李碩，李小科，葉永安

1.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院，北京100700；2.北京中醫(yī)藥大學肝病研究所，北京100029

黃疸是由于膽紅素代謝障礙而致血清中膽紅素含量升高，繼而出現(xiàn)鞏膜、黏膜、皮膚發(fā)黃的一種癥狀和體征［1］，根據(jù)病因分為肝細胞性黃疸、溶血性黃疸、膽汁淤積性黃疸、遺傳性高結合膽紅素血癥、先天性非溶血性黃疸。黃疸常見于慢性肝炎、膽汁淤積性肝病或藥物性肝損傷患者。除了應積極治療原發(fā)病及常規(guī)保肝治療外，黃疸患者臨床常用的退黃藥物如熊去氧膽酸、腺苷蛋氨酸、糖皮質(zhì)激素仍存在應答不佳或不良反應等問題。赤芍為臨床常用中藥，毛茛科植物赤芍或川赤芍的干燥根，其主要化學活性成分為芍藥總苷，尚含鞣質(zhì)類、黃酮類、揮發(fā)油類等成分［2］。近年來，赤芍在黃疸中的運用逐漸深入，但缺乏其活性成分、作用靶點及通路的研究。由此，本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法挖掘赤芍治療黃疸的主要成分、關鍵靶點和信號通路，探討其功效作用網(wǎng)絡及藥效作用機制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件中藥系統(tǒng)藥理學分析平臺（TCMSP，http：／／tcmspw.com／tcmsp.php）；BATMANTCM平臺（http：／／bionet.ncpsb.org／batman-tcm／）；Uniport數(shù)據(jù)庫（https：／／www.uniprot.org／）；Gene-Cards（https：／／www.genecards.org／）；人類孟德爾遺傳數(shù) 據(jù)庫（OMIM，https：／／omim.org／）；disGeNET（https：／／www.disgenet.org／）；Therapeutic Target Database（TTD，http：／／bidd.nus.edu.sg／group／cjttd／）；PubChem數(shù)據(jù)庫（https：／／pubchem.ncbi.nlm.nih.gov／）；String數(shù)據(jù)庫（https：／／string-db.org／）；Cytoscape軟件（version 3.7.1）；R軟件及安裝包clusterProfiler（x64 version 3.6.1）［3］。

1.2 赤芍活性成分及潛在作用靶點篩選在TSMSP平臺中檢索“CHISHAO”，得到赤芍的所有化合物成分，將口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18設定為篩選條件，篩選出潛在活性成分。使用PubChem數(shù)據(jù)庫獲取化合物PubChem_CID，剔除未被PubChem收錄的化合物。利用BATMAN-TCM平臺預測候選活性成分的潛在作用靶點，設置Score cutoff＞8，P value＜0.05，刪除無對應靶點的活性成分，利用Uniport數(shù)據(jù)庫中的Uni Pro KBt檢索功能校正基因名稱，刪除非人源靶點，獲得活性成分與潛在作用靶點相關信息。

1.3 黃疸靶點預測使用GeneCards、OMIM、dis-GeNET、TTD數(shù)據(jù)庫檢索關鍵詞“jaundice”“hyperbilirubinemia”獲取黃疸相關的靶點，合并靶點基因并去除重復基因。

1.4 藥物有效成分-靶點網(wǎng)絡構建將赤芍潛在活性靶點與黃疸潛在治療靶點匹配，得到交集靶點，使用韋恩圖表示交集靶點，并運用Cytoscape軟件構建藥物有效成分-潛在治療靶點網(wǎng)絡。運用Cytoscape軟件計算節(jié)點連接度（degree），明確赤芍較重要的有效成分。Degree值是關鍵節(jié)點的拓撲特征值之一，表示與某點連接的邊的數(shù)量，其值越大，表明該點在拓撲結構中越重要。

1.5 PPI網(wǎng)絡構建及分析將赤芍治療黃疸的靶點導入String數(shù)據(jù)庫，物種設置為“homo sapiens”，閾值設置為中等置信度，隱藏游離靶點，獲取PPI網(wǎng)絡，結果保存成TSV格式并導入Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡，利用Cytoscape軟件中MCODE插件進行模塊化分析，設置degree cutoff＞2，K-Core為2，對其特征進行分析，篩選核心靶標模塊。

1.6 靶點GO分析和KEGG分析利用R軟件及clusterProfiler對赤芍治療黃疸的靶點進行GO和KEGG富集分析，設定閾值P＜0.05，顯示富集的前20位結果，通過生物學過程和信號通路富集分析預測赤芍治療黃疸的機制。

