劉萍，徐龍進(jìn)，霍青，邱朝陽

（1.山東省婦幼保健院，濟(jì)南 250014；2.山東省疾病預(yù)防控制中心，濟(jì)南 250014；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院腦病科，濟(jì)南 250011；4.濰坊醫(yī)學(xué)院，濰坊 261000）

帕金森?。≒D）是一種多發(fā)于中老年人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其臨床癥狀復(fù)雜多樣，病情持續(xù)進(jìn)展，無法根治，致殘率高，嚴(yán)重的影響了患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)。高水平的α-突觸核蛋白（α-syn）的異常聚集被認(rèn)為是導(dǎo)致多巴胺（DA）能神經(jīng)元變性、壞死的元兇[1]。自噬-溶酶體途徑（ALP）是機(jī)體清理自身多余或者被損傷的細(xì)胞器，降解錯(cuò)誤折疊、異常聚集蛋白質(zhì)的一種途徑。自噬在維持DA神經(jīng)元內(nèi)α-syn蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用，自噬激活能夠清除細(xì)胞內(nèi)異常聚集的α-syn，減輕其細(xì)胞毒性，保護(hù)DA能神經(jīng)元[2]。因此，尋找一個(gè)有效的治療方法，改善自噬功能，促進(jìn)異常聚集α-syn的降解成為防治PD的一個(gè)新突破口。

水木和寧方為導(dǎo)師霍青教授臨床治療帕金森病的經(jīng)驗(yàn)方，方以滋補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)、祛瘀化痰為原則，課題組前期多項(xiàng)臨床研究表明其可有效改善PD患者的運(yùn)動(dòng)及非運(yùn)動(dòng)癥狀，但其潛在靶點(diǎn)尚不明確[3-5]。本研究采用頸背部皮下注射魚藤酮的方法建立PD小鼠模型，從自噬途徑探討水木和寧方對α-syn及中腦黑質(zhì)內(nèi)酪氨酸羥化酶（TH）的影響，明確水木和寧方治療PD的可能作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 帕金森模型制備 SPF級(jí)雄性C57/BL小鼠120只，8周齡，體質(zhì)量20～22 g。適應(yīng)3 d后，隨機(jī)分為6組。除正常組外其余小鼠頸背部皮下注射魚藤酮[1 mg/kg，二甲基亞砜（DMSO）∶魚藤酮∶生理鹽水=7∶2∶1]制作 PD 模型，每日 1 次，連續(xù) 42 d，正常組注射等量的DMSO、生理鹽水的混合液。參照陳忻等[6]制定的模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，采用評(píng)分2～8分的小鼠作為PD模型。

1.2 藥物制備 水木和寧方顆粒劑（生地黃10 g，熟地黃 10 g，山茱萸 6 g，黃精 10 g，枸杞子 10 g，牛膝10 g，當(dāng)歸10 g，白芍10 g，桃仁10 g等32味藥，共301 g）購于山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。將顆粒煎煮、過濾后，置60℃水浴箱內(nèi)濃縮藥液。美多芭0.25 g，每片含左旋多巴200 mg、鹽酸芐絲肼50 mg，上海羅氏制藥有限公司，批號(hào)：SH2070，以蒸餾水配制混懸液。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 選取造模成功的小鼠60只，隨機(jī)分為高劑量組、中劑量組、低劑量組、美多芭組、模型組，每組12只，正常組隨機(jī)選取12只，共6組。高、中、低劑量組分別給予水木和寧方60 g/kg、30 g/kg、15 g/kg灌胃。美多芭組以美多芭50 mg/kg灌胃。模型組及正常組予生理鹽水0.2 mL灌胃。每日兩次，連續(xù)4周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 行為學(xué)檢測 1）體質(zhì)量檢測：分別在造模后、藥物干預(yù)后下午3點(diǎn)進(jìn)行體質(zhì)量檢測。2）外觀及行為學(xué)評(píng)分：觀察動(dòng)物造模后、藥物干預(yù)后毛發(fā)、運(yùn)動(dòng)、拒捕行為等改變。3）步態(tài)分析：長約50 cm，寬10 cm，高15 cm的塑料走道，一端無遮蓋，另一端通向用黑布遮蓋的的籠子，形成一個(gè)一端光明一端黑暗的走道環(huán)境。走道底部鋪上白色紙帶，與走道相適應(yīng)。實(shí)驗(yàn)前讓小鼠適應(yīng)爬行一段時(shí)間，然后使其腳掌蘸上墨水（前腳掌紅色，后腳掌藍(lán)色），頭部正對黑暗一端，自然爬行。取最長的3個(gè)前后肢距離，計(jì)算平均值。4）游泳實(shí)驗(yàn)：40 cm×30 cm×20 cm的水箱中注入溫水，水溫為22～25℃，水深約15 cm，觀察小鼠的游泳情況，時(shí)間為1 min，間隔30 min，檢測3次。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：1 min內(nèi)連續(xù)不斷游泳者3.0分；超過整個(gè)受試時(shí)間50%游泳偶爾漂浮者2.5分；漂浮時(shí)間占整個(gè)受試時(shí)間50%以上者2.0分；偶爾游泳者記1.5分；偶爾用后肢游動(dòng)并漂浮者1.0分；四肢無活動(dòng)者0分。

