周慧，雷玉華，張復(fù)貴，楊淑蓉，華曉芳，黃晶

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病又稱為冠心病，是一種缺血性心臟病[1-4]。近年來(lái)隨著社會(huì)的發(fā)展及人口老齡化的加重，導(dǎo)致冠心病的發(fā)生率逐年上升，冠心病的出現(xiàn)嚴(yán)重影響患者的身心健康[5]。動(dòng)脈粥樣硬化是冠心病發(fā)病的主要病理基礎(chǔ)，作為一種復(fù)雜的炎性反應(yīng)病變，其動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙會(huì)促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，進(jìn)而導(dǎo)致冠心病的發(fā)生[6-7]。兒茶素是一種多種酚類天然非酶抗氧化劑，具有較好的保健效果[8]?，F(xiàn)以兒茶素干預(yù)老年冠心病大鼠，探究?jī)翰杷鼗贛EK/ERK信號(hào)通路對(duì)老年冠心病大鼠內(nèi)皮功能的作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)動(dòng)物： SD健康大鼠50只，由華蘭生物工程股份有限公司提供，9～14(11.5±2.0)月齡；體質(zhì)量230～260(245.3±11.7)g；于45%～55%濕度，常溫，12 h光照環(huán)境下喂養(yǎng)1周。(2)藥物、試劑：兔抗小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6抗體(Invitrogen公司)，大鼠抗小鼠Hcy抗體(BD公司)，小鼠抗大鼠TNF-α抗體(Hyclone公司)，兔抗大鼠NO、eNOS抗體(Sigma公司)，大鼠抗小鼠ET-1、ADMA抗體(Selleck公司)，小鼠抗兔MEK、ERK抗體(Dako公司)。(3)儀器設(shè)備：顯微鏡(蘇州工業(yè)園區(qū)匯光科技有限公司，型號(hào) SZNTR) 、光探測(cè)器(德國(guó)ALPHALAS公司，型號(hào) SPCM)、水浴箱(上海赫田科技儀器有限公司，型號(hào) HH-501S)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 2020年1—11月于湖北恩施州中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。50只大鼠中隨機(jī)取10只為對(duì)照組，不做干預(yù)；其余40只大鼠建立冠心病模型：給予高脂、高甲硫氨酸飼料(由0.2%丙硫氧嘧啶、0.5%膽酸鈉、2%膽固醇、10%豬油、3%甲硫氨酸、87.3%基礎(chǔ)飼料混合而成)連續(xù)喂養(yǎng)6周，間隔2周給予大鼠腹腔注射垂體后葉素30 μg/kg，每日1次，連續(xù)3 d，記錄末次注射后30 min內(nèi)的心電圖，如若滿足T波高聳、ST段抬高超過(guò)0.1 mV、心律不齊，則視為造模成功。建模中死亡2只，造模成功38只，隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組10只(繼續(xù)高脂喂食)及小劑量組10只、中劑量組9只、高劑量組9只，分別給予兒茶素20、40、60 mg/kg，3組大鼠藥物均灌胃給藥，連續(xù)給藥1周。

1.3 觀察指標(biāo)與方法

1.3.1 觀察大鼠冠狀動(dòng)脈病變情況：大鼠建模成功后喂養(yǎng)1周，麻醉處死大鼠，取出心臟，收集心肌組織，使用生理鹽水沖洗干凈后進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋切片，首先將切片烤干，進(jìn)行脫蠟處理，順序置入不同濃度酒精中各復(fù)水3 min；然后使用蘇木精染色15 min，之后進(jìn)行多次清洗(最少3次)。清洗后使用鹽酸酒精分化處理30 s，再以1%伊紅染色，使用酒精進(jìn)行脫水處理后進(jìn)行脫蠟處理，封片后顯微鏡觀察大鼠冠狀動(dòng)脈病變。

