韓展譽，吳春艷，許艷秋，黃福燈，熊義勤，管弦悅，周廬建，潘剛，程方民?

1浙江大學農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學院，杭州 310058；2浙江省農(nóng)業(yè)科學院，杭州 310021

0 引言

【研究意義】氮素營養(yǎng)是影響水稻籽粒產(chǎn)量與稻米品質(zhì)的重要生態(tài)因子之一[1-2]。合理施用氮肥不僅是實現(xiàn)水稻高產(chǎn)的有效措施，而且有利于稻米品質(zhì)改良和提高稻田氮肥利用率[3-4]。在優(yōu)質(zhì)米生產(chǎn)上，氮素穗（粒）肥施用量偏多通常引起稻米蛋白質(zhì)含量過高、米飯色澤和口感變差、貯藏品質(zhì)降低，但氮素穗（粒）肥不足，往往又引起水稻生育后期功能葉片的提早衰老和光合同化物生產(chǎn)能力迅速下降，導致堊白米率增加、整精米率降低，同樣不利于稻米優(yōu)質(zhì)[1,3-4]。此外，氮素穗（粒）肥對水稻產(chǎn)量及稻米品質(zhì)的影響及其程度還與水稻生育后期的氣候條件有關(guān)[5-10]。已有研究表明，灌漿結(jié)實期高溫脅迫可引起水稻、小麥等作物籽粒中的淀粉合成受阻，適度施氮能部分恢復高溫脅迫對碳代謝相關(guān)酶的損傷，從而減輕高溫對作物籽粒灌漿和產(chǎn)量形成的危害[11-13]。鑒于灌漿結(jié)實期溫度和氮肥施用均與稻米品質(zhì)存在密切聯(lián)系，探明灌漿結(jié)實期溫度與氮肥兩個因素耦合對稻米品質(zhì)的影響效應(yīng)及其生理機制，對于現(xiàn)階段我國稻米品質(zhì)改良工作具有重要理論意義?！厩叭搜芯窟M展】稻米的化學組分是淀粉和蛋白質(zhì)[14]。在水稻籽粒灌漿過程中，淀粉合成代謝主要發(fā)生水稻胚乳的淀粉體，而貯藏蛋白主要積累于蛋白體Ⅱ（PB-Ⅱ）和蛋白體I（PB-I）[15]。稻米蛋白質(zhì)主要是由谷蛋白和醇溶蛋白組成，兩者分別占稻米貯藏蛋白總量的75%—80%和8%—10%[14,16]。近年來，國內(nèi)外對水稻籽粒淀粉合成與貯藏蛋白積累的代謝途徑及其關(guān)鍵調(diào)控基因（關(guān)鍵酶）已取得一定深度認識。現(xiàn)已基本明確，谷蛋白是由37—39 kD 的酸性亞基和 20—22 kD 的堿性亞基構(gòu)成并通過二硫鍵結(jié)合在一起貯藏于PB-Ⅱ，而醇溶蛋白是由13 kD等亞基組成，其多肽被合成后直接在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)組裝成PB-Ⅰ[17-18]。水稻不存在直接編碼22 kD 和37 kD 多肽的基因[14,18]，谷蛋白57 kD前體和13 kD醇溶蛋白均是由多基因編碼并受其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控[16,19]。在灌漿溫度與氮素穗肥對稻米品質(zhì)影響的生理機制研究方面，目前國內(nèi)外主要側(cè)重于對不同溫度處理下，水稻胚乳淀粉合成代謝途徑的幾個關(guān)鍵酶及有關(guān)功能基因與稻米淀粉組分及其鏈長分布結(jié)構(gòu)等特征之間的關(guān)系分析[5,19-20]，而對于灌漿溫度與氮素穗肥對稻米貯藏蛋白含量組分影響的耦合效應(yīng)，以及不同氮素水平下灌漿溫度對水稻籽粒貯藏蛋白合成積累過程影響的調(diào)控機制，已有文獻報道卻缺乏較深入探討?！颈狙芯壳腥朦c】前人對作物籽粒灌漿過程的淀粉合成與貯藏蛋白積累及其環(huán)境調(diào)控機理問題研究，主要局限于灌漿溫度或氮肥對稻米品質(zhì)影響的單因素影響效應(yīng)與籽粒淀粉合成及貯藏蛋白積累間的關(guān)系分析[1,5-6]，而對于不同施氮水平下，灌漿期高溫對水稻貯藏蛋白合成積累代謝過程的影響及其與稻米蛋白質(zhì)含量及亞基組分間的相互聯(lián)系[10]，迄今尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文以生育期相近的2個主栽常規(guī)晚粳品種（秀水134和秀水09）為材料，采用盆栽土培試驗和人工氣候箱控溫處理相結(jié)合的方法，并通過籽粒灌漿過程中的動態(tài)取樣，探析了不同氮肥水平下，灌漿期高溫對稻米蛋白含量及組分的影響效應(yīng)及其與籽粒貯藏蛋白合成代謝間的關(guān)系，旨在揭示氮素穗肥對水稻高溫灌漿過程貯藏蛋白積累過程影響及其生理代謝機制，為水稻優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)的氮肥合理施用與相關(guān)栽培管理技術(shù)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試品種與試驗處理