1.4.2 中腦黑質(zhì)免疫組化檢測TH、α-syn 小鼠腹腔注射4%水合氯醛400 mg/kg，深度麻醉后剪開胸腔，頭皮針插入左心經(jīng)心臟依次灌入生理鹽水40 mL及多聚甲醛40mL，灌注至肢體僵硬，持續(xù)約5～6min。完整取出腦組織，固定于4%多聚甲醛中約14 h。以視交叉前緣和乳頭體后緣為鼠腦表標(biāo)志，取冠狀位厚約2 mm中腦組織。經(jīng)脫水、透明、浸蠟，石蠟后包埋。然后用石蠟切片機(jī)作連續(xù)冠狀位約5 μm厚切片。將切片滴加一抗、二抗，DAB顯色液，陽性為棕黃色，顯微鏡鏡檢，拍照、分析。

1.4.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測中腦黑質(zhì)TH、α-syn、LC3、Beclin1、p62 小鼠給予 10%水合氯醛麻醉，斷頭取腦，冰盤上快速剝離，取出中腦黑質(zhì)部分，放入1.5 mL EP管內(nèi)，-80℃保存。組織裂解液提取蛋白，測定濃度后-80℃冰箱保存。上樣前加磷酸鹽緩沖溶液（PBS）及5×loading buffer配成等質(zhì)量等體積的100μL蛋白體系，水浴鍋加熱8min。根據(jù)蛋白分子量配制12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量為10μL；轉(zhuǎn)膜保持電流260 mA，根據(jù)分子量的大小轉(zhuǎn)膜時(shí)間在1.5～2 h之間，大分子量時(shí)間稍長，小分子量時(shí)間稍短；PVDF膜奶粉封閉，一抗、二抗孵育，然后放入顯影液顯影。

1.4.4 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測中腦黑質(zhì)TH、α-syn、LC3 Ⅱ、Beclin1、p62 Trizol法提取 RNA，加入DEPC水使RNA溶解，測定濃度，-80℃冰箱內(nèi)保存。5×g DNA Eraser Buffer、gDNA、Total RNA、RNase Free dH2O冰上配制反應(yīng)混合液，去除基因組DNA。配制Master Mix 37℃15min 85℃5sec 4℃合成cDNA。配制RT-PCR反應(yīng)體系，加入無酶96孔板中，每孔上樣量為1 μL，每個(gè)基因重復(fù)3個(gè)孔，封膜。離心機(jī)3 000 rpm，離心3 min。使用高通量實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行檢測，見表1。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間對比采用單因素方差分析，均數(shù)組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 水木和寧方對小鼠行為學(xué)的影響

2.1.1 小鼠一般狀態(tài)的變化 造模后小鼠表現(xiàn)出毛發(fā)變黃粗糙，頸背部疤痕明顯，活動(dòng)遲緩、拒捕反應(yīng)減弱，進(jìn)食減少，身體瘦弱，精神狀態(tài)萎靡不振。藥物干預(yù)4周后，毛發(fā)較前柔順有光澤，活動(dòng)增多，拒捕反應(yīng)增強(qiáng)，進(jìn)食增多，體質(zhì)量增長。藥物干預(yù)后稱取各組小鼠體質(zhì)量，高、中、低劑量組和美多芭組可增加小鼠體質(zhì)量，與模型組相比有顯著差異性（P＜0.05），見表2。

表2 水木和寧方對小鼠行為學(xué)的影響

2.1.2 水木和寧方對小鼠行為學(xué)評(píng)分的影響 藥物干預(yù)后，高、中、低劑量組及美多芭組行為學(xué)評(píng)分均有下降趨勢，與模型組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。中劑量組與美多芭組無明顯差異（P＞0.05），表明水木和寧方對小鼠行為學(xué)的改善作用與美多芭相當(dāng)，見表2。

2.1.3 水木和寧方對小鼠步態(tài)實(shí)驗(yàn)的影響 治療后高、中、低劑量組和美多芭組的前后肢步長與生理鹽水組無明顯差異（P＞0.05），說明水木和寧方對小鼠步態(tài)無明顯改善，見表2。

