王琳玲，孫曉靜，孫治中，雷旭杰，劉曉玲

1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州510405

強直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是臨床表現(xiàn)出脊柱關(guān)節(jié)疼痛、活動障礙、強直甚至出現(xiàn)畸形的，主要以侵犯骶髂關(guān)節(jié)、外周關(guān)節(jié)及脊柱（如脊柱骨突、脊柱旁軟組織）的自身免疫性疾?。?］。AS典型的病理改變?yōu)檠装Y、骨質(zhì)破壞和新骨的形成［2］。全球約0.1%～0.5%的人口受此病困擾［3］，在我國發(fā)病率約0.3%，男女的患病比例大約為3∶1，其中以青壯年男性居多［4］。AS目前主要的治療手段是消炎鎮(zhèn)痛、防止骨破壞減少及新骨形成，以達(dá)到延緩及控制病情發(fā)展的效果。與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相比，傳統(tǒng)中醫(yī)藥在AS的治療中具有獨特的優(yōu)勢，在辨證的基礎(chǔ)上遣方用藥可有效緩解疾病帶來的臨床癥狀，控制病情進(jìn)展。獨活是常用治療AS的中藥之一，具有祛風(fēng)濕、散寒邪、止痹痛之效，目前針對獨活的研究尚局限于獨活寄生湯等方劑的應(yīng)用，尚無具體的單一藥物報道，其藥理機制還有待進(jìn)一步挖掘分析。依托生物信息學(xué)、多向藥理學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過與之相關(guān)的成分、靶點及通路更加系統(tǒng)地、全面地探討中藥及方劑對相關(guān)疾病作用機制［5-7］。本研究結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)理論，分析預(yù)測獨活治療AS的靶點及相關(guān)通路，探析獨活治療AS的作用機制。

1 方法

1.1 活性成分獲取將“獨活”為搜索詞，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)技術(shù)平臺檢索獨活的化學(xué)成分，活性成分篩選條件設(shè)置為類藥性（Drug-like，DL）≥0.18、生物利用度（bioavailability，OB）≥30%，以此挑選出獨活的活性成分，并獲取其2D結(jié)構(gòu)。

1.2 獨活相關(guān)靶點預(yù)測在Pubchem搜索選出獨活的活性成分，獲析相應(yīng)的2D結(jié)構(gòu)。將獲得的2D結(jié)構(gòu)上傳到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫。根據(jù)反向分子對接原理結(jié)合獨活成分的2D／3D結(jié)構(gòu)預(yù)測出獨活的作用靶點。

1.3 AS相關(guān)靶點的獲取及與獨活預(yù)測靶點的映射在Gene Cards數(shù)據(jù)庫中搜索“Ankylosing spondylitis（強直性脊柱炎）”，得到AS的相關(guān)靶點。將所得到的獨活預(yù)測靶點和AS的相關(guān)靶點相互映射以此得到獨活治療AS的預(yù)測靶點。

1.4 獨活治療AS的蛋白與蛋白相互作用（Proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建在String數(shù)據(jù)庫中，物種設(shè)置為“Homo snpiens”，得到的蛋白-蛋白作用關(guān)系導(dǎo)進(jìn)Cytoscape（3.6.0）軟件，獲得背景網(wǎng)絡(luò)。結(jié)合獨活作用在AS的靶點，構(gòu)建出獨活治療AS的蛋白與蛋白相互作用（Protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 Hub網(wǎng)絡(luò)的提取在Cytoscape軟件中以“節(jié)點連接度”的二倍中位數(shù)和“節(jié)點介度”以及“節(jié)點緊密度”的中位數(shù)為篩選條件，施行“Network Analyzer-Network Analysis-Analyze Network”，以此構(gòu)建出Hub網(wǎng)絡(luò)。