試驗于2019年在浙江大學農(nóng)業(yè)試驗站（紫金港西區(qū)）進行。供試水稻材料為秀水134和秀水09（常規(guī)晚粳稻品種）。氮肥處理在水稻穗分化期開始實施，設(shè)低氮（LN）和高氮（HN）2個水平；溫度處理在水稻灌漿結(jié)實期進行，設(shè)常溫（日均溫度23℃）和高溫（日均溫度30℃）2個溫度水平。5月20日播種，大田濕潤育秧，6月20日移栽至盆缽，盆缽為正方形白色桶，直徑25 cm、高30 cm，內(nèi)裝過篩土約15 kg。盆缽土壤于 2018年取自浙江農(nóng)業(yè)科學院海寧試驗基地氮肥長期定位試驗田的不施氮區(qū)和施氮區(qū)。其中，不施氮區(qū)土壤含有機質(zhì) 2.34 g·kg-1、全氮 0.13 g·kg-1、速效氮 96.35 mg·kg-1、全磷 0.17 g·kg-1、速效磷 120.41 mg·kg-1、全鉀 1.45 g·kg-1、速效鉀 110.26 mg·kg-1；施氮區(qū)土壤含有機質(zhì) 2.55 g·kg-1、全氮 0.19 g·kg-1、速效氮149.16 mg·kg-1、全磷 0.15 g·kg-1、速效磷 115.37 mg·kg-1、全鉀 1.53 g·kg-1、速效鉀 131.06 mg·kg-1。土壤經(jīng)自然風干、充分浸泡和充分混勻后，分別裝入不同盆缽（不施氮與施氮區(qū)的土壤各裝32盆，共64盆）。移栽前每盆施2 g尿素和0.5 g KH2PO4做基肥，秧苗移栽前預先淹水2周，每桶栽插4穴，每穴單苗插秧。在水稻生長至穗分化期（葉齡余數(shù)為 1.5左右時）施氮肥處理。其中，低氮處理水平（LN）是在裝有不施氮區(qū)稻田土壤的各盆缽之中，每盆施0.5 g尿素，約合尿素20 kg·hm-2，高氮處理水平（HN）是在裝有施氮區(qū)稻田土壤的各盆缽之中，每盆施2.0 g尿素,約合尿素80 kg·hm-2。每個品種、每氮處理水平各16盆，盆缽水稻放置于大型智能溫室（28℃白天/22℃夜間）生長，溫室內(nèi)自然光照，每3 d左右澆一次水，及時防控病蟲。待盆缽水稻在大型智能溫室生長發(fā)育至齊穗期，選同日開花且發(fā)育良好的單穗掛牌，并將同一品種每個氮肥處理的盆缽進一步分成2組（每組8盆），在掛牌標記稻穗開花后的第4天，分別將其盆缽移入2臺步入式CONVIRON人工氣候箱實施不同溫度處理，之后按一定的時間間隔（抽穗開花后的第7天、第14天、第21天、第28天和第35天）進行動態(tài)取樣，每次4—5個標記稻穗，直至成熟。

2臺CONVIRON人工氣候箱的溫度處理設(shè)計分別為常溫（NT，日平均溫度 23℃，日最高溫度和最低溫度分別為26℃和20℃）和高溫（HT，日平均溫度30℃，日最高溫度和最低溫度分別為34℃和26℃）。溫度日變化模擬自然氣候特征，每日14：00為最高溫、5：00為最低溫，其間溫度以 1℃為間隔呈線性增加[10]。2臺氣候箱中的其他氣候因子均保持完全一致。其中，光照時間為 6：00—19：00，光照強度為 120—150 J·m-2·s-1，相對濕度為75%—80%，風速0.5 m·s-1[10]。

1.2 籽粒粗蛋白含量測定

用凱氏定氮法測定籽粒總蛋白含量，參照LUTHE[21]方法進行。分別取14、21、28、35 d部分樣品于60℃烘干至恒重，去殼、磨粉和過篩（0.25 mm）后，稱取糙米粉200 mg，倒入硝煮管后加入3 g硫酸鉀∶硫酸銅粉末（10∶1，w/w），再加入8 mL濃硫酸，在硝煮儀（Tecator Digestor Auto，F(xiàn)oss）上360℃硝煮150 min，樣品冷卻后注入凱氏定氮儀，運行蒸餾以及滴定過程，計算總氮含量，總蛋白含量等于總氮含量×5.95。以上指標每樣品重復 3 次。

