OfHXK4氨基酸序列在其C端的腺苷結(jié)合位點(diǎn)處多出11個氨基酸殘基(KNEGAS RSKMR)。

圖1 桂花OfHXKs氨基酸多序列比對圖Figure 1 Multiple sequence alignment of OfHXKs amino acid sequences

2.2 桂花花瓣OfHXKs蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)分析及其跨膜區(qū)域和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用ExPASy protparam預(yù)測分析OfHXKs家族蛋白質(zhì)序列的基本理化性質(zhì)，了解相對分子質(zhì)量、氨基酸組成、等電點(diǎn)(PI)、不穩(wěn)定系數(shù)、總平均親水性等，結(jié)果見表3。以O(shè)fHXK1為例，該基因編碼的氨基酸數(shù)目為498個，蛋白質(zhì)相對分子量為53 881.09 Da，理論等電點(diǎn)為5.41，分子式為C2387H3857N653O719S21，氨基酸組成有20種，含有負(fù)電荷殘基(Asp+Glu)66個，正電荷殘基數(shù)(Arg+Lys)53個，總平均疏水性為0.055，不穩(wěn)定系數(shù)為47.03，故推測OfHXK1為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。結(jié)果顯示：除OfHXK4為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)外，其余均為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測使用SignalP在線軟件默認(rèn)條件下對OfHXKs氨基酸序列N-端開始前70位氨基酸進(jìn)行信號肽預(yù)測分析，結(jié)果顯示OfHXKs氨基酸序列均無信號肽存在。應(yīng)用YLoc在線軟件進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示OfHXK1與OfHXK2均定位于細(xì)胞質(zhì)中，而OfHXK3則定位于葉綠體，OfHXK4位于線粒體。

表3 桂花 OfHXKs 蛋白質(zhì)基本理化信息Table 3 Information of OfHXK proteins in O. fragrans

使用TMHMM在線軟件分析桂花OfHXKs蛋白質(zhì)可能的跨膜區(qū)域，結(jié)果顯示除OfHXK3外均具有跨膜區(qū)域(圖2)，OfHXK1、OfHXK2與OfHXK4分別在第7～24位氨基酸殘基、第9～28位氨基酸殘基和第5～24位氨基酸殘基處具有跨膜區(qū)域，因此判斷OfHXK1、OfHXK2與OfHXK4為跨膜蛋白質(zhì)，而OfHXK3則不屬于跨膜蛋白質(zhì)。

圖2 桂花OfHXKs蛋白質(zhì)跨膜區(qū)段預(yù)測Figure 2 Prediction of transmembrane protein segment of OfHXKs

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測是為了判斷目的基因所編碼的氨基酸序列殘基是處于α-螺旋、β折疊還是其他狀態(tài)的二級結(jié)構(gòu)。通過SOPMA在線預(yù)測分析，結(jié)果顯示桂花OfHXKs蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主(表4)。使用SWISS-MODEL進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測，結(jié)果顯示為圖3。

表4 桂花花瓣 OfHXKs 蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Table 4 Secondary structures of OfHXK proteins in O. fragrans

圖3 桂花OfHXKs蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Figure 3 Prediction of tertiary structures of OfHXK proteins in O. fragrans

2.3 OfHXKs氨基酸序列同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過NCBI在線數(shù)據(jù)庫比對，將4個桂花花瓣OfHXKs蛋白質(zhì)序列分別進(jìn)行同源性比對。Blastp比對結(jié)果顯示：OfHXK1與油橄欖Olea europaeaXP_022882495.1同源性為96.39%，與芝麻Sesamum indicumXP_022882495.1同源性為88.15%；OfHXK2與油橄欖XP_022843013.1同源性高達(dá)97.80%；OfHXK3與油橄欖XP_022884724.1同源性高達(dá)96.16%，而與阿月渾子Pistacia veraXP_031283181.1以及粉紅鐘花Handroanthus impetiginosusPIM98716.1同源性分別為82.70%與85.45%；OfHXK4與油橄欖XP_022873061.1同源性達(dá)到95%以上，說明OfHXKs具有高度保守性。

利用MEGAX軟件對4個桂花花瓣OfHXKs蛋白質(zhì)和從NCBI在線數(shù)據(jù)庫中找到的擬南芥HXKs蛋白質(zhì)序列進(jìn)行多序列比對，以100% bootstrap支持度構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行分析，預(yù)測桂花OfHXKs的功能。由圖4所示：所選擇蛋白質(zhì)序列分別為擬南芥AtHXK1(U28214)、AtHXK2(U28215)、AtHXK3(BT030472)、AtHKL1(NM_103929)、AtHKL2(NM_112895)和AtHKL3(NM_119945)。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明桂花花瓣OfHXK1與OfHXK2關(guān)系較近，而OfHXK3和OfHXK4分別聚集在不同小支，由此推斷OfHXKs蛋白質(zhì)之間的功能可能具有一定區(qū)別。其中OfHXK1、OfHXK2與擬南芥AtHXK1、AtHXK2聚集在一支，而OfHXK3則與擬南芥AtHXK3關(guān)系較近，OfHXK4則與擬南芥AtHKL1、AtHKL2關(guān)系較近。

