陳瑤，楊仁義，傅馨瑩，周德生，宋洋

1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007；2.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410208

阿爾茨海默?。╝lzheimer disease，AD）是一種以記憶力下降、行為改變及認知功能障礙為主要表現(xiàn)的中樞神經退行性疾病。我國AD患者600萬～800萬，呈上升趨勢，預計2040年將成為世界第一大發(fā)病國［1］。AD的防治是當前亟待解決的社會問題，但是其發(fā)病機制及藥物治療仍是醫(yī)學的重大難題。自噬作為細胞程序性死亡方式之一，能通過清除受損細胞器、錯誤蛋白質，同時回收必要氨基酸等物質調節(jié)機體細胞穩(wěn)態(tài)，在神經細胞衰老中發(fā)揮重要作用。

中醫(yī)將AD歸屬于“癡呆”“神呆”等范疇，病機與五臟虛弱，腦髓生成乏源或腦絡不通，腦髓不純有關，腦氣凝滯皆由氣血不暢所致，腦與臟腑之氣不接，腦中氣血虧虛或不通是癡呆的關鍵病機。筆者根據(jù)癡呆病因病機，結合多年臨床經驗認為癡呆病機屬榮氣虛滯范疇。榮氣虛，腦脈失養(yǎng)，生髓乏源；又榮氣滯，痰濁瘀血內生，相互搏結，蒙蔽清竅，腦髓不純，二者消長失衡致神機失用，發(fā)為呆病。以“陰虛血瘀-榮氣虛滯”理論立方的活血榮絡方，由雞血藤30 g，黃精15 g，乳香10 g，川芎10 g，石楠藤30 g，生地黃15 g，沒藥10 g組成。活血榮絡方中雞血藤、石楠藤共為君，補血活血以通經活絡；黃精、生地黃共為臣，補血滋陰以補髓填精，調氣機以助雞血藤、石楠藤補血活血，補真陰以滋腦髓空虛；乳香、沒藥共為佐，通經活絡兼以化瘀止血，助雞血藤、石楠藤之活血之功，以暢氣機；川芎為使，味薄而氣芳，升達頭目，透暢巔頂，多竅而質不堅，可貫脈透表，內外肢節(jié)，攜諸藥直達病灶。諸藥合用，共奏滋陰活血、通經活絡之功，對癡呆陰虛血瘀證頗為有效。本研究為進一步揭示活血榮絡方治療癡呆的分子機制，采用生物信息學聯(lián)合網(wǎng)絡藥理學方法，從分子網(wǎng)絡角度對活血榮絡方進行多成分、多靶點分析，并探討其通過自噬治療AD的分子機制，為活血榮絡方治療AD提供理論基礎。

1 資料與方法

1.1 活血榮絡方有效活性化合物的篩選采用TCMSP［2］（http：／／lsp.nwu.edu.cn／tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫，以OB≥30%，DL≥0.18%，BBB≥-0.3為篩選條件［3］，獲取活血榮絡方君藥雞血藤，臣藥黃精，佐藥乳香，使藥川芎的有效活性化合物。

1.2 活血榮絡方靶點與“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點的獲取通過PubChem［4］（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）與 Chemspider［5］（http：／／www.chemspider.com／）數(shù)據(jù)庫，獲取活血榮絡方有效活性化合物3D結構式，并導入Swiss Target Prediction［6］（http：／／www.swisstargetprediction.ch／）數(shù)據(jù)庫，以獲取活血榮絡方靶點。

通過GeneCards（https：／／www.genecards.org／）數(shù)據(jù)庫，以“Alzheimer Disease”和“Autophagy”為檢索詞，以Score值≥10為限定條件篩選疾病作用靶點［7］，以獲取AD和自噬的作用靶點。

取“活血榮絡方靶點”“AD靶點”與“自噬靶點”的交集，并通過Bioinformatics（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）實驗室的“韋恩圖”工具，繪制韋恩圖。

1.3 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點PPI網(wǎng)絡構建通過String［8］（https：／／string-db.org／）數(shù)據(jù)庫，設定最低要求互動分數(shù)為中度信度0.400［9］，導入“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點，以獲取蛋白互作（PPI）信息。采用Cytoscape 3.7.2中Network analyzer功能分析PPI信息，計算Degree值及可視化，同時結合WebGestalt［10］軟件計算“隨機游走概率”。

1.4 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點GO和KEGG富集分析通過WebGestalt［10］（http：／／www.webgestalt.org／＃）數(shù)據(jù)庫，采用“ORA”算法，導入“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點，獲取GO（BP、CC、MF）和KEGG富集分析數(shù)據(jù)，進行“加權集合覆蓋”分析，并繪制火山圖。

