張玥輝，薄穎異，王文全，，4，常冠華，王文地，崔潔，侯俊玲，4，譚衛(wèi)忠

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；2.天津市寶坻區(qū)人民醫(yī)院藥劑科，天津 301800；3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；4.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京102488；5.國藥控股濟(jì)南有限公司，濟(jì)南 250100）

甘草地上部分為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、脹果甘草 Glycyrrhiza inflata Bat.或光果甘草Glycyrrhiza glabra L.的干燥根和根莖[1]。甘草在中醫(yī)藥中使用非常廣泛，在中國進(jìn)行了大量廣泛的栽培種植。甘草地上部分作為非傳統(tǒng)藥用部位，目前主要做飼料用或焚燒處理，并沒有很好的加以開發(fā)利用。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，其提取物對前列腺炎有一定的治療作用[2]，其乙醇提取物有較好的抗氧化能力[3]。

高效液相色譜二級質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）技術(shù)作為一種物質(zhì)分析手段，同時發(fā)揮了液相的高分離度和質(zhì)譜的高靈敏度和強(qiáng)定性專屬性的特點(diǎn)，在藥學(xué)研究、食品安全等各種領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用[4-5]。在近年針對甘草地上部分的成分鑒定和分離等研究中，HPLC-MS/MS技術(shù)也發(fā)揮了重要的作用[6-7]。本實(shí)驗(yàn)使用HPLC-MS/MS技術(shù)，對甘草地上部分不同提取方法制備的提取產(chǎn)物的化學(xué)組成進(jìn)行了分析鑒定。同時通過查閱文獻(xiàn)，對其中部分物質(zhì)的藥理活性進(jìn)行了梳理總結(jié)，以便有效指導(dǎo)下一步的分離富集工藝優(yōu)化研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters Acquity Xevo G2 QTof質(zhì)譜；Waters Acquity超高效液相系統(tǒng)；超臨界萃?。ū本┗ぜ瘓F(tuán)）；電子調(diào)溫電熱套（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥 水（娃哈哈集團(tuán)有限公司）；乙醇（分析純，北京化工廠）；甲酸（色譜純，F(xiàn)isher Scientific）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific）；

1.3 材料 甘草地上部分樣品2018年9月采集于甘肅省酒泉市瓜州縣河?xùn)|鄉(xiāng)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)王文全教授鑒定為甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的地上部分，陰干，粉碎，過40目篩，備用。

2 方法

2.1 樣品制備方法

2.1.1 水提物制備方法 取甘草地上部分粉末，用去離子水回流提取，料液比1∶6，提取時間90 min，提取兩次。提取液干燥，得到水提物。

2.1.2 醇提物制備方法 取甘草地上部分粉末，用70%乙醇回流提取，料液比1∶6，提取時間90 min，提取兩次。提取液干燥，得到醇提物。

2.1.3 CO2超臨界萃取物制備方法 取甘草地上部分粉末，無水乙醇作夾帶劑，液料比15%，提取時間90 min，提取兩次。28 kPa，50℃，CO2流量 12 kg/h萃取，6 kPa，46.8℃分離。過濾，合并濾液，干燥，得到CO2超臨界萃取物。

2.2 HPLC分析檢測方法Agilent SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：以乙腈-0.5%甲酸水為流動相，（乙腈：0～5 min，10%～15%；5～25 min，15%～35%；25～40 min，35%～60%；40～50 min，60%～85%）；體積流量為 1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量 10 μL；檢測波長為280 nm。

2.3 質(zhì)譜檢測分析方法 電噴霧離子（ESI-）源，源溫度為100℃，脫溶溫度400℃，毛細(xì)管電壓2.5 kV，提取器電壓為40 V，錐孔氣體流量為為50 L/h，脫溶氣體流量為800 L/h，質(zhì)量掃描范圍為m/z 100～1500。

3 結(jié)果與分析

3.1 水提物主要成分分析 經(jīng)過高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF/MS）分析，HPLC色譜圖（上）及總離子流圖（下），見圖1。具體數(shù)據(jù)，見表1。共定性9個化合物，其中5個黃酮醇苷類化合物，3個黃酮苷類化合物，1個異黃酮苷類化合物。

圖1 水提物HPLC圖（上）及總離子流圖（下）

表1 水提物質(zhì)譜信息

3.2 醇提物主要成分分析 經(jīng)過高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜（HPLC-Q-TOF-MS）分析，HPLC色譜圖（上）及總離子流圖（下），見圖2。具體數(shù)據(jù)，見表2。共定性14個化合物，其中兩個黃酮醇苷類化合物，兩個黃酮類化合物，兩個二氫黃酮類化合物，兩個異戊烯基黃酮醇類化合物，兩個二氫芪類化合物等。