1.6 GO富集分析與KEGG通路分析在Cytoscape中將上述Hub網(wǎng)絡(luò)中的靶標(biāo)進(jìn)行GO（基因本體，Gene ontology）富集分析。在DAVID平臺上選出結(jié)果，并進(jìn)行京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析得到通路（顯著富集，P＜0.01）。gene數(shù)按照從大到小進(jìn)行排序，根據(jù)文獻(xiàn)報道搜索結(jié)果分析，選出獨活治療AS相關(guān)性大的信號通路，找到相關(guān)的靶標(biāo)，結(jié)合獨活的活性成分，以此建立“獨活的活性成分-強直性脊柱炎靶標(biāo)-KEGG通路”的相關(guān)網(wǎng)絡(luò)圖。將gene數(shù)排名前20的通路，在OmicShare平臺上繪制通路氣泡圖。

1.7 分子對接在Systems Dock網(wǎng)站上分子對接Degree值排名前5位的預(yù)測靶標(biāo)與獨活的活性成分，根據(jù)其與原生配體的結(jié)合能力來評估靶標(biāo)與獨活活性成分的結(jié)合能力及其穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 獨活的活性成分活性成分篩選條件為內(nèi)服類藥性（DL）≥0.18、生物利用度（OB）≥30%，以此篩查出符合篩選條件的活性化合物共9種。見表1。

2.2 構(gòu)建獨活的預(yù)測靶點與活性成分-強直性脊柱炎靶點的網(wǎng)絡(luò)在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫中篩選出315個與上述9種符合條件的活性化合物對應(yīng)的靶點，161個活性成分2D／3D結(jié)構(gòu)相關(guān)的作用靶點。將靶點與GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索得到的3 872個AS相關(guān)靶點相映射，以此得到獨活可能與AS相關(guān)的靶點67個。

將上述結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，獲得獨活的活性成分-強直性脊柱炎靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖1）。此網(wǎng)絡(luò)圖中共包括76個節(jié)點，其中包括9個活性成分和67個靶點，145條邊。

2.3 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)將67個可能與強直性脊柱炎相關(guān)的獨活作用靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，用Cytoscape繪制獨活作用于強直性脊柱炎的PPI網(wǎng)絡(luò)（圖2）。此網(wǎng)絡(luò)中共包括76個節(jié)點，275條邊。

表1 獨活的活性化合物

圖1 獨活活性成分-AS靶點網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 獨活治療AS的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 Hub網(wǎng)絡(luò)的提取及Hub中的靶標(biāo)在Cytoscape選取度中心性的二倍中位數(shù)、接近中心性的中位數(shù)以及介度中心性做篩選依據(jù)，獲得獨活治療強直性脊柱炎的關(guān)鍵靶點，即Hub中的靶標(biāo)，繪制出Hub網(wǎng)絡(luò)（見圖3）。有26個關(guān)鍵靶點，分別為淋巴細(xì)胞毒素α（Lymphocyte Toxin Alpha，LTA）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、Dickkopf-1蛋白、白細(xì)胞介素23R單核苷酸多態(tài)性（Interleukin 23R single nucleotide polymorphism，IL-23R SNP）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨肽酶-1（Endoplasmic reticulum aminopeptidase-1，ERAP1）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氨肽酶-2（Endoplasmic reticulum aminopeptidase-2，ERAP2）、白細(xì)胞介素-1R（Interleukin-1R，IL-1R）、微小核糖核酸146a（Microribonucleic acid 146a，miR146a）、微小核糖核酸155（Microribonucleic acid 155，miR-155）、微小核糖核酸175p（Microribonucleic acid 175p，miR-17-5p）、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、基質(zhì)金屬蛋白酶-3（Matrix metalloproteinase-3，MMP-3）、硬化蛋白、β-連環(huán)蛋白（βcatenin）、膠原蛋白家族（Collagen家族）、人類白細(xì)胞抗原B27（HLA-B27）、腫瘤壞死因子受體超家族成員11A（Tumor Necrosis Factor Receptor Superfamily Member 11A，TNFRSF11A）、肝／腎／骨型堿性磷酸酶基因（Alkaline phosphatase gene，ALPL）、鈣調(diào)蛋白1基因（Calmodulin1，CALM1基因）和鈣調(diào)蛋白2基因（Calmodulin2，CALM2基因）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（Matrix metalloproteinase-2，MMP2）、CD4、βⅡ-血影蛋白、CA1（Cornu ammonis 1）。

