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        四翅濱藜AcDREB2 轉錄因子編碼基因的克隆及其表達

        2021-04-20 07:31:28茍艷麗高麗莉吳欣欣包愛科
        草業(yè)科學 2021年3期
        關鍵詞:結構域元件克隆

        茍艷麗,高麗莉,吳欣欣,郭 歡,包愛科

        (1. 蘭州大學草地農業(yè)科技學院,甘肅 蘭州 730020;2. 甘肅農業(yè)職業(yè)技術學院園林工程系,甘肅 蘭州 730020)

        鹽和干旱是范圍最大、影響最廣的非生物逆境脅迫,也是限制全球農業(yè)生產的兩大主要因素。鹽和干旱脅迫都會引起細胞失水,破壞細胞內穩(wěn)態(tài)平衡,致使細胞內生理生化代謝紊亂,嚴重影響植物的正常生長發(fā)育。為了在日趨惡劣的環(huán)境中生存和繁殖,陸地植物進化出復雜的調控系統(tǒng)來響應脅迫信號以提高植物的適應能力。在鹽和干旱脅迫下,很多抗逆相關基因被大量誘導表達,其中脫水應答元件結合蛋白(DREB)就在這個過程中發(fā)揮重要作用。1997 年,Stockinger 等[1]通過酵母單雜交方法首次從擬南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆出能夠與DRE 順式作用元件結合的蛋白編碼基因CBF1 (Crepeat/DRE Binding Factor 1)。Liu 等[2]從擬南芥中分離出DREB1A 和DREB2A 兩個基因,通過凝膠移位分析與反式激活實驗證明,DREB1A 與DREB2A 均能與DRE 順式作用元件高度特異性結合,DREB1A能夠被冷脅迫快速誘導表達,DREB2A 能夠被干旱和高鹽快速誘導表達。

        目前對于 DREB 功能的研究大多集中在模式植物擬南芥與抗逆能力有限的作物中,大量研究已證實將 DREB 基因在擬南芥或作物中超表達,能夠顯著提高轉基因植物對干旱、鹽堿、低溫等各種非生物脅迫的抗性。但是關于 DREB 在旱生、鹽生植物中的功能研究目前尚少。四翅濱藜(Atriplex canescens)是一種多年生 C4半常綠灌木,具有速生、耐干旱、耐貧瘠、抗鹽堿等優(yōu)良特性,由于其粗蛋白含量高,適口性好,是改良牧場和水土保持的優(yōu)良樹種[3]。Pan 等[4]研 究 表 明,100 mmol·L?1NaCl 可 以 促 進 四翅濱藜的生長,且當 NaCl 濃度達到 400 mmol·L?1時,四翅濱藜的生長并沒有受到顯著抑制。四翅濱藜也具有一定的抗旱能力,在重度干旱脅迫下,四翅濱藜合成的干物質的量是花棒(Hedysarum scoparium)、檸條(Caragana korshinskii)、楊柴(Hedysarum mongolicum)等6 種旱生灌木中最大的[5]。前期關于四翅濱藜抗逆機理的研究主要集中在生態(tài)恢復、種子萌發(fā)、生理適應和離子轉運等方面[4,6-8],轉錄因子在其抗逆過程中的功能尚鮮見報道。

        鑒于此,本研究克隆了四翅濱藜脫水響應元件結合蛋白編碼基因AcDREB2 全長cDNA,并對其序列進行分析,有望揭示AcDREB2 在四翅濱藜抗逆過程中的作用,從而為挖掘四翅濱藜中蘊含的抗逆基因資源、并將其應用于作物和牧草抗逆性的遺傳改良奠定重要基礎[9]。

        1 材料與方法

        1.1 植物材料

        本研究所用四翅濱藜種子采自寧夏回族自治區(qū)靈武縣。根據(jù)Pan 等[4]的種子處理和發(fā)芽方法將四翅濱藜發(fā)芽苗移栽至含有蛭石的穴盤中,用1/2 Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)4 周。培養(yǎng)室溫度為25~28 ℃,光照條件為800 μmol·(m2·s)?1、16 h (晝)/8 h (夜)。