2 結果

2.1 赤芍主要有效成分篩選及潛在作用靶點收集TCMSP數(shù)據(jù)庫共收集到赤芍119個有效成分，符合篩選條件（OB≥30%，DL≥0.18）的有效成分共29個，將候選有效成分輸入PubChem數(shù)據(jù)庫獲取化合物PubChem_CID，利用BATMAN-TCM平臺預測潛在作用靶點，去除13個PubChem未收錄的有效成分和2個預測靶點Score＜8的有效成分，最終確定14個有效成分（見表1）。

運用Uniport數(shù)據(jù)庫校正潛在作用靶點基因名，去除重復基因并刪除非人源靶點，最終得到赤芍潛在活性成分靶點228個。

表1 赤芍有效成分

2.2 黃疸靶點收集在GeneCard、OMIM、disGeNET、TTD數(shù)據(jù)庫中檢索關鍵詞“jaundice”“hyperbilirubinemia”，分別檢索到2036、15、55、1個靶點，合并所有靶點，刪除重復基因，共獲得與黃疸相關的靶點2 155個。

2.3 有效成分-靶點網(wǎng)絡構建將赤芍潛在作用靶點與黃疸靶點匹配，得到交集靶點59個，繪制交集靶點韋恩圖（見圖1），推測赤芍可能通過這59個靶點對黃疸起到治療作用。

圖1 疾病與藥物靶點韋恩圖

運用Cytoscape軟件構建有效成分-潛在治療靶點網(wǎng)絡圖（見圖2），圖中共包含73個節(jié)點，有效成分和潛在治療靶點相互作用關系為170條邊，運用Cytoscape軟件計算有效成分degree值（即其作用的靶點數(shù)量），在赤芍有效成分中，潛在靶點數(shù)量排名前5位的是：β-谷甾醇（36個靶點）；豆甾醇（30個靶點）；菜油甾醇（29個靶點）；豆甾-4-烯-3-酮（16個靶點）；菠菜甾醇（16個靶點）。

圖2 赤芍有效成分-潛在治療靶點網(wǎng)絡圖

細胞色素P4503A4（CYP3A4）和糖皮質(zhì)激素受體NR3C1與赤芍有效成分相互作用最為密切，分別被赤芍中7種有效成分調(diào)控；其次是雌激素受體ESR1和雄激素受體AR可以分別被6種赤芍有效成分調(diào)控。

說明藥物與靶點之間具有一藥多靶和一靶多藥的特點，提示赤芍通過多靶標調(diào)控、多環(huán)節(jié)介入的模式發(fā)揮治療黃疸的作用。

2.4 PPI網(wǎng)絡構建及核心靶點篩選將59個交集靶點導入String數(shù)據(jù)庫獲得相互作用關系的網(wǎng)絡，得到TSV文件后導入Cytoscape軟件中進行PPI網(wǎng)絡繪制及網(wǎng)絡拓撲分析（見圖3）。PPI網(wǎng)絡共包含55個節(jié)點（4個靶蛋白未參與相互作用），187條連接，degree值越大，其表現(xiàn)的圓形直徑越大；其中NR1H4（degree＝23）、AKT1（degree＝19）、CYP3A4（degree＝17）等靶蛋白degree值大，與其他靶蛋白相互作用強，在網(wǎng)絡中發(fā)揮重要作用。利用Cytoscape軟件中MCODE插件進行模塊化分析，設置degree cutoff＞2，K-Core為2，對其特征進行分析，篩選出4個核心靶標模塊（a、b、c、d），其聚類評分依次是4.889、4.909、3、3。篩選出來的模塊在網(wǎng)絡中信息傳遞效率更高，單一靶點對其他節(jié)點的影響力更大。

圖3 赤芍與黃疸交集靶點PPI網(wǎng)絡

2.5 GO和KEGG富集分析將赤芍治療黃疸的59個靶點進行GO富集分析，根據(jù)GeneRatio篩選出富集結果的前20位，并繪制氣泡圖（見圖4）。GO富集分析顯示，赤芍治療黃疸的作用機制與脂質(zhì)固化、類固醇代謝、脂質(zhì)運輸、酒精代謝、有機羥基化合物生物合成、脂肪酸代謝、脂質(zhì)分解、次生酒精代謝、類固醇生物合成、類固醇結合、核受體活動、膽汁酸和膽鹽轉運等生物過程相關。表明赤芍通過調(diào)節(jié)多種生物過程達到治療黃疸的作用。