1.3.2 血清Hcy、TNF-α、IL-1β、IL-6水平檢測(cè)：腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠之后，打開腹腔，暴露腹主動(dòng)脈，采血5 ml離心分離得血清，放置在-20℃環(huán)境下保存待用。使用散射比濁法檢測(cè)，在光探測(cè)器90°的單色光源中對(duì)樣品加入凝血激活劑，隨著樣品凝塊的發(fā)生，其散射光強(qiáng)度會(huì)隨之增加，當(dāng)血清樣本完全凝固之后，其光照探測(cè)儀會(huì)隨之發(fā)生改變，隨后將血清樣本放置檢測(cè)器上進(jìn)行處理并描繪出凝固曲線，按照凝固曲線對(duì)Hcy、TNF-α、IL-1β、IL-6水平進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.3.3 血清NO、eNOS、ET-1、ADMA水平檢測(cè)。使用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)：設(shè)置10個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔，在10 μl待測(cè)樣品中加入40 μl樣本稀釋液，封板膜封板，置于37℃水浴箱溫育30 min，清洗反應(yīng)板5次后拍干，每次間隔30 s，在除空白孔以外的各孔中加入酶標(biāo)液50 μl，封膜溫育30 min，清洗反應(yīng)板5次后拍干，每次間隔30 s，在各孔中加入顯色A液、B液各50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光環(huán)境下顯色15 min，在反應(yīng)孔內(nèi)加入終止液50 μl/孔以終止反應(yīng)，于450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量每孔吸光度，檢測(cè)NO、eNOS、ET-1、ADMA水平。

1.3.4 心肌MEK、ERK蛋白表達(dá)檢測(cè)：使用Western-blot法檢測(cè)MEK、ERK表達(dá)，使用PBS緩沖液對(duì)標(biāo)本進(jìn)行沖洗，沖洗后對(duì)標(biāo)本進(jìn)行裂解30 min，裂解之后對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。隨后取20 μg/孔蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳，加入蛋白緩沖液緩沖10 min，隨后電轉(zhuǎn)膜放置到濃度為10%牛奶中進(jìn)行浸泡，在常溫下封閉孵育1 d。次日取出用TBST液進(jìn)行沖洗，隨后結(jié)合二抗。1 h后進(jìn)行清洗、顯色，對(duì)MEK、ERK蛋白表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠冠狀動(dòng)脈病變特點(diǎn)比較 對(duì)照組大鼠冠狀動(dòng)脈結(jié)構(gòu)正常，內(nèi)皮完整，層次較為清晰；模型組大鼠冠狀動(dòng)脈出現(xiàn)中小分支，鏡下可見管壁增厚，內(nèi)皮下可見泡沫細(xì)胞，粉染蛋白沉積，內(nèi)膜斑塊較大；小劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠冠狀動(dòng)脈逐漸出現(xiàn)好轉(zhuǎn)，血管內(nèi)皮管壁減薄，內(nèi)膜斑塊較小，見圖1。

2.2 各組大鼠血清Hcy、血管內(nèi)膜厚度比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清Hcy、血管內(nèi)膜厚度上升(P<0.05)；與模型組比較，小、中、高劑量組大鼠Hcy、血管內(nèi)膜厚度依次下降(P均<0.05)，見表1。

2.3 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平上升(P<0.05)；與模型組比較，小、中、高劑量組大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6水平依次下降(P均<0.05)，見表2。

表1 各組大鼠血清Hcy、血管內(nèi)膜厚度比較

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較

2.4 各組大鼠血清NO、eNOS、ET-1、ADMA水平比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠NO、eNOS水平下降，ET-1、ADMA水平上升(P<0.05)；與模型組比較，小、中、高劑量組大鼠NO、eNOS水平依次上升,ET-1、ADMA水平依次下降 (P均<0.05)，見表3。

2.5 各組大鼠心肌MEK、ERK蛋白表達(dá)比較 與對(duì)照組比較，模型組大鼠MEK、ERK蛋白表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，小、中、高劑量組大鼠MEK、ERK蛋白表達(dá)依次下降(P均<0.05)，見表4、圖2。

表4 各組大鼠MEK、ERK蛋白表達(dá)比較

圖1 各組大鼠冠狀動(dòng)脈變化特點(diǎn)(HE染色，×400)

表3 各組大鼠NO、eNOS、ET-1、ADMA水平比較

圖2 各組大鼠MEK、ERK蛋白表達(dá)Western blot圖

3 討 論

冠心病多發(fā)病于40歲以上成年人，是臨床常見和多發(fā)的心血管疾病之一[9-10]。大量臨床研究顯示，其血管內(nèi)皮損傷及功能失調(diào)是引發(fā)心血管疾病的起始事件。血管內(nèi)皮細(xì)胞協(xié)調(diào)血管舒張因子及收縮因子共同調(diào)節(jié)血管的舒張狀態(tài)[11]。茶葉中有效成分主要有多酚化合物、生物堿、多糖類等。茶多酚中主要的成分是以兒茶素為主的黃烷醇類。兒茶素在很多植物中存在，其中包括葡萄、蘋果及茶葉等[12-13]。兒茶素具有廣泛的生物活性，其高效清除自由基及抗氧化對(duì)人體的多種病癥預(yù)防和治療均有較大的作用，具有高效低毒的特點(diǎn)，是一種較為理想的天然藥物[14-15]。