圖3 獨活治療AS關(guān)鍵靶點Hub網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO富集分析用Cytoscape軟件進(jìn)行GO富集的BP分析（Biological Process），得到6個相關(guān)的功能組別（圖4）以及各自所占比例的餅狀圖（圖5）。這6個功能組別為：破骨細(xì)胞分化的調(diào)控；對抗原刺激的炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)；基于免疫球蛋白超家族結(jié)構(gòu)域構(gòu)建的免疫受體的體細(xì)胞重組，對適應(yīng)性免疫應(yīng)答進(jìn)行正向調(diào)控；發(fā)熱；細(xì)胞因子生物合成過程的調(diào)節(jié)控制；炎癥反應(yīng)的正調(diào)控。

2.6 KEGG通路分析分析得到97條KEGG通路，進(jìn)行文獻(xiàn)搜索，選出治療AS的可能通路共12條，得到通路氣泡圖（圖6），包括：免疫相關(guān)通路：Toll樣受體信號通路、NF-κB、NOD樣受體、腸道免疫、T細(xì)胞受體信號通路；炎癥相關(guān)通路有脂肪因子通路、JAK／STAT通路等；骨代謝相關(guān)通路有Wnt／β-catenin通路、TNF的通路、破骨細(xì)胞分化、類固醇激素的合成等；延緩纖維化相關(guān)通路包括：HIF-1α信號通路、HIF-2α信號通路等。

圖4 獨活治療AS可能通路GO富集分析功能組別圖

2.7 “成分-靶標(biāo)-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)圖找到上述獲得的相關(guān)通路的靶標(biāo)，聯(lián)合獲得獨活的9種活性成分，作出“獨活的活性成分-AS靶標(biāo)-KEGG通路”的網(wǎng)絡(luò)圖，見圖7。

圖5 GO富集分析功能組別占比餅圖

圖6 獨活治療AS通路氣泡圖

2.8 靶標(biāo)與活性成分的分子對接將Degree值排名前5位的相關(guān)預(yù)測靶標(biāo)與獨活的活性成分在systems Dock網(wǎng)站上進(jìn)行分子對接。用GraphPad Prism7.0軟件結(jié)合Docking Score值制作出熱圖（見圖8），如果值＞4.2，則分子與靶點有一定的結(jié)合活性；當(dāng)值＞5.0，表示有較好結(jié)合活性；＞7.0，表示有強烈的結(jié)合活性。根據(jù)圖8所示，所得值均大于4.2，表明獨活的活性成分與預(yù)測靶標(biāo)的結(jié)合具有一定的穩(wěn)定性。

圖7 “獨活的活性成分-AS靶標(biāo)-KEGG通路”網(wǎng)絡(luò)圖

圖8 預(yù)測靶標(biāo)與獨活活性成分分子對接熱圖

3 討論

《素問·痹論》中對AS描述：“風(fēng)寒濕三氣雜至……尻以代踵，脊以代頭”，是指AS患病后期脊柱關(guān)節(jié)屈曲畸形甚至殘疾的臨床特征。AS中醫(yī)又稱“腎痹”“大僂”等。獨活具有祛風(fēng)濕、散寒邪、止痹痛的功效，結(jié)合強直性脊柱炎的病因病機，辨證施藥，獨活組方對強直性脊柱炎具有良好的療效。

3.1 獨活治療AS的關(guān)鍵靶點預(yù)測結(jié)果表明，獨活治療AS的關(guān)鍵靶點有26個，具體為：LTA、TNF、DKK-1、IL-23R SNP、ERAP1及ERAP2、IL-1R、miR146A、miR-155、miR-17-5p、TLR4、MMP-3、SOST、β-catenin、HLA -B27、Collagen 家 族、TNFRSF11B、ALPL、CALM1基因及CALM2基因、MMP2、CD4、SPTBN1、CA1。