1.3 4種蛋白組分的提取與測定

參照LIU等[22]方法對0.5 g糙米米粉中的4種蛋白組分進行分步提取。提取順序如下：（1）清蛋白：去離子水；（2）球蛋白：2%氯化鈉；（3）醇溶蛋白：55%（v/v）正丙醇；（4）谷蛋白：0.24% 五水合硫酸銅，1.68% KOH，0.5%酒石酸鉀鈉和 50%（v/v）異丙醇。每次提取液用量為25 mL，室溫下持續(xù)振蕩2 h，其后4 000×g離心10 min，重復提取3次。之后，采用Bradford法測定醇溶蛋白含量，以牛血清蛋白為對照[10]；采用雙縮脲法測定谷蛋白含量，仍以牛血清蛋白為對照，用凱式法加以標定[10]。

1.4 谷蛋白和醇溶蛋白亞基組成的SDS-PAGE分析

參照YAMAGATA等[23]方法，對稻米貯藏蛋白的亞基組成進行SDS-PAGE分析。準確稱取30 mg糙米粉于2 mL離心管中，加入1 mL的SDS-urea提取液（4%SDS、5%硫基乙醇、20%甘油和8 mol·L-1尿素，pH 6.8），室溫下過夜，混合液在20℃ 15 000×g離心20 min，上清液用于點樣。采用分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度均為5%。電極緩沖液為Tris-HCl體系，含0.1% SDS。室溫下恒流30—40 mA（起始15—20 mA）電泳2—3 h至溴酚藍泳動到膠板下緣停止，取出凝膠板進行沖洗、固定、染色、脫色，最后將凝膠在Bio-Rad GS-800掃描儀掃描，并用ImageJ對染色凝膠中各蛋白亞基條帶的相對光密度進行估算。

1.5 粗酶液的提取和酶生理活性測定

以-80℃冰箱保存的不同灌漿時期的籽粒樣品為材料，選取稻穗中上部籽粒25粒，去殼稱重后，加 5 mL 100 mmol·L-1的Tricine-NaOH 緩沖液（pH=7.5，含 8 mmol·L-1MgCl2，2 mmol·L-1EDTA，50 mmol·L-12-Mercaptoethanol），冰浴研磨成勻漿，在4℃下10 000×g離心20 min，上清液即為用于籽粒碳氮代謝若干關(guān)鍵酶的活性測定。其中，谷氨酰胺合酶（Glutamine synthetase，GS）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-oxaloacetic transaminase，GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase，GPT）的生理活性測定參照CAO等[24]的方法；谷氨酸脫氫酶（Glutamate dehydrogenase，GDH）的生理活性測定參照 LEA等[25]的方法。以上酶活生理指標，每樣品重復3次。

1.6 基因表達的熒光定量PCR檢測

取不同灌漿時期的籽粒樣品，去殼后在液氮中研磨成粉末，利用 TransZol法提取水稻籽?？?RNA，并采用DNaseI（Fermentas）對總 RNA 進行消化處理，以消除基因組 DNA 的污染。用瓊脂糖凝膠電泳和微量分光光度計（NanoDrop 2000）掃描檢測提取的RNA的完整性和濃度。cDNA 的反轉(zhuǎn)錄采用 TaKaRa 公司的 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（PerfectReal Time）試劑盒，反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA用于實時熒光定量分析。

利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計有關(guān)基因的熒光定量PCR特異擴增引物（表1），并以 1 μg 總 RNA反轉(zhuǎn)錄得到的第一鏈 CDNA 為模板，采用20 μL反應(yīng)體系用SYBR? Green Real-time PCR Master Mix 試劑盒（Toyobo公司）進行熒光定量PCR檢測，利用BioRad CFX96熒光定量PCR儀完成擴增過程，使用ACTIN-1作為內(nèi)參基因來計算目標基因的相對表達水平。計算方法采用參照基因的△CT法[19]，每樣品重復3次。

表1 熒光定量PCR引物序列Table 1 The primer sequences for quantitative PCR

1.7 考種與計產(chǎn)

水稻成熟后對各處理盆缽中在灌漿結(jié)實期尚未進行動態(tài)取樣的其余稻株收獲考種，考查他們的單株有效穗數(shù)、每穗總（實）粒數(shù)、千粒重和結(jié)實率，然后將單株有效穗數(shù)（每盆栽4株）換算成每盆有效穗數(shù)，并計算每盆的理論產(chǎn)量。