Hcy為同型半胱氨酸，是機(jī)體內(nèi)含硫氨基酸的一個(gè)重要的代謝中間產(chǎn)物，可能是動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)病的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因子[16-17]。大量臨床研究顯示，Hcy與冠心病的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)聯(lián)，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)能夠?qū)谛牟〉陌l(fā)生發(fā)展進(jìn)行較為準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。本研究發(fā)現(xiàn)，老年冠心病模型大鼠Hcy水平升高，對(duì)其使用兒茶素進(jìn)行干預(yù)，能夠調(diào)節(jié)大鼠Hcy水平，起到較好的干預(yù)效果。

大量臨床研究顯示，冠心病的發(fā)生發(fā)展與內(nèi)皮功能有著密切的關(guān)聯(lián)，NO、eNOS、ET-1、ADMA是臨床檢測(cè)內(nèi)皮功能常用的因子，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)能夠?qū)?nèi)皮功能進(jìn)行較為準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)[18-20]。宋昆鵬等[21]研究發(fā)現(xiàn)，冠心病模型大鼠血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)NO、eNOS水平下降，ET-1、ADMA水平上升，對(duì)其進(jìn)行有效的干預(yù)，大鼠血管內(nèi)皮有所改善。本研究發(fā)現(xiàn)，冠心病模型大鼠血管內(nèi)皮功能相關(guān)指標(biāo)NO、eNOS水平下降，ET-1、ADMA水平上升，與上述一致，對(duì)其使用兒茶素進(jìn)行干預(yù)后，大鼠NO、eNOS水平上升，ET-1、ADMA水平下降，且大劑量組效果最好。說(shuō)明使用兒茶素基于MEK/ERK信號(hào)通路對(duì)老年冠心病大鼠進(jìn)行干預(yù)，其能夠改善老年冠心病大鼠血管內(nèi)皮功能，具有較好的效果。

冠心病的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體炎性反應(yīng)有著密切的關(guān)聯(lián)，TNF-α、IL-1β、IL-6是臨床檢測(cè)炎性反應(yīng)水平的常用指標(biāo)，對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)能夠?qū)C(jī)體炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行較為準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)[22-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，老年冠心病大鼠炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平上升，對(duì)其使用兒茶素進(jìn)行干預(yù)，老年冠心病大鼠炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6下降，說(shuō)明使用兒茶素基于MEK/ERK信號(hào)通路對(duì)老年冠心病大鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠抑制大鼠體內(nèi)炎性因子，具有較好的效果。

ERK是MAPK家族中重要的成員之一，而MEK/ERK信號(hào)通路是多種細(xì)胞因子調(diào)控細(xì)胞凋亡和增殖的關(guān)鍵。其中ERK能夠被上游分子MEK的磷酸化激活，從而進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化及增殖[24]。大量臨床研究顯示，在心肌細(xì)胞損傷時(shí)，MEK/ERK信號(hào)通路能夠被激活，從而調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖及凋亡。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用兒茶素基于MEK/ERK信號(hào)通路對(duì)老年冠心病大鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠調(diào)節(jié)MEK/ERK信號(hào)通路，從而起到治療的效果。

綜上所述，使用兒茶素對(duì)老年冠心病大鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠改善大鼠血管內(nèi)皮功能，調(diào)節(jié)MEK/ERK信號(hào)通路，抑制大鼠機(jī)體炎性因子，從而起到治療的效果，具有較好的臨床推廣意義。

利益沖突：所有作者聲明無(wú)利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

周慧、雷玉華：設(shè)計(jì)研究方案，實(shí)施研究過(guò)程，論文撰寫，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；張復(fù)貴、華曉芳：提出研究思路，分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)，論文審核;楊淑蓉：課題設(shè)計(jì)，論文撰寫；黃晶：實(shí)施研究過(guò)程，資料搜集整理，論文修改