        1.2 總RNA 提取及其反轉錄

        剪取4 周齡四翅濱藜的葉片,放入液氮迅速冷凍后,參照北京天根RNA prep Pure Plant Kit 操作說明書提取總RNA,通過NanoDrop1000 核酸蛋白檢測儀檢測RNA 質量及濃度,利用凝膠電泳檢測其完 整 性。隨 后 用TAKARA PrimeScript Ⅱ 1st strand cDNA 合成試劑盒將RNA 反轉錄得到cDNA 第一鏈。

        1.3 AcDREB 基因全長克隆

        利用DNAMAN 6.0 軟件,根據(jù)NCBI 上其他植物AcDREB 同源基因的保守氨基酸序列設計一對簡并引物(上游引物:TGGGGKAARTGGGTYGCHGARATYCG;下游引物:ACDGADGARTGNAGWGGYTTRTA),預測其核心片段長度為215 bp。用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒(Thermo,北京)進行PCR 擴增,反應體系為20 μL,反應條件:95 ℃預變性30 min,94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,35 個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物后,按照StarPrep Gel Extraction Kit (GenStar)說明書回收和純化目的片斷,送蘇州金唯智(GENEWIZ)測序。

        根據(jù)已獲得的四翅濱藜AcDREB2 基因核心片段序列,采用RACE 法分別克隆該基因的5′-和3′-序列。最后用MEGA5 軟件將核心片段、3′-及5′-序列進行拼接后獲得全長cDNA 序列。5′-克隆步驟如下:根據(jù)得到的核心片段序列,用DNAMAN 6.0 和Primer 5.0 軟件設計5′-特異性巢式引物外側P1 和內側P2 (表1),RACE 試劑盒自帶巢式引物分別為外側P3 和內側P4 (表1)。擴增時首先以5′-RACE cDNA 為模板,用引物P1 與P3 進行擴增得到外側PCR 產物,然后以此為模板,再用引物P2 與P4 進行擴增得到內側PCR 產物。外側PCR 擴增反應程序:98 ℃ 30 s;98 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,72 ℃20 s,30 個循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。內側PCR 擴增反應程序:98 ℃ 30 s;98 ℃ 10 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 15 s,30 個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。3′-克隆步驟如下:同樣根據(jù)核心片段設計3′-特異性巢式引物外側P5 和內側P6。擴增時首先以3′-RACE cDNA為模板,用引物P5 與P3 擴增得到外側PCR 產物,然后以此為模板,再用引物P6 與P4 擴增得到內側PCR 產物。外側PCR 擴增反應程序:98 ℃ 30 s;98 ℃10 s,54 ℃ 30 s,72 ℃ 23 s,30 個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。內側PCR 擴增反應程序:98 ℃ 30 s;98 ℃10 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 20 s,30 個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。

        表1 5′ -和3′ -RACE 所用引物Table 1 Primers for the 5′ - and 3′ - RACE analysis

        1.4 序列分析

        在GenBank 中進行序列BLAST 比對,用DNAMAN 6.0 進行序列同源性分析、翻譯、氨基酸序列比對以及系統(tǒng)進化樹制作,在NCBI SMART 中進行蛋白質結構預測。

        1.5 基因表達模式分析

        依據(jù)AcDREB2 全長CDS 序列,設計一對引物(上游引物:TCACTGGGGTAAATGGGTCG;下游引物:TGTAAGCCGCCTTGTCGTAA),通過Real-time PCR 對1/2 Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)4 周的四翅濱藜幼苗根、莖、葉中AcDREB2 表達量進行分析。隨后,將4 周的四翅濱藜幼苗分別用100 和300 mmol·L?1NaCl 處理以及?0.27 和?0.54 MPa 的滲透脅迫(滲透脅迫試劑為山梨醇)處理0、0.5、1、3、6、12、24 h后取葉樣,進行AcDREB2 的表達模式分析。各樣品重復3 次,以四翅濱藜AcActin 基因為內參(上游引物:AAGAACTACGAGCTACCTGACGG;下游引物:GATACCAGAAGATTCCATTCCAAC),Real-time PCR參照SYBR Premix Ex TaqTM II (TAKARA)試劑盒說明進行,以反轉錄好并用ddH2O 稀釋10 倍后的cDNA為模板,進行Real-time PCR 反應。按照2???Ct相對定量法計算表達量,采用獨立樣本T 檢驗分析對照和處理條件下表達量的差異顯著性。

