胡鵬，穆合塔爾·阿西木，乃比江·阿布都熱西提，阿迪力·艾斯托拉，黃楠楠，王艷，何新，3

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.和田地區(qū)維吾爾醫(yī)醫(yī)院，和田 848000；3.廣東藥科大學(xué)，廣州 510006）

腦卒中是一種突發(fā)性且進(jìn)展迅速的腦缺血性或出血性疾病，病死率高，致殘性強(qiáng)，復(fù)發(fā)率高[1]。目前臨床治療方法主要為靜脈溶栓和機(jī)械取栓[2]，組織纖溶酶原激活劑（t-PA）是目前唯一經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局正式批準(zhǔn)的用于治療急性缺血性卒中的有效藥物，其治療時(shí)間窗狹窄（發(fā)病后4.5 h內(nèi)），存在頸部血腫，脊髓血腫，血管性水腫和過敏反應(yīng)等不良反應(yīng)，其臨床應(yīng)用受到很大限制[3]，且這些治療方法不能有效防止缺血引起的腦組織損傷與功能障礙[4]，需要尋找能夠有效防治腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)藥物。

維吾爾醫(yī)學(xué)歷史悠久，是中國新疆維吾爾族在長期與疾病作斗爭過程中形成的、具有獨(dú)特理論的醫(yī)學(xué)體系，是中醫(yī)學(xué)的重要組成部分。維藥止痛努加蜜膏是由訶子肉、毛訶子肉、余甘子、西青果等19味中藥組成的復(fù)方制劑，收載于中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)-維吾爾藥分冊[5]中，為棕色的蜜膏，用于臨床治療腦梗死后遺癥恢復(fù)早期引起的偏癱，療效確切。然而，原制法制得的蜜膏具有劑量大、服用不便，以原粉入藥、微生物易超標(biāo)的缺點(diǎn)，為方便臨床使用擬將其開發(fā)成止痛努加片。因此，本研究基于pMCAO模型大鼠考察止痛努加蜜膏提取物對局灶性腦缺血的預(yù)防藥效學(xué)，進(jìn)一步揭示不同劑量下止痛努加蜜膏提取物對缺血性腦卒中的神經(jīng)保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 儀器 FA 2004型萬分之一分析天平（上海舜宇恒平儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市科析儀器有限公司）。

1.2 藥物及試劑 止痛努加蜜膏組成：訶子肉、毛訶子肉、西青果等全方藥材均購置于新疆和田地區(qū)維吾爾醫(yī)院，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)王艷副教授鑒定訶子肉、毛訶子肉、余甘子、菟絲子、陳皮、大黃、西紅花、玫瑰花符合《中國藥典》（2005年版一部）規(guī)定；薰衣草、阿里紅、小豆蔻、牛舌草符合《中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》（維吾爾藥分冊）規(guī)定；乳香符合《關(guān)于頒布兒茶等43種進(jìn)口藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的通知》（國食藥監(jiān)注[2004]144號(hào)）規(guī)定；西青果、盒果藤（根皮）、歐亞水龍骨、鐵力木、毛甘松符合《自定標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定；超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號(hào)：MBS268427，Mybiosource）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（批號(hào)：RTA00，R&D Systems）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）溶液（0.01 mol/L，拜意爾生物公司）；2838-4A 型線栓直徑（0.38±0.02）mm（北京西濃科技有限公司）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，批號(hào)：080322，上海華東師范大學(xué)化工廠）；硫酸慶大霉素注射液（批號(hào)：20190226，石家莊市藁城區(qū)四海藥業(yè)有限公司）；HEPES（批號(hào)：1002072328，SIGMA）。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量（300±20）g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供（北京，質(zhì)量合格證No.11401500052236）。實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于光照12 h、溫度24～26℃、相對濕度為40～70%的環(huán)境中自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 止痛努加蜜膏提取物制備 稱取阿里紅、鐵力木、毛甘松、小豆蔻、乳香、牛舌草、陳皮、大黃、西紅花粉碎成細(xì)粉，稱取訶子肉、毛訶子肉、余甘子、西青果、盒果藤根皮、歐亞水龍骨、菟絲子、薰衣草、玫瑰花置于圓底燒瓶，加入8倍量水回流提取2次，每次3 h，濃縮至0.010 8 g/mL與0.032 4 g/mL，加入上述細(xì)粉，備用。

2.2 分組 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組、模型組、止痛努加蜜膏提取物高（0.324 g/kg）、低（0.108 g/kg）劑量組、止痛努加蜜膏提取物高劑量+LY294002組。各組大鼠按所設(shè)劑量灌胃給藥，連續(xù)4 d，于末次給藥2 h后造模。LY294002為側(cè)腦室注射給藥，于末次灌胃給藥2 h后側(cè)腦室注射LY294002，再進(jìn)行造模。