1.5 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點miRNA預測及網(wǎng)絡分析通過TargetScan［11］（http：／／www.targetscan.org／mamm_31／）數(shù)據(jù)庫，導入“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點，以獲取其反向預測的miRNA，利用Cytoscape 3.7.2軟件將mRNA-miRNA互作關系可視化。

利用WebGestalt（http：／／www.webgestalt.org／＃）數(shù)據(jù)庫，導入“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點，進行反向miRNA預測，基本參數(shù)設定同1.4項下，進行“Network-miRNA”預測和加權集合覆蓋分析，將兩個數(shù)據(jù)庫篩選并收集的miRNA整合分析。

2 結果

2.1 活血榮絡方有效活性化合物的篩選采用TCMSP數(shù)據(jù)庫獲取422個活血榮絡方活性化合物，君藥雞血藤68個；臣藥黃精38個；佐藥乳香127個；使藥川芎189個，篩選后獲得活血榮絡方中雞血藤14個、黃精7個、乳香8個、川芎6個有效活性化合物。見表1。

2.2 活血榮絡方靶點與“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點通過Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫對活血榮絡方有效活性化合物靶點進行預測，得到雞血藤303個靶點，黃精240個靶點，乳香171個靶點，川芎314個靶點，去除重復值保留唯一值，獲取567個活血榮絡方靶點。

通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取AD靶點，以Score值≥10為限定條件進行初步篩選，共得到286個AD靶點；通過GeneCards數(shù)據(jù)庫獲取自噬靶點，共得到4 715個自噬靶點。

利用Bioinformatics取交集獲得“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點36個，得到韋恩圖見圖1，共同分子靶點見表2。

表1 活血榮絡方中活性化合物基本信息

2.3 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點PPI網(wǎng)絡構建采用String數(shù)據(jù)庫及Cytoscape軟件對“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點進行PPI網(wǎng)絡分析，得出PPI網(wǎng)絡圖。設定20≤Degree＜30為紅色；15≤Degree＜20為黃色；10≤Degree＜15為藍色；1≤Degree＜10為粉紅色，Degree值越大，節(jié)點越大，見圖2，靶點蛋白隨機游走概率見表3。

圖1 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點韋恩圖

該網(wǎng)絡圖中有36個靶點，包含36個節(jié)點，245條邊，平均聚類系數(shù)為0.676，其中包括APP（Degree＝29）、CASP3（Degree＝27）、MAPK3（Degree＝23）、TNF（Degree＝22）、MAPK8（Degree＝22）、IL6（Degree＝22）、CASP8（Degree＝21）、PSEN1（Degree＝21）、MAPK1（Degree＝21）等。結果表明，活血榮絡方可能通過多個作用靶點在阿爾茨海默病自噬機制中發(fā)揮作用。

圖2 “活血榮絡方-AD-自噬”共同靶點蛋白PPI網(wǎng)絡圖

表2 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點

表3 共同靶點隨機游走概率分析

2.4 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點GO和KEGG富集分析“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點GO分析，共富集出10個生物進程（BP），結合“P-Value”值，加權集合覆蓋后獲得5個最相關生物過程，依次為突觸信號轉導的調控、肽絲氨酸修飾、對氧化應激的反應、對細菌起源分子的反應、積極調控蛋白水解。根據(jù)“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖3-BP。

“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點GO分析，共富集出29個細胞組分（CC），結合“P-Value”值，加權集合覆蓋后獲得7個最相關細胞組分，依次為膜區(qū)、神經細胞體、軸突部分、突觸前、包涵體、去極化增長點、神經脊柱。根據(jù)“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖3-CC。

“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點GO分析，共富集出16個分子功能（MF），結合“P-Value”值，加權集合覆蓋后獲得9個最相關分子功能，依次為內肽酶活性、天冬氨酸肽酶活性、半胱氨酸型肽酶活性、蛋白質絲氨酸／蘇氨酸／酪氨酸激酶活性、蛋白質絲氨酸／蘇氨酸激酶活性、生長因子受體結合、細胞因子受體結合、tau蛋白結合、蛋白質自締合。根據(jù)“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖3-MF。

“活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點KEGG分析，共富集出9 696條信號通路，結合“P-Value”值，依次為老年癡呆癥、細胞凋亡、IL-17信號通路、TNF信號通路、百日咳、非酒精性脂肪肝病、C型凝集素受體信號通路、結核、卡波西氏肉瘤相關皰疹病毒感染、軍團菌病。根據(jù)“Ratio”“P-Value”“FDR”值繪制火山圖如圖4。