2.1.4 水木和寧方對小鼠游泳實(shí)驗(yàn)的影響 治療后，高、中、低劑量組及美多芭組的游泳評(píng)分均高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量組游泳評(píng)分最高，與美多芭組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。說明水木和寧方有改善小鼠體力的作用，其效果與美多芭相當(dāng)，見表2。

2.2 免疫組化檢測各組小鼠中腦黑質(zhì)TH、α-syn的表達(dá) 使用IPP6.0軟件對免疫組化照片進(jìn)行光密度分析，每張切片選取3張400倍照片，計(jì)算其平均光密度進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，與模型組相比，高、中、低劑量組和美多芭組小鼠黑質(zhì)區(qū)TH陽性表達(dá)顯著升高（P＜0.05），α-syn陽性表達(dá)顯著減少（P＜0.05）。中劑量組α-syn表達(dá)最低，較高、低劑量組及美多芭組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1，圖2，表3。

圖1 各組小鼠中腦黑質(zhì)TH陽性細(xì)胞表達(dá)

圖2 各組小鼠中腦黑質(zhì)α-syn陽性細(xì)胞表達(dá)

表3 各組小鼠中腦黑質(zhì)TH、α-syn平均光密度的比較

2.3 Western blot檢測各組小鼠中腦LC3、Beclin 1、p62、TH、α-syn蛋白含量的表達(dá) 每組取5只小鼠進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：與模型組相比，高、中、低劑量組及美多芭組LC3 Ⅱ、Beclin1、TH蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），p62、α-syn 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05），中劑量組效果最佳，與美多芭組相比，TH蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），LC3 Ⅱ、Beclin1 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），p62、α-syn 蛋白表達(dá)降低，見圖3，表4。

圖3 各組小鼠中腦α-syn、TH、LC3、p62、Beclin1的蛋白表達(dá)

表4 小鼠中腦黑質(zhì)LC3 Ⅱ、p62、Beclin1、TH、α-syn灰度值

2.4 水木和寧方對小鼠中腦組織 LC3 Ⅱ、p62、Beclin1、TH、α-syn mRNA水平的影響 每組取4只小鼠進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)，研究結(jié)果顯示：與模型組相比，高、中、低劑量組和美多芭組LC3 Ⅱ mRNA、Beclin1 mRNA、TH mRNA 表達(dá)升高，p62 mRNA、α-syn mRNA表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；中劑量組優(yōu)于高、低劑量組及美多芭組（P＜0.05），見表5。

表5 小鼠LC3 Ⅱ mRNA、p62 mRNA、α-syn mRNA、Beclin1 mRNA、TH mRNA的轉(zhuǎn)錄水平

3 討論

PD的主要病理表現(xiàn)為黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的變性丟失，導(dǎo)致抑制性遞質(zhì)多巴胺含量減少，從而出現(xiàn)全身主動(dòng)肌、拮抗肌同時(shí)興奮的癥狀。美多芭可補(bǔ)充腦內(nèi)DA的含量，對于PD有明確的治療作用，但對受損的DA能神經(jīng)元沒有保護(hù)作用，故只能用于改善臨床癥狀。小劑量的左旋多巴雖可有效改善帕金森癥狀，但不良反應(yīng)發(fā)生率較高，且不能阻止病程進(jìn)展。由于外源性補(bǔ)充左旋多巴產(chǎn)生脈沖樣的多巴胺能刺激，且腦對多巴胺能活性的下降缺乏代償性能力，隨著美多芭治療時(shí)間的延長，患者多會(huì)出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)并發(fā)癥反而加重病情。因此在控制臨床癥狀的基礎(chǔ)上，延緩病情進(jìn)展，減少藥物不良反應(yīng)是治療PD的關(guān)鍵。

異常聚集的α-syn形成的路易小體是帕金森病的主要病理特征，可引起DA能神經(jīng)元變性、壞死，最終致使患者出現(xiàn)PD癥狀[8]。α-syn的降解受泛素蛋白酶復(fù)合體系統(tǒng)（UPS）和自噬溶酶體通路（ALP）共同調(diào)節(jié)。α-syn的過度表達(dá)可抑制Atg9定位于泡膜，使自噬體形成受阻，還可導(dǎo)致神經(jīng)炎癥的發(fā)生，影響突觸囊泡的完整性及胞質(zhì)DA水平，并能阻礙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基囊泡運(yùn)輸功能，進(jìn)而影響自噬的發(fā)生[9]。自噬功能降低可促進(jìn)α-syn的異常聚集，α-syn過度積累后又可阻礙自噬的發(fā)生，形成惡性循環(huán)，因此自噬對于維持多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)α-syn的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮關(guān)鍵作用，自噬激活可促進(jìn)沉積在細(xì)胞內(nèi)的α-syn的降解，緩解其細(xì)胞毒性，保護(hù)DA能神經(jīng)元，延緩PD病程[10]。