2.3 大鼠永久性腦缺血模型制作[6]根據(jù)改良的Zea Longa線栓法，制成大鼠左側(cè)大腦永久性中動(dòng)脈梗死模型（pMCAO），禁食 12 h，稱質(zhì)量后，按0.35 mL/100 g腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后將大鼠放在電熱恒溫板（37.0±0.5）℃上仰位固定大鼠，碘酒消毒頸部，頸正中偏右切口，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈，分離頸外動(dòng)脈和頸內(nèi)動(dòng)脈。在頸外動(dòng)脈穿1根3.0號(hào)外科縫合線結(jié)扎頸外動(dòng)脈的近心端。在頸總動(dòng)脈遠(yuǎn)心端剪一“V”字形口，插入線栓18～20 mm至大腦中動(dòng)脈?？p合皮膚，消毒，觀察生命體征，待動(dòng)物清醒后放入飼養(yǎng)籠中，自由進(jìn)食進(jìn)水。假手術(shù)組除不插入線栓外手術(shù)方法與模型組相同。

2.4 側(cè)腦室注射LY294002 去除大鼠頭部毛發(fā)，麻醉后酒精消毒，取頭顱正中做縱行切口，分離顱骨上腱膜及顱骨外膜，充分暴露前囟、后囟及冠狀縫。在定位儀上固定好預(yù)先裝有10 μL的微量注射器。移動(dòng)微量注射器的尖端到前囟后0.8 mm，中線向左旁開1.5 mm處，然后用電鉆在顱骨表面鉆孔，直徑約為1.0 mm。微量注射器沿鉆孔進(jìn)針，深度3.5 mm，緩慢勻速注射LY294002，留置10 min后緩慢退出注射器。手術(shù)區(qū)域給予少許氨芐青霉素，縫合切口，30 min后進(jìn)行pMCAO模型制備[7]。

2.5 神經(jīng)功能障礙評分 參考Longa評分法[8]，無神經(jīng)功能缺損癥狀為0分；不能完全伸展梗死對側(cè)前爪或后爪為1份；行走時(shí)，向手術(shù)對側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；行走時(shí)，向手術(shù)對側(cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失為4分，判斷大鼠神經(jīng)功能缺損程度。

2.6 腦梗死體積測定 大鼠麻醉后取腦，于-20℃冰箱中速凍20min左右后，作2mm厚度的連續(xù)切片，共7片。將切片置于2%的TTC中，避光，于37℃電熱板染色20 min，將染色的腦片按切片順序排列，標(biāo)號(hào)、設(shè)定標(biāo)尺并拍照，利用Image J（版本1.42）圖像處理軟件計(jì)算腦梗死體積。梗死體積%=梗死體積/大腦體積×100%。

2.7 腦組織中SOD和TNF-α含量測定 造模后，麻醉大鼠，使用PBS心臟灌流，去除紅細(xì)胞和血塊。取腦組織，稱取梗死半腦質(zhì)量，于勻漿管中加入9倍量HEPES進(jìn)行勻漿，制成10%組織勻漿。將組織勻漿于4℃，離心半徑2 000 rpm/min離心15 min，取上清備用。按照SOD和TNF-α試劑盒操作說明，對腦組織勻漿中SOD和TNF-α的含量進(jìn)行測定。

2.8 Western Blot法檢測 p-Akt、NF-κB、Nrf2 的表達(dá) 造模24 h后，每組取6只動(dòng)物，切取缺血半腦組織，加入裂解液裂解細(xì)胞提取總蛋白，BCA法測定樣本蛋白含量。經(jīng)SDS凝膠分離蛋白后轉(zhuǎn)模于PVDF膜，封閉1 h，加入對應(yīng)一抗，4℃過夜，二抗室溫避光搖床孵育1 h。曝光顯影，用Image J軟件分析灰度值。以 p-Akt、NF-κB、Nrf2 灰度值與 β-actin灰度值的比值反映蛋白表達(dá)水平。

2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)的組間比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA）多個(gè)樣本均數(shù)間的兩兩比較采用Tukey法，P＜0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 止痛努加蜜膏提取物對pMCAO大鼠神經(jīng)保護(hù)作用研究 由表1可知，假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評分為0，模型組神經(jīng)功能損傷評分升至（3.00±0.93）分，較假手術(shù)組顯著增高（P＜0.01），表明模型建立成功。與模型組比較，止痛努加蜜膏提取物高劑量組（1.50±0.58）大鼠神經(jīng)功能評分顯著降低（P＜0.05）。表明止痛努加蜜膏提取物能改善pMCAO大鼠神經(jīng)功能損傷。與高劑量組相比，側(cè)腦室注射LY294002后，神經(jīng)功能評分顯著上升（P＜0.05）。表明提取物可能通過激活PI3K-Akt通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