2.5 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點miRNA預測及網(wǎng)絡分析TargetScan數(shù)據(jù)庫中反向預測出共同靶點782個miRNA-mRNA相互作用，在Cytoscape軟件中將共同靶點的mRNA設置為“三角形”“紅色”；將反向預測的miRNA設置為“圓形”“淡黃色”，可視化如圖5。

圖3 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點GO富集分析BP、CC、MF火山圖

圖4 “活血榮絡方-AD-自噬”共同分子靶點KEGG富集分析火山圖

圖5 “活血榮絡方-AD-自噬”共同靶點mRNA-miRNA相互作用預測關系

WebGestalt數(shù)據(jù)庫反向預測miRNA，所有共同靶點mRNA富集在88個miRNA中，加權集合覆蓋分析后得出10個最相關miRNA，得出“Expect”“Ratio”“P-Value”值，具體見表4。

表4 mRNA-miRNA預測及加權集合覆蓋分析后結果

整合兩個數(shù)據(jù)庫，明確共同靶點miRNA-mRNA最可能預測關系，即miR-302A-GSK3B；miR-513-ACHE／DRD3／NTRK2；miR -193A／miR -193B-PLAU；miR-217-MAPK1；miR-18AMAPT；miR-200A／miR-141-DRD2／PSEN1／TTR；miR-101-DYRK1A／PTGS2；miR-153-SNCA；miR-520G／miR-520H-DYRK1A；miR-506-CAPN1／ERN1／PSEN1。

3 討論

《素問·痹論》云：“榮者，水谷之精氣也，和調于五臟，灑陳于六腑，乃能入于脈也，故循脈上下，貫五臟，絡六腑也?！睒s者，滋人體，養(yǎng)神色，主生化也［12］；榮氣者，精微物質之總稱也，屬陰中之陰［13］，“陽化氣，陰化形”，人體形態(tài)結構、功能代謝及精神意識皆由榮氣所化生。榮氣為《黃帝內經》中“物質、功能、轉化”之氣［14］，能滋形骸，榮腦髓，其氣化流通得暢，則神機守，神氣顯，陰平陽秘，氣血暢達。故榮氣足則五臟俱榮，化髓有源，神機得守，則腦髓得以用，精神佳，記憶強。榮氣異常表現(xiàn)為榮氣虛、榮氣滯［15］，二者同時共存，相互影響轉化，榮氣虛滯則機體榮養(yǎng)與生發(fā)功能障礙。腦為“髓?！薄捌婧阒保啬X髓，傳神機，為元神之府，為五臟六腑精、氣、神匯聚之所。榮氣虛滯則腦髓失養(yǎng)，神機失用，五神失職，則靈機退失，發(fā)為癡呆，故榮氣虛滯是癡呆的基本病機。活血榮絡法以滋陰活血為主，滋陰基礎上結合臟腑病位聯(lián)合補氣、補血、補精等，活血基礎上配伍理氣、化痰、清熱、瀉實等，佐以開竅。

生物信息學是生物醫(yī)學與計算機科學的綜合體，利用數(shù)學分析方法，已成為系統(tǒng)生命學的重要組成部分［16］。通過分子網(wǎng)絡數(shù)據(jù)挖掘方法分析DNA、RNA、蛋白質等生物分子以網(wǎng)絡整體調控模式參與機體的生命過程?！氨孀C論治”“整體觀念”是中醫(yī)學基本特色，網(wǎng)絡藥理學、分子網(wǎng)絡數(shù)據(jù)挖掘等生命信息學從系統(tǒng)整體對藥物、疾病、機制進行科學認識，兩者具有高度契合度。本研究采用生物信息學方法，挖掘活血榮絡方活性成分、篩選分析“活血榮絡方-AD-自噬”共同靶點，從分子、基因角度研究活血榮絡方通過自噬治療AD的作用機制。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法，得到活血榮絡方有效活性化合物中，雞血藤14個、黃精7個、乳香8個、川芎6個，共預測出567個活血榮絡方靶點，提示活血榮絡方的治療作用與其有效活性化合物整體協(xié)同調節(jié)567個靶點有關。進一步挖掘“疾病-表型”，即“AD-自噬”的靶點，采用韋恩圖交集分析“活血榮絡方-AD-自噬”共同靶點36個。前期研究結果證實活血榮絡方治療AD主要與上調Wnt5α、Fz5、Ca MKII、AchE、ChAT等靶點有關［17-18］，與本研究網(wǎng)絡藥理學方法挖掘出的靶點有高度重合，提示活血榮絡方可能多靶點調節(jié)自噬在治療AD中發(fā)揮的作用。