圖4 赤芍治療黃疸靶點GO富集分析

將赤芍治療黃疸的靶點通過R軟件及cluster-Profiler進行KEGG富集分析，設置閾值P＜0.05，并繪制氣泡圖（見圖5）。結果顯示赤芍治療黃疸的作用機制可能與膽汁分泌、非酒精性脂肪肝、ABC轉運蛋白、脂肪細胞因子信號通路、PPAR信號通路、膽固醇代謝等信號通路有關，表明赤芍潛在作用靶點可以通過多個通路干預黃疸。本研究發(fā)現(xiàn)較多靶點富集在膽汁合成及代謝通路，提示赤芍可能通過調(diào)控該通路及下游蛋白，如HMGCR、CYP3A4、RXRA等參與膽紅素代謝（見圖6）。

圖5 赤芍治療黃疸靶點KEGG富集分析

圖6 膽汁合成及代謝通路

3 討論

中醫(yī)學認為，黃疸是指因肝失疏泄，膽汁外溢，或血敗不華于色，引發(fā)以目黃、身黃、小便黃為主要臨床表現(xiàn)的病證［4］?！督饏T要略》提出黃疸病“從濕得之”，而唐容川《金匱要略淺注補正》云：“瘀熱以行，一個瘀字，便見黃皆發(fā)于血分，凡氣分熱不得稱瘀，小便黃赤短赤澀而不發(fā)黃者多矣……故必血分濕熱乃發(fā)黃也?！标P幼波先生提出“治黃必治血，血行黃易卻”的治療觀點，強調(diào)應從血分論治，在活血解毒化痰通絡基礎上辨證施治［5］。周仲瑛教授指出，瘀熱是指瘀和熱兩種病理因素互相搏結、膠結形成的具有新的特質(zhì)的病理因素，是黃疸的病理基礎［6］。說明歷代醫(yī)家對黃疸“瘀血發(fā)黃”的病機具有相似的觀點。赤芍清熱涼血，活血祛瘀，既入肝經(jīng)，兼入血分，對于治療黃疸具有較好療效。《本草經(jīng)疏》曰：“木芍藥色赤，赤者主破散，主通利，專入肝家血分……涼肝故通順血脈，肝主血，入肝行血，故散惡血，逐賊血……行血涼血。”近年來，中醫(yī)藥在治療黃疸方面的報道［7-8］不斷增加。何堂清等［9］對黃疸病常用處方數(shù)據(jù)挖掘進行研究，發(fā)現(xiàn)赤芍的使用頻次位于327種常用中藥中的第39位，提示了赤芍在治療黃疸病中的重要作用。臨床研究表明，赤芍對重度黃疸型肝炎患者血清膽紅素下降具有促進作用［10-11］。茵陳蒿湯合赤芍湯治療急性黃疸型肝炎退黃、改善肝功能效果優(yōu)于使用門冬氨酸鉀鎂治療的對照組［12］。

本研究共篩選出赤芍14個主要有效成分。網(wǎng)絡拓撲學分析顯示，β-谷甾醇、豆甾醇、菜油甾醇擁有相對較多的潛在靶點。上述三者均屬于植物甾醇，可以通過減弱炎癥模型下的細胞活力、降低吞噬能力以及NO、TNF-α的生成從而減輕炎癥反應癥狀［13］。已有研究報道，β-谷甾醇及其衍生物對脂多糖／氨基半乳糖誘導的小鼠急性肝損傷具有保護作用［14］。豆甾醇具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降低膽固醇等藥理作用［15］。菠菜甾醇以濃度依賴性方式抑制脂多糖誘導的一氧化氮和促炎性細胞因子的生成［16-18］。