LTs（LTα、LTβ，The Lymphotoxinα／β）和LIGHT（LT相關(guān)可誘導(dǎo)配基，LT-related inducible ligand）、TNF共同組成信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)先天性和獲得性免疫應(yīng)答［8］。DKK-1蛋白參與韌帶骨贅生成以及全身炎癥反應(yīng)［9］。IL-23R SNP可能是通過影響細(xì)胞使IL-23／Th17免疫軸發(fā)生紊亂，導(dǎo)致AS患者產(chǎn)生慢性炎癥和組織受損、骨骼破壞［10］。ERAP1、ERAP2在T細(xì)胞介導(dǎo)的強直性脊柱炎中，對T細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能具有重要的作用［11］。IL-1R與免疫、炎癥有關(guān)，可促進(jìn)炎癥慢性化［12］。miR146A導(dǎo)致骨破壞，miR-155可以介導(dǎo)炎癥因子的合成、表達(dá)，并且能促使炎癥的產(chǎn)生及加劇［13］。上調(diào)miR-17-5p在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)后，促進(jìn)其骨分化［14］。

研究發(fā)現(xiàn)，TLR4在AS患者增厚的血管中層平滑肌細(xì)胞中、滑膜組織中均高表達(dá)［15］。有研究推測MMP-3發(fā)揮蛋白酶裂解的活性，能發(fā)揮促炎作用［16］。SOST的產(chǎn)生來源可能是AS發(fā)生骨化的初始。SOST的低水平表達(dá)與骨贅形成存在相關(guān)性［17］。HLA-B27陽性與AS的早發(fā)髖關(guān)節(jié)強直具有強相關(guān)性［18］，這可能與致病基因、細(xì)菌的免疫反應(yīng)、自身免疫性CTL克隆有關(guān)［19］。有研究證實Collagen家 族、TNFRSF11B、ALPL、CALM1、CALM2、MMP2、MMP3、CD4、SPTBN1、CA1等與關(guān)節(jié)的炎癥、骨化密切相關(guān)［20］。

3.2 獨活治療AS免疫相關(guān)通路獨活治療AS免疫相關(guān)通路：Toll樣受體信號通路（即Toll-like receptor signaling pathway）、NF-κB（即NF-kappa B signaling pathway）、NOD樣受體信號通路（即NODlike receptor signaling pathway）以及腸道免疫通路（即Intestinal immune network for IgA production）、T細(xì)胞受體信號通路（即T cell receptor signaling pathway）等。實驗研究證明，AS患者中高表達(dá)的TLR4［21］以及MyD88非依賴炎癥通路［15］可以激活NF-κB的表達(dá)，誘導(dǎo)產(chǎn)生腫瘤壞死因子。研究證明，NF-κB調(diào)節(jié)釋放IL-10等細(xì)胞因子，以此調(diào)節(jié)控制免疫反應(yīng)［22］。調(diào)控NF-κB如P65／P50的異源二聚體［23］，可以降低AS患者的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。NOD樣受體中的TLR2和TLR4參與AS的發(fā)?。?4］。有研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群、自身免疫以及Th17細(xì)胞（T helper 17）通過SAA（血清淀粉樣蛋白A，Serum amyloid A）產(chǎn)生相互影響，另外腸道菌群參與B細(xì)胞產(chǎn)生分泌IgA漿細(xì)胞，可以減少誘發(fā)炎癥的信號。研究表明AS疾病過程需要某些菌群誘導(dǎo)炎癥產(chǎn)生［25］。輔助性T細(xì)胞表面的PD-1表達(dá)的減少與AS的脊柱影像學(xué)變化有關(guān)［26］。