2 結(jié)果

2.1 不同施氮水平下灌漿期高溫對稻米貯藏蛋白含量與蛋白亞基組分及其積累動態(tài)的影響

氮素穗肥和灌漿期高溫均會引起稻米粗蛋白含量的上升，但灌漿期高溫對稻米谷蛋白/醇溶蛋白比值的影響大于氮素處理，以 HN-HT（高氮-高溫）處理的粗蛋白含量最高，LN-NT（低氮-常溫）處理的粗蛋白含量最低，供試2個品種的差異表現(xiàn)基本一致，但在LN-HT（低氮-高溫）和HN-NT（高氮-常溫）這2個處理的粗蛋白含量差異上略有不同（表2）。其中，秀水09的粗蛋白含量在LN-HT和HN-NT處理之間的差異未達到顯著水平，而秀水134在HN-NT處理下的粗蛋白含量顯著高于LN-HT處理，說明氮素穗肥對秀水134稻米粗蛋白含量的影響效應(yīng)要比高溫處理效應(yīng)更明顯。此外，在不同氮素穗肥水平下，灌漿期高溫均會引起糙米率、整精米率和直鏈淀粉含量顯著下降，稻米堊白度顯著上升。與此同時，千粒重和結(jié)實率在高溫處理（LN-HT和HN-HT）下呈下降趨勢，每盆產(chǎn)量也顯著降低，但HN-HT處理的千粒重和結(jié)實率略高于 LN-HT處理，而HN-HT與LN-NT處理間的每盆產(chǎn)量差異不明顯。其中，HN-HT處理的每盆穗數(shù)高于LN-NT處理，但前者的每穗實粒數(shù)和結(jié)實率卻顯著低于后者，兩者在產(chǎn)量構(gòu)成上存在明顯差異。

表2 不同溫度氮肥處理組合下稻米蛋白含量、谷/醇比、直鏈淀粉含量和千粒重等指標的差異Table 2 Differences in grain total protein content, glutelin/ prolamin, amylose content, and some spikelet characters among different temperature-nitrogen treatments

利用水稻籽粒灌漿過程中的動態(tài)取樣，對不同處理單位籽粒中的總蛋白絕對含量及其谷蛋白與醇溶蛋白組分的測定結(jié)果表明（圖 1），單位籽粒中的總蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白含量隨籽粒灌漿過程均呈逐漸上升趨勢，且2個高氮處理（HN-NT和HN-HT）單位籽粒中的總蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白含量分別高于其在相同溫度條件下的低氮處理（LN-NT和LN-HT），但高氮處理下的谷/醇比相對較低，這說明增施氮素可引起單位籽粒中的總蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白積累量上升，并導致稻米谷蛋白/醇溶蛋白比值略有下降。不難發(fā)現(xiàn)，在籽粒灌漿21 d或28 d后，2個高溫處理（LN-HT和HN-HT處理）單位籽粒中的總蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白含量在不同程度上均低于相應(yīng)的常溫處理（LN-NT和HN-NT）。其中，醇溶蛋白在2個高溫處理下的下降幅度相對較大，以 HN-NT處理的醇溶蛋白含量最高，LN-HT處理的醇溶蛋白最低，供試2個品種表現(xiàn)基本一致，但差異幅度略有不同。由此可見，灌漿期高溫雖然會引起水稻籽粒貯藏蛋白相對含量的顯著提高，但單位籽粒貯藏蛋白積累的絕對量卻在不同程度上有所下降；而高溫處理引起的醇溶蛋白含量下降和谷蛋白/醇溶蛋白比值上升，是不同施氮水平下灌漿期高溫對水稻籽粒貯藏蛋白組分影響的一個共同特征。

不同處理下籽粒貯藏蛋白各主要亞基組分差異及其積累動態(tài)變化的 SDS-PAGE檢測結(jié)果表明（圖2），水稻籽粒貯藏蛋白主要由57 kD、37—39 kD、22—23 kD 的3個谷蛋白亞基和13 kD的醇溶蛋白亞基組成，且在不同氮素水平和溫度處理下，這4條主要蛋白條帶均隨水稻籽粒灌漿天數(shù)的推移呈上升趨勢（圖2-A、B）。不同處理組合間相比，LN-HT處理相同時期 13 kD醇溶蛋白亞基的條帶亮度與LN-NT處理相比明顯變淡，HN-HT處理的13 kD醇溶蛋白亞基的條帶亮度也不如HN-NT處理明亮（圖2-A、B），這說明增施氮肥雖引起13 kD醇溶蛋白亞基含量的明顯提升，但高溫處理抑制水稻籽粒灌漿過程中13 kD醇溶蛋白亞基的合成積累。就3個谷蛋白亞基（57 kD、37—39 kD、22—23 kD）條帶而言，灌漿結(jié)實期溫度對37 kD 谷蛋白亞基和22 kD 谷蛋白亞基在條帶亮度的影響遠沒有氮素處理的效應(yīng)明顯，在常溫（NT）和高溫（HT）下，增施氮肥（HN）均會引起灌漿籽粒中37 kD 谷蛋白和22 kD 谷蛋白亞基條帶的亮度增強，且37 kD 谷蛋白亞基與22 kD谷蛋白亞基的條帶亮度幾乎呈同步增強趨勢（圖2-A、B）。上述現(xiàn)象說明，高溫處理降低了13 kD醇溶蛋白亞基在灌漿籽粒中的合成積累量，而增施氮素穗肥可引起灌漿籽粒中 37 kD 谷蛋白酸性亞基和 22 kD谷蛋白堿性亞基含量的明顯提升，但谷蛋白中的 37 kD 亞基與22 kD亞基比例相對穩(wěn)定，受高溫和氮素穗肥的影響均較小。