在篩選出治療黃疸的59個直接作用靶點中，CYP3A4、NR3C1與赤芍有效成分相互作用最為密切。CYP3A4是細胞色素P450家族中最為重要的藥物代謝酶，其在外源性物質(zhì)和內(nèi)源性物質(zhì)的代謝中起著極其重要的作用，50%以上的臨床口服藥物在體內(nèi)需經(jīng)CYP3A4的代謝轉化［19］。藥物經(jīng)過細胞色素P450代謝亦可形成如電子基、氧自由基等有害活性毒物，毒物形成與解毒之間的平衡對藥物性肝損傷的形成至關重要［20］，故通過調(diào)控CYP3A4可從加強藥物解毒、代謝的角度改善藥物性肝損傷引起的黃疸。NR3C1基因調(diào)控糖皮質(zhì)激素受體。糖皮質(zhì)激素是一種廣譜免疫抑制劑，其消退黃疸的主要機制是：減輕門脈區(qū)和毛細膽管的非特異性炎癥；利于膽汁的排泌，改善全身毒性反應；阻止抗原抗體復合物產(chǎn)生；減少肝細胞免疫損傷；穩(wěn)定溶酶體膜；減少組織損害；減少血紅蛋白分解；減少膽紅素生成［21］。糖皮質(zhì)激素可通過阻止細胞因子的產(chǎn)生和黏附分子的表達而限制T淋巴細胞的活化，同時可選擇性抑制B淋巴細胞產(chǎn)生抗體［22］，充分權衡治療收益和不良反應后可應用于免疫機制介導的膽汁淤積患者，如自身免疫性肝炎、乙型病毒性肝炎等。

PPI網(wǎng)絡拓撲學結果顯示，NR1H4在網(wǎng)絡中處于核心位置，與其他靶蛋白相互作用強。NR1H4基因編碼膽汁酸受體法尼酯衍生物X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）通過調(diào)節(jié)參與膽汁酸的合成及肝腸循環(huán)維持膽汁酸穩(wěn)態(tài)。FXR途徑參與膽汁淤積的形成和管理，而FXR激活療法對膽汁淤積具有直接治療作用［23］。對PPI網(wǎng)絡進行聚類分析，獲得其中聚類評分較高的4個模塊，其中聚類評分最高的模塊b中包含ABCB1、ABCC2、SLCO1B3、FABP6、GPBAR1、NFKB1、NR1I2等膽紅素代謝相關靶點，提示可能通過調(diào)節(jié)膽紅素代謝發(fā)揮治療黃疸的作用。

赤芍治療黃疸通路富集分析結果顯示，赤芍通過多條通路發(fā)揮治療黃疸的作用，如膽汁分泌、ATP結合盒式（ATP binding cassette，ABC）轉運蛋白、PPAR信號通路等。

保證膽汁的正常分泌及代謝在治療膽汁淤積性黃疸中尤為重要。膽紅素從肝細胞分泌至膽小管，再隨膽汁進入腸道完成肝腸循環(huán)，若膽汁排泄出現(xiàn)障礙，膽紅素反流入血，導致血清膽紅素水平升高。ABC轉運蛋白是一類跨膜運輸?shù)鞍?，參與細胞內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和細胞毒性化合物排出［24］，其成員的功能正常，保證膽汁的正常運輸，從而避免膽汁淤積疾病的發(fā)生，如由ABCB11基因編碼的膽汁酸外排泵轉運功能正常，保證了膽汁酸在體內(nèi)的平衡［25］，ABCC2基因異常則會導致結合膽紅素在肝細胞內(nèi)轉運和排泄障礙，出現(xiàn)以黃疸為主要特征的Dubin-Johnson綜合征［26］。研究表明，激活小鼠的孕烷X受體（pregnane X Receptor，PXR）能增加膽紅素的清除［27］。PXR作為膽紅素代謝轉化的重要調(diào)控因子，通過誘導UGT1A1基因表達來影響膽紅素代謝消除［28］。另一方面，PXR參與調(diào)控藥物代謝酶CYP3A4［29］的轉錄，從而促進肝臟的解毒和代謝功能以緩解黃疸。過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferators-activated receptor alpha，PPARα）激活可調(diào)節(jié)膽固醇代謝并抑制膽汁酸的合成。一項動物實驗表明，激活PPARα后，可顯著降低血清膽紅素水平、減少炎癥因子，從而改善肝細胞損傷［30］。

綜上所述，本研究應用網(wǎng)絡藥理學方法系統(tǒng)預測了赤芍治療黃疸的機制，通過對赤芍的有效成分、潛在靶點及生物學功能和作用通路綜合分析，發(fā)現(xiàn)赤芍主要通過增加膽汁分泌和轉運、提高藥物代謝酶含量、調(diào)控核受體活性、抑制炎性因子釋放等方面治療黃疸。由此預測，運用赤芍治療膽汁淤積性黃疸或藥物性肝損傷、炎癥引起的肝細胞性黃疸可能取得較好療效，但仍需完善動物實驗以及臨床研究進一步驗證，以提高臨床用藥的合理性和科學性。