3.3 獨活治療AS相關(guān)通路獨活治療強直性脊柱炎炎癥相關(guān)通路有脂肪因子通路（即Adipocytokine signaling pathway）、JAK／STAT通路（即Jak-STAT signaling pathway）等。研究發(fā)現(xiàn)脂肪因子通路在風(fēng)濕免疫病中的抵抗素水平與炎癥相關(guān)標(biāo)志物有關(guān)［27］。JAK／STAT通路是強直性脊柱炎患者中重要的炎性通路，其異常的活化導(dǎo)致Th17的分化異常以及IL-17的產(chǎn)生異常，進(jìn)而引發(fā)炎癥［28］。

3.4 獨活治療AS骨代謝相關(guān)通路獨活治療強直性脊柱炎骨代謝相關(guān)通路有Wnt／β-catenin信號通路、TNF通路、破骨細(xì)胞分化（即Osteoclast differentiation）、類固醇激素的合成（即Steroid hormone biosynthesis）等。Wnt／β-catenin通路在維持骨穩(wěn)態(tài)過程中起著關(guān)鍵作用［29］。TNF可以通過誘導(dǎo)表達(dá)DKK1，作為Wnt信號通路的抑制劑，有效減少新骨形成［30］。在炎癥發(fā)生時，成骨基因如Ⅰ型和Ⅱ型膠原、骨連接蛋白、骨唾液蛋白等過度表達(dá)，最終導(dǎo)致大量的軟骨和骨基質(zhì)形成，而Wnt信號通路的抑制因子DKK1和SOST的表達(dá)則顯著下降，據(jù)此通過提高骨代謝中DKK1和SOST的表達(dá)，可以有效改善強直性脊柱炎的骨化形成，為新的治療方案提供思路和依據(jù)?！癟NF制動假說”認(rèn)為炎癥和骨形成不相關(guān)，可獨立激活炎癥和基質(zhì)細(xì)胞，基質(zhì)細(xì)胞的激活可以使新骨形成，還認(rèn)為炎癥的抑制甚至可能促進(jìn)骨形成。而TNF的增加可以使DKK1等因子表達(dá)，以此分解骨結(jié)構(gòu)，克服成骨分子的成骨作用［31］。破骨細(xì)胞（Osteoclasts）在破壞、丟失骨質(zhì)中產(chǎn)生作用。此外，AS患者滑膜中的TRAP+（抗酒石酸酸性磷酸酶染色，Tartrate resistant acid phosphatase stain）細(xì)胞破壞關(guān)節(jié)軟骨［32］。研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松可能與BMP-2及Wnt-β-catenin通路有關(guān)，一定濃度的地塞米松可以抑制成骨分化和細(xì)胞增殖能力［33］。

3.5 獨活治療AS延緩纖維化相關(guān)通路獨活治療AS延緩纖維化相關(guān)通路包括：HIF-1α通路（低氧誘導(dǎo)分子-1α通路，HIF-1αsignaling pathway）、HIF-2α通路（低氧誘導(dǎo)分子-2α通路，HIF-2α signaling pathway）等。研究發(fā)現(xiàn)炎癥和缺氧是相互依存的，持續(xù)的炎癥及免疫反應(yīng)使氧的消耗增加，導(dǎo)致了局部組織的缺氧。HIF-1α調(diào)節(jié)血管生成和免疫系統(tǒng)，介導(dǎo)代謝轉(zhuǎn)變和纖維化，利用該通路精準(zhǔn)靶向治療，有望在AS的治療方面獲得新的方法［34］。實驗發(fā)現(xiàn)HIF-2α通路可能導(dǎo)致肌腱異位骨化，據(jù)此推測，可以通過抑制該通路，可能延緩韌帶纖維化、骨化［35］。

綜上所述，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測獨活可通過多成分作用于SOST、DKK1、TLR4、腫瘤壞死因子、ERAP1、ERAP2等多靶點，在免疫、炎癥、骨代謝、延緩纖維化多方面的相關(guān)通路，如Toll樣受體信號通路、NF-κB等多條通路治療AS，但是本研究仍存在很多不足之處，研究結(jié)果仍需通過實驗研究進(jìn)一步證明。本研究可以為未來治療AS尋找新藥物、新通路及精準(zhǔn)靶向治療提供思路。