袁海英,蔡幫軍

(華潤(rùn)三九（雅安）藥業(yè)有限公司，四川 雅安 625000)

0 引 言

參附注射液是由紅參和附子制成的中藥復(fù)方制劑，源自著名驗(yàn)方參附湯，主要有效成分為人參皂苷、人參三醇類(lèi)物質(zhì)和烏頭類(lèi)生物堿[1]。參附注射液臨床主要用于陽(yáng)氣暴脫的厥脫癥，具有強(qiáng)心、升壓、改善微循環(huán)等作用，臨床用于休克搶救療效確切[2]。藥理研究表明[3-4]，參附注射液中的強(qiáng)心成分主要為附子中的生物堿成分，附子中的生物堿包括雙酯型生物堿及其水解產(chǎn)物單酯型生物堿，它們既是有效成分又是毒性成分，其中雙酯型生物堿有大毒，單酯型生物堿毒性較小。續(xù)海訓(xùn)[5]報(bào)道參附注射液中，雙酯型生物堿基本上全部水解，只含有低毒有效的單酯型生物堿。為進(jìn)一步評(píng)價(jià)參附注射液質(zhì)量，本試驗(yàn)建立了超高效液相色譜（UHPLC）法同時(shí)測(cè)定參附注射液中單酯型生物堿的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 2695超高效液相色譜儀（沃特世）、XPE26電子天平（梅特勒）、UPT-1-40L超純水器（優(yōu)普），SC-8L-150數(shù)控固相萃取儀（廣州智真）。

1.2 試藥與試劑

參附注射液（華潤(rùn)三九（雅安）藥業(yè)有限公司）；苯甲酰新烏頭原堿（批號(hào)：111795—201303）、苯甲酰烏頭原堿（批號(hào)：111794—201303）、苯甲酰次烏頭原堿（批號(hào)：111796—201303）對(duì)照品均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純（默克）；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對(duì)照品溶液制備

精密稱(chēng)取苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品適量，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1）的混合溶液制 57.56 μg/mL苯甲酰新烏頭原堿、55.12 μg/mL 苯甲酰烏頭原堿、53.90 μg/mL 苯甲酰次烏頭原堿的混合對(duì)照品貯備溶液。再精密吸取上述貯備溶液適量，加異丙醇-二氯甲烷（1∶1）的混合溶液稀釋制成每1 mL含苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿分別為10.36 μg、9.92 μg、9.70 μg 的混合對(duì)照溶液。

2.1.2 供試品溶液制備

精密量取參附注射液10 mL，加于phenomenex Strata-X C18固相萃取小柱（先以15 mL甲醇活化，再以15 mL水平衡），以水5 mL沖洗，再以甲醇1 mL洗脫，用1 mL量瓶收集甲醇洗脫液至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另按參附注射液工藝制備缺附子的陰性樣品，照供試品處理方法制備成陰性樣品溶液。由于參附注射液中生物堿含量較低，需對(duì)待測(cè)生物堿進(jìn)行富集，試驗(yàn)考察了氯仿萃取法、固相柱萃取柱法、氧化鋁萃取法等，結(jié)果表明固相柱萃取法所制備的供試品雜質(zhì)較少[6-8]。同時(shí)比較了不同廠(chǎng)家的C8和C18固相萃取小柱以及不同洗脫方法，最終確定了上述供試品溶液的制備方法。

2.2 色譜條件

采用 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 m×100 mm，1.8 μm）色譜柱；以甲醇為流動(dòng)相A，0.01 mol/L乙酸銨溶液（冰乙酸調(diào)pH5.0）為流動(dòng)相B，等度洗脫（A∶B=39∶61）；流量為 0.4 mL/min；柱溫為 30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為235 nm；理論板數(shù)以苯甲酰新烏頭原堿峰計(jì)算大于20 000，進(jìn)樣量1 μL。

2.3 專(zhuān)屬性試驗(yàn)

精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各1 μL，注入超高效液相色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果陰性樣品對(duì)供試品測(cè)定無(wú)干擾，見(jiàn)圖1，說(shuō)明本方法專(zhuān)屬性良好。

圖1 對(duì)照品（A）、供試品（B）和陰性樣品（C）UHPLC色譜圖

2.4 線(xiàn)性范圍、檢出限和定量限考察

2.4.1 線(xiàn)性范圍

取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品貯備溶液，分別稀釋2、4、8、16、32、64倍，精密吸取不同濃度的對(duì)照品溶液各1 μL注入超高效液相色譜儀，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定，以各色譜峰進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X（ng），峰面積為縱坐標(biāo)Y，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，各成分回歸方程及線(xiàn)性范圍見(jiàn)表1。結(jié)果表明各成分在線(xiàn)性范圍內(nèi)與峰面積有良好的線(xiàn)性關(guān)系。