2.2 不同施氮水平下灌漿期高溫對水稻籽粒貯藏蛋白合成途徑相關(guān)基因表達的影響

由圖 3可見，在正常溫度（NT）條件下，編碼13 kD醇溶蛋白合成的3個同工型基因（Pro13、Pro14和Pro17）在水稻灌漿籽粒中的相對表達量大致呈先升高、后降低的變化趨勢（圖3-A—F），但增施氮肥（HN-NT）可引起Pro13、Pro14和Pro17轉(zhuǎn)錄表達量的峰值延遲，尤其是這 3個同工型基因（Pro13、Pro14和Pro17）在開花后28 d的轉(zhuǎn)錄表達水平明顯高于相同溫度的低氮處理（LN-NT），說明Pro13、Pro14和Pro17在籽粒灌漿中后期（開花后28 d左右）的上調(diào)表達，可能是增施氮肥導致水稻籽粒醇溶蛋白含量提升的一個重要原因。與此同時，編碼13 kD醇溶蛋白合成的3個同工型基因（Pro13、Pro14和Pro17）在2個高溫處理（LN-HT和HN-HT）的轉(zhuǎn)錄表達水平顯著低于2個常溫處理（LN-NT和HN-NT），且在籽粒灌漿各個時期的差異趨勢基本一致（圖 3-A—F），這說明高溫處理顯著抑制Pro13、Pro14和Pro17在水稻籽粒灌漿過程中的轉(zhuǎn)錄表達水平（圖3-A—F）。此外，在高溫脅迫下增施氮肥可在一定程度上引起醇溶蛋白各同工型基因（Pro13、Pro14、Pro17）表達量的提升，但增施氮肥對有關(guān)基因表達量變化的影響程度遠不及高溫脅迫處理明顯（圖3-A—F）。因此高溫處理引起單位水稻籽粒醇溶蛋白積累量下降和稻米谷蛋白/醇溶蛋白比值上升的原因，在很大程度上是由于編碼水稻13kD醇溶蛋白合成基因（Pro13、Pro14和Pro17）在高溫處理下的下調(diào)表達所致。

編碼谷蛋白前體合成的多個主要功能基因（GluA1、GluA2、GluA3、GluB1、GluB4和GluB5）在不同處理下的轉(zhuǎn)錄表達相對較復雜（圖 3）?？傮w而言，在常溫條件下，多數(shù)基因（包括GluA1、GluA2、GluB1、GluB4和GluB5）在籽粒灌漿前期的轉(zhuǎn)錄表達量相對較低，至14—28 d左右時達到其表達量的峰值，在籽粒灌漿后期的表達量下降。增施氮肥（HN）可引起編碼谷蛋白前體合成的多數(shù)功能基因（GluA1、GluA2、GluA3、GluB1、GluB4和GluB5）在籽粒灌漿中后期的表達量上調(diào)，但對有關(guān)基因在籽粒灌漿前期表達量的影響趨勢并不一致，供試2個品種的表現(xiàn)也略有差異；在相同氮水平下，灌漿期高溫（HT）可引起谷蛋白前體合成相關(guān)基因（包括GluA1、GluA2、GluA3、GluB1、GluB4和GluB5）在灌漿前期表達量的上調(diào)，但同時可引起有關(guān)基因在籽粒灌漿中后期的表達量出現(xiàn)迅速下降。其中，HN-HT（高氮-高溫）處理的多數(shù)功能基因（GluA1、GluA3、GluB1、GluB4和GluB5）在籽粒灌漿中后期的表達量大于 LN-HT（低氮-高溫）處理，說明增施氮肥對谷蛋白合成前體相關(guān)基因在籽粒灌漿中后期的迅速下調(diào)表達具有延緩效應(yīng)。

2.3 不同施氮水平下灌漿期高溫對籽粒氮代謝關(guān)鍵酶活性影響及其動態(tài)變化

谷氨酰胺合成酶（GS）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷氨酸脫氫酶（GDH）是植物氮代謝途徑的幾個關(guān)鍵酶，其產(chǎn)物可為籽粒貯藏蛋白合成代謝提供各種氨基酸供體[26-27]。由圖 4可見，HN-NT處理單位籽粒中的GS、GOT和GPT活性在籽粒灌漿前期略低于 HN-HT處理，但在籽粒灌漿的中后期（開花21 d后），前者的GS、GOT和GPT活性卻顯著高于后者（圖 4-A—F）。在高氮水平下，高溫脅迫對籽粒GS、GOT和GPT活性的影響表現(xiàn)出灌漿前期增高、后期降低的基本趨勢（圖 4-A—F）。此外，增施氮肥對籽粒GS、GOT、GPT和GDH活性的影響程度也與灌漿溫度有關(guān)。在常溫處理下，增施氮肥可顯著提高灌漿籽粒中的GS、GOT和GPT活性，并引起灌漿籽粒中的 GDH活性顯著降低，但在高溫處理下，增施氮肥對籽粒GS、GOT和GDH活性的影響幅度相對較?。▓D 4-A—H）。即 2個常溫處理（HN-NT與LN-NT）間的GS、GOT和GDH活性差異大于2個高溫處理（HN-HT與LN-HT），說明高溫脅迫會在一定程度抵消氮肥對水稻籽粒氮代謝的影響效應(yīng)。