圖2 醇提物HPLC圖（上）及總離子流圖（下）

表2 醇提物質(zhì)譜信息

3.3 CO2超臨界萃取物主要成分分析 經(jīng)過HPLC-Q-TOF-MS）分析，HPLC色譜圖（上）及總離子流圖（下）如圖3。具體數(shù)據(jù)，見表3。共定性10個化合物，其中兩個黃酮類化合物，兩個二氫黃酮類化合物，1個查爾酮類化合物，4個異戊烯基黃酮醇類化合物，1個二氫芪類化合物等。

圖3 CO2超臨界萃取物HPLC圖（上）及總離子流圖（下）

表3 CO2超臨界萃取物質(zhì)譜信息

本實(shí)驗(yàn)通過對二級質(zhì)譜碎片圖譜的分析，及查閱對比文獻(xiàn)，對目前已報(bào)道的甘草地上部分黃酮類成分進(jìn)行了分析定性。并根據(jù)所得信息分析了各提取物中有代表性的物質(zhì)的裂解過程。

夏佛塔苷的一級質(zhì)譜中，m/z 563為它的[M-H]-，其主要特征離子為：m/z443（己糖 0-2，120）、473（己糖0-3，90）、353（120+90）、383（120+60）和 503（60）[12]。見圖4。

圖4 夏佛塔苷裂解規(guī)律

槲皮素-3-O-葡萄糖苷糖鏈主要以均裂的方式脫去，一級質(zhì)譜中，m/z 463為它的[M-H]-，脫去m/z 163葡萄糖（C6H11O5）產(chǎn)生的m/z 300的相對強(qiáng)度強(qiáng)于m/z 301，還可以觀察到m/z 271[11]。見圖5。

圖5 槲皮素-3-O-葡萄糖苷裂解規(guī)律

烏拉爾寧的一級質(zhì)譜中，m/z 355為它的[M-H]-，其主要特征離子有：m/z300（M-C4H8），m/z204（1，3B），m/z179（M-B），m/z148（204-C4H8），m/z107（0，4A-）[49]。見圖6。

圖6 烏拉爾寧裂解規(guī)律

4 結(jié)論與討論

本研究中發(fā)現(xiàn)，甘草地上部分主要含有以黃酮類物質(zhì)為主的各種成分。通過水提取、乙醇提取和CO2超臨界萃取的方法，獲得了3種不同的提取物。水提物中含有的物質(zhì)極性較大，其中主要含有黃酮（醇）苷類物質(zhì)。醇提物極性相對較小，其中主要含有黃酮（醇）苷元類物質(zhì)。醇提物和水提物中含有相同的2種物質(zhì)，其余物質(zhì)均不同。CO2超臨界萃取物的極性最小，其中含有相對更多的異戊烯基黃酮類物質(zhì)。CO2超臨界萃取物與水提物沒有相同物質(zhì)，與醇提物有5種相同物質(zhì)相同。

水提取和乙醇提取均屬于溶劑提取，依據(jù)相似相溶的原理，提取出與和溶劑極性接近的物質(zhì)。有操作簡單，溶劑廉價環(huán)保等特點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)室研究中常用的提取方法。超臨界萃取是一種更高效的現(xiàn)代提取方法，利用超臨界狀態(tài)CO2的高擴(kuò)散系數(shù)，提取出更多的有效成分，常溫常壓下CO2易揮發(fā)，減少提取溶劑在提取物中的殘留[50]。適合提取小極性物質(zhì)、揮發(fā)油等。但是有成本高、操作復(fù)雜的問題。

黃酮（醇）苷和黃酮（醇）苷元兩類物質(zhì)性質(zhì)較為相近，主要有抗炎和抗氧化的活性。黃酮苷和黃酮苷元在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別，導(dǎo)致的在體內(nèi)代謝過、吸收過程會有不同。醇提物和CO2超臨界萃取物中也含有部分有異戊烯基結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，異戊烯基黃酮擁有廣泛的生物活性，主要有抗炎和免疫調(diào)節(jié)、心血管保護(hù)、抗氧化、抗腫瘤、抗衰老及生殖作用等藥理活性?？梢試L試調(diào)整方法，針對性地對甘草地上部分中更小極性部位進(jìn)行富集，或者進(jìn)一步的開發(fā)。本實(shí)驗(yàn)中的提取方法及結(jié)果可以為進(jìn)一步的藥效研究提供依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)主要使用了文獻(xiàn)對比分析的方法進(jìn)行物質(zhì)鑒別，對于部分同分異構(gòu)體的鑒定可能不夠準(zhǔn)確。因此，在下一步的研究中，將通過分離純化方法獲得單體，或者購買相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品，再使用HPLC技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證。藥理活性部分僅進(jìn)行了文獻(xiàn)整理，更多物質(zhì)的更多藥理活性還有待探索發(fā)現(xiàn)。