表1 線(xiàn)性關(guān)系考察

2.4.2 檢測(cè)限和定量限

取“2.4.1”項(xiàng)下最小濃度的混合對(duì)照品溶液，分別稀釋不同倍數(shù)后精密吸取1 μL進(jìn)樣檢測(cè)，考察信噪比（S/N），根據(jù)3倍S/N確定檢出限、10倍S/N確定定量限，分別計(jì)算出各成分的檢出限和定量限見(jiàn)表2。結(jié)果表明采用UHPLC方法檢測(cè)時(shí)各成分的檢出限和定量限均較低。

表2 各成分檢出限和定量限

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液 1 μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿峰面積見(jiàn)表3。RSD分別為1.18%、1.23%、1.07%，表明儀器精密度良好。

表3 精密度考察

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批參附注射液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法，平行制備供試品溶液6份，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。6份平行供試品中測(cè)得苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿和苯甲酰烏頭原堿的含量RSD分別為1.63%、0.91%、1.19%，表明本方法重復(fù)性良好。

表4 重復(fù)性考察 μg/mL

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液室溫放置，分別于0，2，4，6，8，12，24 h 按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表5。在24 h內(nèi)苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿和苯甲酰次烏頭原堿含量的RSD分別為1.79%、0.83%、1.09%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表5 穩(wěn)定性考察 μg/mL

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

根據(jù)參附注射液中已知苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的含量，配制相應(yīng)濃度的混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取參附注射液共9份，分別精密加入低、中、高3種水平的混合對(duì)照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表6。苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的加樣回收率均在97.1%～104.8%之間，RSD均小于2%，表明本方法準(zhǔn)確度較好。

表6 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品測(cè)定

取10批參附注射液，按“2.1.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，并按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，計(jì)算10批樣品中單酯型生物堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 參附注射液3種單酯型生物堿含量測(cè)定結(jié)果 μg/mL

3 討 論

3.1 檢測(cè)方法優(yōu)選

中成藥中烏頭類(lèi)生物堿含量測(cè)定方法文獻(xiàn)報(bào)道較多，主要采用的高效液相色譜法[9-12]，而參附注射液中烏頭類(lèi)生物堿含量測(cè)定的研究則較少。本試驗(yàn)先采用了一般高效液相色譜法，考察了不同流動(dòng)相及色譜柱對(duì)3種單酯型和3種雙酯型烏頭類(lèi)生物堿的分離效果，結(jié)果各色譜峰的響應(yīng)值較低，出峰時(shí)間較長(zhǎng)，且基線(xiàn)易發(fā)生漂移。后采用超高效液相色譜法，可使基線(xiàn)平穩(wěn)、各色譜峰響應(yīng)值較高、峰形較好且出峰較快，見(jiàn)圖2。

圖2 3種單酯型和3種雙酯型烏頭類(lèi)生物堿UHPLC色譜圖

3.2 參附注射液制備過(guò)程酯型生物堿的含量變化情況

參附注射液處方中附子為毒性藥材，主要毒性成分為酯型生物堿。研究表明，雙酯型烏頭堿的毒性為單酯型的50～500倍，為無(wú)酯型的2 000倍，而毒性較低的單酯型生物堿被認(rèn)為是附子的主要藥效物質(zhì)[13]。通過(guò)對(duì)5批參附注射液制備過(guò)程中關(guān)鍵工藝點(diǎn)的酯型生物堿含量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)現(xiàn)毒性較大的雙酯型烏頭堿逐步降解，成品中總含量為0（見(jiàn)圖3）；而毒性較小的單酯型烏頭堿也在逐步降解，成品中總含量約為提取液的20%（見(jiàn)圖4）。說(shuō)明參附注射液制備過(guò)程是一個(gè)減毒過(guò)程，而體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，人參配伍附子后可促進(jìn)單酯型生物堿的吸收[14]，起到增強(qiáng)藥效的作用。

圖3 參附注射液制備過(guò)程雙酯型生物堿含量變化圖

圖4 參附注射液制備過(guò)程單酯型生物堿含量變化圖

4 結(jié)束語(yǔ)

綜上所述，由于參附注射液中起強(qiáng)心作用的主要藥效物質(zhì)為單酯型生物堿，但由于其仍具有一定的毒性作用，需對(duì)其總含量進(jìn)行控制。從表7結(jié)果可知10批參附注射液中3種單酯型生物堿總含量在3.4～5.1 μg/mL 范圍內(nèi)波動(dòng)，均值為4.3 μg/mL，RSD為13.0%，批間較穩(wěn)定。因參附注射液現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)已采用薄層色譜法對(duì)雙酯型生物堿的限量進(jìn)行了檢查，要求供試品色譜中與烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上出現(xiàn)的斑點(diǎn)應(yīng)小于對(duì)照品斑點(diǎn)或不出現(xiàn)斑點(diǎn)，故建議增加參附注射液中3種單酯型生物堿總含量限度2.5～6.0 μg/mL，以此作為現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的補(bǔ)充，從而進(jìn)一步保證臨床用藥的安全性及有效性。