3 討論

蛋白質(zhì)是水稻籽粒中僅次于淀粉的第二大貯藏物質(zhì)，受栽培環(huán)境、肥水管理等因素的影響較大[1,5,11,15]。大量研究表明，增施氮肥或前氮后移可引起稻米貯藏蛋白含量較明顯增加，并對部分水稻品種的外觀品質(zhì)和米飯食味產(chǎn)生不利影響[3,9-10,28]。FITZGERALD等[1]認為，施氮量對稻米蛋白含量和米飯食味等品質(zhì)指標的影響程度因品種類型而異。在一定施用量范圍內(nèi)，氮肥施用量過高對粳稻品種的米飯食味、堊白米率和蛋白質(zhì)含量等品質(zhì)指標的影響程度大于秈稻品種[1,10,29-30]。胡群等[28]報道，在機插栽培方式下，提高穗肥的比例會引起稻米蛋白含量增加與食味品質(zhì)下降，堊白米率和堊白度顯著增加，但適當增加穗肥的比例能夠有效地改善稻米的加工品質(zhì)[29]。段驊等[6]發(fā)現(xiàn),在高溫脅迫下適當增施氮肥可提高水稻的結(jié)實率和千粒重,減輕結(jié)實期高溫對籽粒灌漿及產(chǎn)量形成的危害程度；另據(jù)DOU等[9,31]報道，在大田增溫條件下,適當增加氮肥施用量能降低稻米直鏈淀粉含量,并緩解高溫對稻米加工品質(zhì)和外觀品質(zhì)的不利影響[9,31-32]。本研究結(jié)果中，增施氮素穗肥所引起稻米貯藏蛋白的增加，不僅表現(xiàn)在蛋白質(zhì)占籽粒干重的相對含量上，而且表現(xiàn)在單位籽粒的貯藏蛋白積累的絕對量上，但氮肥施用量對稻米直鏈淀粉含量的影響程度相對較小，遠不及灌漿溫度對稻米直鏈淀粉含量和谷蛋白/醇溶蛋白比值的影響明顯。此外，HN-HT（高氮-高溫）處理的稻米堊白度顯著高于相同品種在不同施用氮肥水平下的常溫處理（HN-NT和 LN-NT），而其對整精米率的影響趨勢則相反，前者的整精米率顯著低于后者，但與 LN-HT（低氮-高溫）處理相比，HN-HT（高氮-高溫）處理的稻米堊白度顯著降低，整精米率有所提高（秀水134未達統(tǒng)計顯著水平）。與此同時，HN-HT（高氮-高溫）處理的千粒重和結(jié)實率均略高于LN-HT（低氮-高溫）處理，且在單株（盆）產(chǎn)量指標上，HN-HT處理顯著大于LN-HT處理（表1）。這與段驊等[6]的研究結(jié)論基本一致，進一步證實氮素穗肥在一定程度上緩解高溫脅迫對水稻籽粒灌漿充實與稻米品質(zhì)影響的不利效應(yīng)，而氮素穗肥不足可加劇高溫脅迫對稻米整精米率和稻米堊白表現(xiàn)的負面影響，但本研究結(jié)果中，在相同灌漿溫度條件下增施氮肥對稻米貯藏蛋白的谷/醇比和直鏈淀粉含量影響不大，這與DOU等[9,31]和姚姝等[30]的研究結(jié)論有所不同，其原因可能與供試品種的直鏈淀粉含量高低有關(guān)。需要說明的是，本文利用盆栽試驗進行HN和LN處理的土壤分別取自大田氮肥長期定位試驗田的不施氮區(qū)和施氮區(qū)，兩者在基礎(chǔ)肥力水平上存在一定差別，這是 2個高氮處理（HN-NT和HN-HT）的稻株有效穗數(shù)大于2個低氮處理（LN-NT和LN-HT）的重要原因。與LN-NT處理相比，HN-HT處理的有效穗粒數(shù)增加，但結(jié)實率卻顯著降低，因而這 2個處理（LN-NT和HN-HT）在水稻成熟期的產(chǎn)量水平差別不大，均顯著低于HN-NH處理和高于LN-HT處理。在幾個重要品質(zhì)性狀（整精米率、堊白度、直鏈淀粉含量等）上，LN-NT處理的稻米直鏈淀粉含量和整精米率略高于HN-HT處理，但前者的稻米堊白度大幅度低于后者，在產(chǎn)量水平相近的情況下表現(xiàn)出各自不同的品質(zhì)生態(tài)特點（表2）。