圖4 桂花花瓣OfHXKs和擬南芥AtHXKs蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹分析圖Figure 4 Phylogenetic tree of HXK proteins in O. fragrance and A. thaliana

2.4 桂花 OfHXKs基因表達(dá)分析

以桂花的頂殼期(S1)、鈴梗期(S2)、初花期(S3)和盛花期(S4)花序以及1年生莖、2年生莖、嫩葉、成熟葉的cDNA為模板，以桂花ACT基因為內(nèi)參，進(jìn)行實時熒光定量PCR，檢測不同品種桂花不同組織及不同發(fā)育階段的OfHXKs基因表達(dá)情況。由圖5可見：OfHXK1在‘堰虹桂’中的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢；在‘金球桂’中同樣也在S3時期表達(dá)量最高，且顯著高于‘堰虹桂’與‘玉玲瓏’中相同時期的表達(dá)量(P＜0.05)；而OfHXK1基因在‘玉玲瓏’中的表達(dá)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，于S2時期的表達(dá)量達(dá)到最高。OfHXK2基因在‘堰虹桂’中的表達(dá)量呈現(xiàn)逐步上升的趨勢，于盛花期的表達(dá)量最高；在‘金球桂’中，OfHXK2的表達(dá)量隨著開放過程未發(fā)生變化；OfHXK2的表達(dá)量在‘玉玲瓏’中呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。OfHXK3基因在3個品種的表達(dá)量隨著花開放呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，均在S2時期達(dá)到最高；S2時期‘金球桂’OfHXK3基因的表達(dá)量最高，‘玉玲瓏’次之。OfHXK4基因在‘堰虹桂’和‘金球桂’中的表達(dá)量也是先上升后下降的趨勢，在S2時期達(dá)到最高，而該基因在‘玉玲瓏’中表達(dá)量逐漸下降。S2時期‘金球桂’OfHXK4基因的表達(dá)量最高，‘堰虹桂’次之。

圖5 各品種桂花不同發(fā)育時期花序OfHXKs基因相對表達(dá)量變化Figure 5 Expression changes of OfHXK genes during different inflorescence of different O. fragrans cultivars

如圖6所示：在不同組織中，OfHXK1在嫩葉中的表達(dá)量最高，在成熟葉和盛花期花序中表達(dá)量次之，在1年生莖中的表達(dá)量最低；OfHXK2在盛花期花序中的表達(dá)量最高，在2年生莖中的表達(dá)量最低；OfHXK3則在莖中表達(dá)量最高，在成熟葉中的表達(dá)量極低；OfHXK4在成熟葉中的表達(dá)量最高，嫩葉中表達(dá)量次之，顯著高于1、2年生莖和盛開期花序中的表達(dá)量。

圖6 ‘堰虹桂’不同組織中OfHXKs基因表達(dá)量變化Figure 6 Expression changes of OfHXK genes during different tissues of O. fragrans ‘Yanhong Gui’

3 討論

HXK參與糖代謝的同時也參與己糖信號的感受和傳導(dǎo)[20-22]，由于其重要的生物學(xué)功能，關(guān)于HXK蛋白的研究也逐漸成為熱點(diǎn)[9,14,23-25]。本研究在桂花中發(fā)現(xiàn)HXK基因的4個同源基因，表明與其他植物一樣[6]，HXK基因也是以多基因家族形式存在桂花中，同一HXK基因家族成員序列在不同桂花品種中保守。桂花OfHXK1～OfHXK4基因推導(dǎo)的氨基酸序列均包含葡萄糖和ATP的結(jié)合位點(diǎn)，推測OfHXK1～OfHXK4均具有催化己糖磷酸化的功能。其中，OfHXK4氨基酸序列在其N端的腺苷結(jié)合位點(diǎn)處多出11個氨基酸殘基，這與擬南芥中HKL1和HKL2腺苷結(jié)合位點(diǎn)處多10個和6個氨基酸殘基的情況[10]類似。