表1 止痛努加蜜膏提取物對pMCAO大鼠神經(jīng)功能的影響（±s）

表1 止痛努加蜜膏提取物對pMCAO大鼠神經(jīng)功能的影響（±s）

注：與假手術(shù)組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05。

組別 動(dòng)物數(shù)假手術(shù)組 12模型組 12止痛努加蜜膏提取物組 12止痛努加蜜膏提取物組 12止痛努加蜜膏提取物+LY294002組12劑量（g/kg） 神經(jīng)功能評分（分）—0—3.00±0.93**0.108 2.20±0.84 0.324 1.50±0.58#0.324 2.80±0.79

3.2 止痛努加蜜膏提取物對pMCAO大鼠腦缺血損傷的影響 由圖2可知，與假手術(shù)組比較，模型組的腦梗死率顯著增加（P＜0.01），說明造模成功；與模型組比較，止痛努加蜜膏提取物低劑量組，高劑量組的腦梗死率顯著降低（P＜0.01）。表明止痛努加蜜膏提取物具有降低腦梗死率的作用，對腦缺血損傷具有保護(hù)作用，且側(cè)腦室注射LY294002后，保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)。表明提取物可能通過激活PI3K-Akt通路發(fā)揮對腦缺血損傷的保護(hù)作用。

圖1 不同劑量止痛努加蜜膏提取物對pMCAO大鼠腦梗死百分比的影響（n=6）

圖2 腦切片TTC染色圖

3.3 止痛努加蜜膏提取物對pMCAO大鼠腦組織中NF-κB，Nrf2及p-Akt蛋白表達(dá)的影響 由表2可知，各組大鼠腦組織中Akt含量未發(fā)生明顯改變。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠大腦中p-Akt和Nrf2的表達(dá)顯著減少，NF-κB的表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。與模型組相比，止痛努加蜜膏提取物給藥組能夠增加p-Akt和Nrf2的表達(dá)，減少NF-κB的表達(dá)（P＜0.01）。表明止痛努加蜜膏提取物能夠激活PI3K-Akt通路，調(diào)節(jié)NF-κB，Nrf2蛋白的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮抗腦缺血損傷的作用。

表2 各組大鼠腦組織NF-κB、Nrf2及p-Akt蛋白表達(dá)水平（±s）

表2 各組大鼠腦組織NF-κB、Nrf2及p-Akt蛋白表達(dá)水平（±s）

注：與假手術(shù)組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù)假手術(shù)組 6模型組 6止痛努加蜜膏提取物組 6止痛努加蜜膏提取物組 6劑量g/（kg·d）Akt/β-actinp-Akt/β-actinNF-κB/β-actinNrf2/β-actin—1.016±0.108 1.649±0.059 0.543±0.053 0.745±0.025—1.082±0.104 0.469±0.027** 1.518±0.109** 0.288±0.057**0.108 1.120±0.074 0.907±0.085# 0.517±0.117# 0.408±0.171 0.324 1.181±0.129 1.505±0.053## 0.444±0.035## 0.669±0.133##

3.4 止痛努加蜜膏提取物對pMCAO大鼠腦組織中SOD和TNF-α含量的影響 由表3可知，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠大腦中SOD含量顯著減少（P＜0.01）。與模型組相比，止痛努加蜜膏提取物組大鼠腦組織中SOD含量顯著增加（P＜0.01）。表明止痛努加蜜膏提取物可能通過增加Nrf2蛋白表達(dá)，增加腦組織中SOD含量，進(jìn)而發(fā)揮抑制氧化反應(yīng)的作用。與假手術(shù)組相比，模型組大鼠大腦中TNF-α含量顯著增加（P＜0.01）。與模型組相比，止痛努加蜜膏提取物組大鼠腦組織中TNF-α含量顯著減少（P＜0.05）。表明止痛努加蜜膏提取物可能通過減少NF-κB蛋白表達(dá)，減少TNF-α含量，最終抑制炎癥反應(yīng)。

表3 各組大鼠腦組織中SOD、TNF-α水平（±s）

表3 各組大鼠腦組織中SOD、TNF-α水平（±s）

注：與假手術(shù)組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 動(dòng)物數(shù) 劑量g/（kg·d）假手術(shù)組模型組止痛努加蜜膏提取物組止痛努加蜜膏提取物組6 6 6 6 TNF-α（pg/mL）— 307.23±21.05 75.58±18.33— 168.93±20.42**208.96±48.20**0.108 266.70±12.92##129.97±28.73#0.324 250.11±34.34## 94.64±27.43##SOD（U/mg prot）