灌漿結(jié)實期溫度是影響稻米蛋白質(zhì)含量和米飯食味的另一個重要環(huán)境生態(tài)因素[5,11,19]。現(xiàn)已基本明確，灌漿結(jié)實高溫或夜間增溫會引起稻米粗蛋白含量提高[7,15]。但對于灌漿結(jié)實期高溫引起稻米蛋白質(zhì)含量上升的原因，究竟是由于灌漿結(jié)實期高溫促進了水稻籽粒蛋白質(zhì)的合成積累，從而直接引起了單位籽粒中貯藏蛋白絕對含量的增加[33]，還是由于高溫脅迫下籽粒粗蛋白占籽粒總干重的相對比值增加，從而間接引起了其相對百分含量的上升[10]，目前尚存在較大爭議。本研究結(jié)果中，稻米粗蛋白的相對含量在HN-HT（高氮-高溫）處理下最高，HN-NT（高氮-常溫）和LN-HT（低氮-高溫）處理次之，LN-NT（低氮-常溫）處理最低（表2），這說明高溫（HT）和高氮（HN）組合對稻米粗蛋白的相對含量影響具有一定“疊加”效應(yīng)，但從單位籽粒貯藏蛋白的絕對含量看，2個高溫處理（HN-HT和LN-HT）在水稻灌漿開始21 d或28 d后的總蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白的積累量卻明顯低于其相同施氮水平的常溫處理（HN-NT和LN-NT）（圖 1），尤其是單位籽粒中的醇溶蛋白絕對量在 2個高溫處理（HN-HT和 LN-HT）下的降低幅度較大（圖1-E，F(xiàn)），從而引起稻米谷/醇比在高溫處理下的顯著下降（圖1-G，H）。利用SDS-PAGE對不同溫-氮處理下籽粒貯藏蛋白亞基組成進行檢測，發(fā)現(xiàn)谷蛋白的57 kD前體亞基（pro-glutelin）、37 kD 酸性亞基（α-glutelin）和22 kD 堿性亞基（β-glutelin），以及醇溶蛋白的13 kD 亞基在高氮處理下（HN-HT和HN-NT）含量均明顯高于其相同溫度下的低氮處理（LN-HT和LN-NT），但相同氮水平下的不同溫度處理間相比，2個高溫處理（HN-HT和LN-HT）的13 kD亞基的條帶亮度卻較其相應(yīng)的常溫處理（HN-NT和LN-NT）明顯變淡（圖2）。進一步對編碼水稻13KD醇溶蛋白合成基因（Pro13和Pro14）在籽粒灌漿過程中轉(zhuǎn)錄表達變化檢測表明，高溫脅迫可引起Pro13和Pro14等醇溶蛋白合成相關(guān)基因在水稻籽粒灌漿過程中的下調(diào)表達（圖3-A—F），并在一定程度上降低單位籽粒中的氮代謝相關(guān)酶（GS、GOT、GPT）在籽粒灌漿中后期的活性（圖 4），以及谷蛋白前體合成相關(guān)基因（GluA1、GluA2、GluA3、GluB1、GluB4和GluB5）在籽粒灌漿中后期的表達水平（圖3-G—R）。由此可見，高溫處理可通過抑制水稻灌漿籽粒中的13 kD醇溶蛋白合成相關(guān)基因的表達，從而引起單位籽粒中醇溶蛋白積累量的顯著降低，而谷蛋白前體合成相關(guān)基因（GluA1、GluA2、GluA3、GluB1、GluB4和GluB5）在籽粒灌漿中后期的表達量雖然也受高溫脅迫所抑制，但下調(diào)幅度相對較小，這可能是灌漿結(jié)實期高溫引起稻米貯藏蛋白的谷/醇比上升和單位籽粒中的貯藏蛋白絕對含量下降的原因。即高溫處理導致水稻籽粒蛋白質(zhì)增加的主要原因，并不是由籽粒氮素物質(zhì)的轉(zhuǎn)運能力和蛋白質(zhì)合成能力的增強所引起的，而是蛋白質(zhì)占籽?？偢芍氐南鄬Ρ戎翟黾铀?。其中，高溫脅迫下水稻籽粒在醇溶蛋白合成能力及其積累量的顯著下降，導致了貯藏蛋白的谷/醇比在高溫下的明顯提升。與之相比，增施氮素穗肥所引起的稻米貯藏蛋白含量增加，不僅表現(xiàn)在蛋白質(zhì)占籽粒干重的相對含量上，而且表現(xiàn)在單位籽粒的貯藏蛋白積累的絕對量上，其主要原因可能是增施氮素穗肥可促進13 kD醇溶蛋白合成相關(guān)基因在籽粒灌漿過程中的上調(diào)表達，并對谷蛋白前體合成相關(guān)基因（GluA1、GluA2、GluA3、GluB1、GluB4和GluB5）表達水平在高溫脅迫下的迅速下降有一定緩解效應(yīng)。