        2 結果與分析

        2.1 四翅濱藜AcDREB2 基因全長cDNA 克隆及序列分析

        通過簡并引物擴增得到核心序列長度為215 的條帶(圖1a),與預測長度一致。以此序列為基礎利用RACE 法獲得5′-和3′-序列,分別為234 和509 bp 的cDNA (圖1b, c)。

        圖1 AcDREB2 基因核心片段(a)、5′-RACE (b)和3′-RACE (c)克隆Figure 1 The core fragment, 5′- and 3′- end fragments of AcDREB2

        將以上3 段序列進行拼接后得到總長度為867 bp,且3′-具有完整的Poly (A)尾巴的cDNA 序列(圖2)。將此全長序列在NCBI 中BLAST 比對發(fā)現(xiàn),該基因與其他植物DREB2 基因具有較高的同源性,故命名為AcDREB2。將全長序列進行氨基酸翻譯后,發(fā)現(xiàn)該基因包含19 bp 的5′-非翻譯區(qū)(untranslated region:UTR),119 bp 的3′-非翻譯區(qū)及729 bp 的開放閱讀框(open reading frame: ORF),共編碼242 個氨基酸(圖2)。

        圖2 AcDREB2 基因的核苷酸序列及其編碼氨基酸序列Figure 2 Nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of AcDREB2

        2.2 AcDREB2 氨基酸序列的同源性比較與結構域分析

        將AcDREB2 與其他植物DREB 氨基酸序列進行多重比較分析,發(fā)現(xiàn)該蛋白具有高度保守的典型AP2/EREBP 結構域,該結構域中包含3 個β 折疊和1 個α 螺旋,其中第14 位是保守的纈氨酸殘基(V),19 位為亮氨酸殘基(L),與其他植物DREB 的保守氨基酸位點相一致(圖3)。利用在線軟件NCBI SMART 預測AcDREB2 蛋白結構域,顯示起始密碼子之后第41-104 區(qū)域中含有一個典型的AP2 保守結構域,并存在兩個低復雜區(qū)(low-complexity region)(圖4)。

        2.3 系統(tǒng)進化樹分析

        利用DNAMAN 軟件進行系統(tǒng)進化樹分析,發(fā)現(xiàn)AcDREB2 與同科植物地中海濱藜AhDREB2 和榆錢菠菜AhoDREB2 同源性最高,分別高達96%和93%;與同為鹽生植物的鹽地堿蓬SsDREB2 的相似度也較高,達到72%;與其他荒漠植物如野菊CiDREB1-2 和檸條CkDREB2 等的相似度再38%以上;此外,與大豆GmDREB2、小麥TaDREB2 和玉米ZmDREB2b 等作物和模式植物擬南芥AtDREB2A的同源性都較低(圖5)。

        2.4 AcDREB2 表達的組織特異性分析

        用Real-time PCR 的方法分析AcDREB2 基因在4 周齡四翅濱藜幼苗根、莖、葉各組織中的表達情況。結果表明,AcDREB2 在四翅濱藜各組織中均有表達,其中在葉中的表達量最高,莖中最低(圖6)。因此,后續(xù)選取表達豐度最高的葉組織樣進行各脅迫處理下AcDREB2 的表達模式分析。