自噬作為一種重要的物質(zhì)代謝方式和自我保護(hù)機(jī)制與肝主疏泄、腎氣推動(dòng)氣化作用相似，是推動(dòng)五臟運(yùn)化津血為機(jī)體提供能量和運(yùn)化痰瘀等病理產(chǎn)物這兩方面功能的微觀體現(xiàn)[11-12]。肝腎虧虛，五臟虛損，疏泄不及，動(dòng)力不足，津血運(yùn)行失常，痰瘀內(nèi)生，這與自噬功能低下，代謝廢物堆積的過程相對應(yīng)。本研究所采用的水木和寧方以滋補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)、祛瘀化痰為治則，中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)、整體治療的特點(diǎn)，結(jié)合辨證論治，可從整體調(diào)節(jié)機(jī)體陰陽平衡，改善微環(huán)境。鑒于自噬在中醫(yī)中和本虛、痰瘀的關(guān)系，及水木和寧方治療帕金森病的確切療效，推測自噬溶酶體通路可能就是水木和寧方治療PD的潛在靶點(diǎn)。方中熟地黃、山茱萸、黃精3藥合用，肝、脾、腎并補(bǔ)，龜板、懷牛膝補(bǔ)益肝腎，強(qiáng)健腰膝，兼能活血。肉蓯蓉、淫羊藿溫腎助陽，鼓舞腎氣，亦取“陽中求陰”之義。桃仁、紅花、當(dāng)歸活血化瘀通絡(luò)而不傷血，地龍深入隧絡(luò)攻剔痼結(jié)之痰瘀，引諸藥力直達(dá)絡(luò)中。石菖蒲、陳皮、佛手疏肝健脾、理氣化痰。知母、麥冬、白芍滋陰斂液，舒筋和脈。黨參、黃芪、茯苓、白術(shù)健脾益氣以補(bǔ)后天之本。整方虛實(shí)并調(diào)，寓通于補(bǔ)，以滋補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)、祛瘀化痰為主，兼養(yǎng)陰柔筋、健脾益氣?，F(xiàn)代藥理研究亦證明方中多味藥不僅具有抗神經(jīng)炎癥、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡的作用，還可通過調(diào)節(jié)自噬和泛素蛋白酶體途徑促進(jìn)α-syn的降解，升高TH的表達(dá)，增加DA的含量，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元的作用[13-15]。

本研究顯示，藥物干預(yù)后，水木和寧方可提高TH蛋白及mRNA含量，中劑量組效果最佳，與美多芭療效相當(dāng)；可降低α-syn蛋白及mRNA含量，療效優(yōu)于美多芭。提示水木和寧方可緩解魚藤酮造成的DA能神經(jīng)元損害，提高TH及其mRNA的活性和表達(dá)，清除細(xì)胞中過量的α-syn，減輕α-syn對DA能神經(jīng)元的毒性作用。LC3 Ⅱ存在于自噬體形成的各階段中，自噬激活初期，大量的自噬體形成，LC3 Ⅱ蛋白的含量上升，當(dāng)自噬體和溶酶體融合時(shí)其含量降低。p62受體蛋白在α-syn的降解中發(fā)揮重要作用[16]。Western blot及PCR結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組LC3Ⅱ、p62 mRNA及蛋白含量均增高，提示自噬過程遭到阻滯并未完成；高、中、低劑量及美多芭組LC3 Ⅱ mRNA及蛋白含量增加，p62 mRNA及蛋白含量降低，提示自噬激活，自噬流順利完成。其中中劑量組療效最佳，優(yōu)于美多芭組。Western blot及PCR結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組Beclin1 mRNA及蛋白表達(dá)含量降低，提示模型組自噬活性降低；高、中、低劑量組及美多芭組Beclin1 mRNA及蛋白表達(dá)含量升高，提示自噬激活。中劑量組Beclin1 mRNA及蛋白表達(dá)含量最高，提示中劑量組自噬活性最高。

綜上所述，水木和寧方從PD的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制α-syn異常聚集出發(fā)，水木和寧方對PD小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)α-syn的異常聚集具有抑制作用，并認(rèn)為上調(diào)自噬水平，改善自噬障礙可能是這種保護(hù)作用的關(guān)鍵機(jī)制，為水木和寧方治療PD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。由于實(shí)驗(yàn)條件的制約，實(shí)驗(yàn)未對調(diào)控自噬的具體機(jī)制進(jìn)行深入研究。后續(xù)實(shí)驗(yàn)可深入研究水木和寧方對自噬的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步明確水木和寧方治療PD的作用機(jī)制。