高等植物葉片等器官中的無機氮素是以氨基酸、酰胺的形式輸送到籽粒，進而在籽粒中合成蛋白質(zhì)[34]。其中，谷氨酰胺合成酶（GS）能在 ATP供能下催化谷氨酸和 NH3生成谷氨酰胺，又能通過 GS/GOGAT循環(huán)催化谷氨酰胺和α-酮戊二酸之間的氨基轉(zhuǎn)移來調(diào)節(jié)谷氨酸的生成，在無機氮轉(zhuǎn)化為有機氮的這一代謝環(huán)節(jié)中起關(guān)鍵作用，而其所生成的谷氨酸則在谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）等催化下轉(zhuǎn)化為其他氨基酸（如天門冬氨酸和丙氨酸等），從而為籽粒蛋白合成代謝提供各種氨基酸供體[34-35]。肖輝海等[36]研究認為，水稻灌漿期籽粒中GS活性的提高是高溫處理下籽粒粗蛋白總量增加的一個重要原因，但梁成剛等[37]研究表明，高溫處理下水稻籽粒中的GS酶活性有明顯下降，并認為籽粒GS不是高溫處理對水稻籽粒氮代謝和蛋白合成影響的關(guān)鍵酶。根據(jù)本文對上述幾個關(guān)鍵酶在籽粒灌漿過程中的動態(tài)變化及其在不同溫氮處理組合間差異的比較分析，高溫脅迫除引起低氮水平下的GS活性明顯上升之外，HN-HT（高氮-高溫）處理在籽粒灌漿主要時期的GS、GOT、GPT活性均低于HN-NT（高氮-常溫）處理。再則，增施氮肥對籽粒GS、GOT、GPT和GDH活性的影響程度也與灌漿溫度有關(guān)。在常溫處理下，增施氮肥可顯著提高灌漿籽粒中的GS、GOT和GPT活性，并引起灌漿籽粒中的 GDH活性顯著降低，但在高溫處理下，增施氮肥對籽粒GS、GOT和GDH活性的影響幅度相對較小（圖 4-A—H）。李雙哲[38]研究發(fā)現(xiàn)，種植季節(jié)和施氮水平對水稻葉片器官的GS和GOT活性存在相互作用，同一水稻品種晚季種植旗葉中的 GS和 GOT活性高于早季，但前者隨施氮水平增加的增幅卻低于早季?？紤]到“源”器官向“庫”器官的氮素轉(zhuǎn)運主要是有機氮形態(tài)[34]，且作物籽粒中的 GS、GOT和GDH活性通常遠低于葉片、根系等無機氮的主要同化器官[34,39]。因此，溫氮互作對水稻氮代謝關(guān)鍵酶的影響在水稻植株的不同器官存在較明顯差別，而在高氮水平下，高溫脅迫引起水稻籽粒灌漿過程中GS、GOT、GPT活性的顯著降低，說明高溫脅迫會在一定程度“抵消”增施氮肥對水稻籽粒氮代謝的增進效應(yīng)，并對水稻籽粒中氨基酸轉(zhuǎn)運代謝過程產(chǎn)生不利影響，進而影響籽粒貯藏蛋白的合成過程。值得一提的是，氮肥水平和灌漿期高溫，不僅對水稻籽粒灌漿過程中的氨基酸轉(zhuǎn)運和貯藏蛋白合成代謝產(chǎn)生影響，而且與籽粒器官中的碳-氮分流、蔗糖卸載和淀粉合成積累過程存在密切聯(lián)系[13,27,39]，因此進一步揭示不同氮素水平下灌漿期高溫對水稻貯藏蛋白積累及組分影響與籽粒蔗糖卸載-淀粉合成代謝過程間的相互聯(lián)系，對于水稻優(yōu)質(zhì)與高產(chǎn)相協(xié)同的栽培調(diào)控機理問題研究具有重要意義。

4 結(jié)論

氮素穗肥和灌漿結(jié)實期高溫均引起稻米蛋白質(zhì)含量上升，但單位籽粒中的貯藏蛋白絕對量在高溫處理下呈下降趨勢，以13 kD醇溶蛋白亞基組分受高溫影響的下降幅度最大，導致稻米貯藏蛋白的谷/醇比降低，其原因主要是由于編碼水稻13 kD醇溶蛋白合成基因Pro13在高溫處理下的下調(diào)表達所致，且稻米貯藏蛋白在灌漿期高溫下的相對含量增加,并不是由其灌漿籽粒中的氮轉(zhuǎn)運代謝和蛋白質(zhì)合成能力的增強所致；增施氮素穗肥顯著增加稻米貯藏蛋白相對含量和單位籽粒蛋白絕對含量，但對貯藏蛋白的谷/醇比影響不大，且谷蛋白組分中的 37 kD酸性亞基和22 kD堿性亞基在不同氮處理水平下的相對比例基本保持穩(wěn)定；氮素穗肥可提高水稻籽粒灌漿中后期谷氨酰胺合成酶（GS）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）酶活性，并引起灌漿籽粒谷氨酸脫氫酶（GDH）活性顯著降低，但對高溫灌漿籽粒中GS、GOT和GDH活性的影響程度相對較小，因此高溫脅迫在一定程度可“抵消”增施氮肥對水稻籽粒氮代謝的增進效應(yīng)，進而影響水稻籽粒中的貯藏蛋白合成過程。