圖3 各組大鼠腦組織中NF-κB、Nrf2、p-Akt蛋白表達(dá)水平

4 討論

研究表明，缺血后神經(jīng)保護(hù)治療可以顯著延長靜脈溶栓治療時(shí)間窗[9]，止痛努加蜜膏是防治腦缺血損傷的維藥復(fù)方制劑，具有通阻養(yǎng)神、神經(jīng)保護(hù)的作用，但目前對于其抗腦缺血損傷的實(shí)驗(yàn)研究較少，其作用機(jī)制尚不明確。本研究采用大鼠腦中動(dòng)脈阻塞法構(gòu)建永久性局部腦缺血損傷模型，觀察止痛努加蜜膏提取物對腦缺血損傷的作用并探討其可能的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組大鼠腦梗死體積明顯增大，神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重，止痛努加蜜膏提取物對大鼠灶腦缺血損傷具有良好的保護(hù)作用，可有效改善腦pMCAO大鼠神經(jīng)功能損傷程度，減小梗死面積，降低腦組織中TNF-α含量，升高SOD活性，上調(diào)腦組織中p-Akt、Nrf2蛋白表達(dá)和下調(diào)NF-κB蛋白表達(dá)。側(cè)腦室注射LY294002后，提取物神經(jīng)保護(hù)作用被逆轉(zhuǎn)。

研究藥物的分子機(jī)制，探尋藥物作用的靶點(diǎn)有利于藥物的使用和優(yōu)化。近年來，越來越多的證據(jù)表明，缺血性腦損傷過程中常伴有氧化應(yīng)激、炎癥、細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象[10]。PI3K/Akt信號(hào)通路是一種重要的信號(hào)介質(zhì)，與細(xì)胞代謝、程序性凋亡死亡、氧化損傷、炎癥等方面都有聯(lián)系，是一條神經(jīng)保護(hù)信號(hào)通路[11-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，p-Akt在pMCAO模型大鼠腦組織中表達(dá)減少，給予止痛努加蜜膏提取物后p-Akt的蛋白表達(dá)明顯升高。注射PI3K特異性抑制劑LY294002[16]后，止痛努加蜜膏提取物的神經(jīng)保護(hù)作用被抑制。由此可見，止痛努加蜜膏提取物可通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮對大鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用。

Nrf2屬于轉(zhuǎn)錄因子亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄激活因子家族成員，是細(xì)胞防御應(yīng)激損傷的關(guān)鍵因子[17]，生理狀態(tài)下，Nrf2與胞質(zhì)接頭蛋白Keap1結(jié)合，活性被抑制，在PI3K/Akt的調(diào)控下，Keap1的構(gòu)象發(fā)生改變[18]，Nrf2與Keap1解離進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)Ⅱ相酶基因表達(dá)[19]，通過誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，構(gòu)成高效的細(xì)胞內(nèi)抗氧化體系，清除氧自由基[20]。SOD是機(jī)體中重要的自由基清除劑之一，腦組織中自由基含量上升時(shí)，SOD將被大量消耗，導(dǎo)致腦組織中SOD含量減少[21]。因此SOD含量能間接反映腦組織受自由基損害的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示止痛努加蜜膏提取物可增加SOD含量和上調(diào)Nrf2蛋白表達(dá)，對局灶性腦缺血損傷有明顯的抗氧化應(yīng)激的保護(hù)作用。

NF-κB是一種具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，在發(fā)生腦缺血損傷后，NF-κB被激活，從而啟動(dòng)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與炎癥反應(yīng)、自由基損傷和細(xì)胞凋亡等病理生理過程。Akt可直接或間接的調(diào)節(jié)IκB激酶活性，抑制NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而抑制相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，同時(shí)NF-κB也可以調(diào)節(jié)HO-1活性及其生物學(xué)作用。TNF-α是體內(nèi)一種重要的炎癥因子，其表達(dá)水平反映組織中的炎癥程度[22]。見圖4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，止痛努加蜜膏提取物能夠降低腦組織中TNF-α含量，減少NF-κB的蛋白表達(dá)，減輕局灶性腦缺血損傷中的炎癥反應(yīng)，繼而發(fā)揮腦保護(hù)作用。

圖4 PI3K/Akt通路與Nrf2、NF-κB蛋白關(guān)系圖

綜上所述，止痛努加蜜膏提取物能夠改善pMCAO大鼠的神經(jīng)功能損傷，降低腦梗死率，對腦缺血損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能是通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)Akt的磷酸化，進(jìn)而調(diào)節(jié)Nrf2、NF-κB蛋白表達(dá)，發(fā)揮抗炎和抗氧化作用，最終產(chǎn)生對腦缺血損傷的保護(hù)作用。