進(jìn)化樹表明OfHXK1、OfHXK2與擬南芥AtHXK1、AtHXK2聚集在一支，已知AtHXK1和AtHXK2具有催化己糖磷酸化的作用[10]，且具有糖感知和傳導(dǎo)的功能[26]，推測OfHXK1與OfHXK2同樣具有催化己糖磷酸化和感知并轉(zhuǎn)導(dǎo)糖信號的功能。OLSSON等[27]將植物HXK分為A類和B類，A類HXK具有質(zhì)體信號肽，如AtHXK3；B類HXK具有N端膜錨定結(jié)構(gòu)，如AtHXK1與AtHXK2。根據(jù)進(jìn)化樹推測OfHXK1和OfHXK2可能屬于B類HXK，此外，核心的糖結(jié)合區(qū)域(LGFTFSFP-Q-L/I)在OfHXK1和OfHXK2序列中極其保守。OfHXK3與AtHXK3聚集于同一小支，擬南芥AtHXK3具有催化作用但無糖信號傳導(dǎo)功能[28]，推測無跨膜區(qū)域的OfHXK3屬于A類HXK，具有催化作用但無糖信號傳導(dǎo)功能。定位于線粒體中的擬南芥AtHKL1和AtHKL2屬于酶催化活性不高的HXK亞型，其氨基酸序列C端的腺苷結(jié)合位點(diǎn)處多出若干個氨基酸殘基[10]，而推測聚在一支的OfHXK4有相同特點(diǎn)。

桂花OfHXK1～OfHXK4基因在1年生莖、2年生莖、嫩葉、成熟葉和盛開時花序中均有表達(dá)。其他物種的大部分HXK基因，如擬南芥AtHXK1～AtHXK3、AtHKL1和AtHKL2[10]，番茄Lycopersicon esculentum LeHXK1～LeHXK4[11]， 水 稻Oryza sativa OsHXK2～OsHXK9[8]， 枸 杞Lycium barbarum LbHXK[29]和 蘋果Malus×domestica MdHXK1[30]，在被檢測的組織器官中均有表達(dá)。但是OfHXKs不同成員在不同組織中的表達(dá)水平呈現(xiàn)一定差異。OfHXK1和OfHXK2基因在葉和花中的表達(dá)量高于莖中，而OfHXK3基因在莖中的表達(dá)量最高，表明HXKs基因不同成員雖然磷酸己糖的功能存在冗余[10]，但是不同成員在桂花不同組織中發(fā)揮的主導(dǎo)作用存在差異。依據(jù)進(jìn)化樹分析，OfHXK1與OfHXK2基因被推測具有糖信號感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，可能參與調(diào)控桂花花色和花香相關(guān)次生代謝物質(zhì)的生物合成，這可能是OfHXK1與OfHXK2基因在花中的表達(dá)量較高的原因之一。

本研究分析了3個桂花品種不同發(fā)育階段花瓣中OfHXKs基因的表達(dá)情況，整體上‘金球桂’中OfHXKs基因表達(dá)量最高；隨著花開放的進(jìn)程，OfHXK1、OfHXK3和OfHXK4基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。枸杞中研究發(fā)現(xiàn)，隨著枸杞果實的發(fā)育，HXK基因表達(dá)量在色變期達(dá)到峰值，成熟期表達(dá)量又下降[29]。牡丹Paeonia suffruticosa花瓣中的研究發(fā)現(xiàn)：隨著發(fā)育過程PsHXK1和PsHXK2基因在花瓣中的表達(dá)量呈現(xiàn)先增加后下降的規(guī)律，該變化規(guī)律與己糖含量有密切的關(guān)聯(lián)[24]。植物組織器官中的糖含量在一定范圍內(nèi)增加可以促進(jìn)HXK基因轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)的積累，植物體內(nèi)己糖的磷酸化水平隨之增加；超過一定閾值后，植物體內(nèi)糖含量增加則會抑制HXK基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的積累[5]。這也就解釋了大部分OfHXKs基因表達(dá)量先上升后下降的原因。桂花不同品種色素物質(zhì)和香氣揮發(fā)物含量不同[1-2]，推測不同桂花品種對HXK己糖磷酸化和糖信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的需求不同，此外HXK不同成員還有功能冗余的特點(diǎn)，因此OfHXK2基因在3個桂花品種花瓣中的表達(dá)模式不同。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)桂花轉(zhuǎn)錄組Unigene序列分析，篩選得到4個HXK基因的同源基因。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明4個基因分別編碼461～510個氨基酸殘基，同時推測OfHXK1～OfHXK4均具有催化己糖磷酸化的功能。進(jìn)化樹分析表明OfHXK1和OfHXK2與擬南芥AtHXK1與AtHXK2親緣關(guān)系較近；OfHXK3與AtHXK3親緣關(guān)系較近；OfHXK4與AtHKL1和AtHKL2親緣關(guān)系較近。實時熒光定量PCR分析表明桂花OfHXK1～OfHXK4基因在1年生莖、2年生莖、嫩葉、成熟葉和花序中均有表達(dá)；OfHXK1、OfHXK3和OfHXK4基因隨著花開放的進(jìn)程，整體上表達(dá)量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而OfHXK2基因在3個品種花序發(fā)育過程中表達(dá)模式不同。