PPI網(wǎng)絡結果表明，“藥物-疾病-表型”共同靶點具有整體復雜的網(wǎng)絡相互作用關系?；钛獦s絡方主要通過炎癥因子、腫瘤壞死因子、細胞程序性死亡因子等多種分子相互作用調節(jié)自噬治療AD。GO、KEGG富集結果表明，活血榮絡方能多靶點、多結構、多形式地參與生物進程，預測得出在膜區(qū)、神經細胞體、軸突部分等細胞成分中，活血榮絡方通過AD信號通路、細胞凋亡、IL-17信號通路、TNF信號通路調控內肽酶、天冬氨酸肽酶、半胱氨酸型肽酶等活性，影響突觸信號轉導等生命過程?！盎钛獦s絡方-AD-自噬”共同分子靶點反向預測miRNA并加權覆蓋集合分析結果表明，多個miRNA參與此過程，整合PPI、GO、KEGG數(shù)據(jù)，推測活血榮絡方調節(jié)自噬治療AD中miRNA-531、miRNA-217、miRNA-200A等靶向結合共同靶點mRNA抑制其翻譯過程。AD主要病理變化是機體β-淀粉前體蛋白β樣蛋白在胞外沉積，從而形成老年斑。APP是跨膜蛋白，能被β-分泌酶、APP切割酶、γ-分泌酶切割形成Aβ，APP／Aβ失衡能使機體內自噬體中Aβ沉積［19］，因此自噬在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。同時研究發(fā)現(xiàn)自噬下調會導致APP及γ-分泌酶異常表達，產生毒性Aβ致AD疾病發(fā)展［20］。CASP3、CASP8、MAPK3、MAPK8、MAPK1是細胞凋亡通路關鍵分子，TNF、IL6是炎癥相關通路（IL-17信號通路、TNF信號通路）關鍵分子。大量研究發(fā)現(xiàn)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶家族基因可在AD中過表達，如Ayala-Grosso等［21］采用波譜蛋白共定位法證明CASP3在AD患者大腦中表達上調，且Fricker［22］證實其能進一步促進IL-1、IL-1β、TNFα和NO的產生，導致APP基因裂解的Aβ和tau過度磷酸化，從而誘導老年斑形成和神經元程序性死亡?；谇捌趫F隊研究成果并結合PPI、GO、KEGG富集分析得出，活血榮絡方可能通過多靶點、多途徑、多通路，以網(wǎng)絡化形式影響多種機制，從而調節(jié)自噬治療阿爾茨海默病，其中主要通過調控AD信號通路中APP與PSEN1分子表達，并協(xié)同調控凋亡和炎癥反應通路相關分子表達，影響自噬途徑治療AD。

miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的長度約為22個nt的非編碼RNA，一般認為成熟miRNA 5′端的2～8位核苷酸序列為種子序列，是miRNA與靶基因mRNA特異性結合的區(qū)域。在哺乳動物中，miRNA形成后主要通過與目的基因mRNA3′UTR（非翻譯區(qū)）形成不完全互補配對，阻斷目的基因表達，從而調控哺乳動物1／3的mRNA表達，參與多種生物學過程，被認為具有極其重要的功能［23］。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-96能調節(jié)mTOR，在血管性癡呆自噬中起關鍵作用［24］；miRNA-214-3p作為新的神經保護因子在AD中能抑制自噬并減輕神經元 凋 亡［25］；Chen等［26］最 新 研 究 發(fā) 現(xiàn) 上 調miRNA-34a能介導SIRT1／mTOR信號通路預防阿爾茨海默病，整合TargetScan、WebGestalt數(shù)據(jù)庫，利用加權集合覆蓋分析，得出miR-302A、miR-513、miR-193是最可能參與活血榮絡方調控自噬治療AD的潛在miRNA。Kong等［27］采用μParafloTMmiRNA微陣列分析得出miRNA-193在果蠅AD模型中異常表達，但是其余miRNA尚未在AD疾病中報道，所以篩選出的miRNA是否在活血榮絡方調控自噬治療AD中發(fā)揮作用，需要后期進一步實驗驗證。

綜上所述，活血榮絡方可能調節(jié)自噬治療AD，其分子機制主要與活血榮絡方中的β-谷甾醇、芒柄花黃素、豆甾醇等多種有效活性成分，協(xié)同調節(jié)APP、SNCA、PTGS2等多靶點與多miRNA，通過發(fā)揮內肽酶活性、天冬氨酸肽酶活性、半胱氨酸型肽酶活性等多分子功能，在膜區(qū)、神經細胞體、軸突部分等多細胞組分中，參與突觸信號轉導的調控、肽絲氨酸修飾、對氧化應激的反應等多生命進程，激活老年癡呆癥、細胞凋亡、IL-17信號通路等多通路有關，為進一步研究及開發(fā)活血榮絡方提供理論依據(jù)。