        2.5 NaCl 和滲透脅迫處理下AcDREB2 在四翅濱藜葉中的表達模式

        100 和300 mmol·L?1NaCl 處理不同時間(0、0.5、1、3、6、12 和24 h)后,AcDREB2 在四翅濱藜葉中的表達模式如圖7 所示。低鹽(100 mmol·L?1NaCl)和高鹽(300 mmol·L?1NaCl)處理后,AcDREB2的表達模式類似,表達量均隨處理時間的延長逐漸增高,直至處理3 h 時達到峰值,為處理前表達量的2 倍以上(圖8)。由此可見,葉中AcDREB2 的表達受NaCl處理的顯著誘導。

        圖3 AcDREB2 與其他植物DREB 氨基酸序列多重比較Figure 3 Amino acid sequence alignment of AcDREB2 with DREBs from other plants

        圖4 AcDREB2 功能域分析Figure 4 Functional domain analysis of AcDREB2

        滲透脅迫處理下,隨著處理時間的延長,AcDREB2在四翅濱藜葉中的相對表達量總體上呈先上升后下降的趨勢,但其表達量峰值因滲透脅迫程度不同而有所差異;?0.27 MPa 輕度滲透脅迫下,AcDREB2的表達量在處理3 和6 h 時均大幅增加,其中處理6 h時達到峰值且比處理前高出2.8 倍;而?0.54 MPa重度滲透脅迫下,AcDREB2表達量在處理3 h 時達到最高(圖8)。由此可見,AcDREB2 的表達受滲透脅迫處理(尤其是輕度滲透脅迫)的強烈誘導。

        3 討論與結論

        已有研究表明,植物在遭遇干旱、低溫、高鹽等逆境脅迫時會產生一系列應答反應,這些反應受植物體內多種因素的調節(jié),其中轉錄因子可以激活很多靶基因的轉錄和表達,進而使下游靶基因發(fā)揮作用[10-12]。目前從各種植物中已克隆出許多抗逆基因,這些抗逆基因可以一定程度的提高植物的某些抗性,但是對其上游轉錄激活區(qū)的研究較少,從而不能全面的分析植物的抗逆機制。植物中DREB 轉錄因 子(dehydration reesponsive element binding protein)在調控功能基因表達與非生物脅迫信號轉導中具有非常重要的作用,當其受到逆境脅迫時,該蛋白編碼基因會與DRE/CRT 順式作用元件結合,并激活下游相應功能基因的表達[13]。因此,轉錄因子在植物抗逆機制中發(fā)揮的作用不容忽視。

        圖5 AcDREB2 的系統(tǒng)進化樹分析Figure 5 Phylogenetic tree analysis of AcDREB2

        圖6 AcDREB2 在4 周齡四翅濱藜根、莖、葉中的相對表達量Figure 6 Relative expression levels of AcDREB2 in roots,stems, and leaves of four-week-old Atriplex canescens seedlings

        圖7 NaCl 處理下AcDREB2 在四翅濱藜葉中的表達模式Figure 7 Expression pattern of AcDREB2 in Atriplex canescens leaves under NaCl treatments

        圖8 滲透脅迫下AcDREB2 在四翅濱藜葉中的表達模式Figure 8 Expression pattern of AcDREB2 in A. canescens leaves under osmotic stress

        本研究從鹽生植物四翅濱藜中克隆到一個DREB類轉錄因子家族成員的編碼基因 AcDREB2,在豐富了基因資源信息庫的同時,以期為深入探究該類植物的抗逆機制奠定基礎。該基因編碼氨基酸序列的全長為867 bp,共編碼242 個氨基酸。進一步對其氨基酸序列進行同源性比對分析和結構域預測,發(fā)現(xiàn)其含有該類基因特有的AP2/EREBP 保守結構域和兩個低復雜區(qū)(low complexity region),這種低復雜區(qū)普遍存在于該類蛋白中,能促進蛋白質結構穩(wěn)定,有時也會呈現(xiàn)出彈性結構以便與其他多種蛋白質結合共同發(fā)揮功能。而AP2 保守結構域中包含1 個α 螺旋和3 個β 折疊結構,整個結構域中由64 個氨基酸殘基組成,這與已經報道的其他同科植物和抗逆性強的荒漠植物中DREB 蛋白保守結構域特征相符合[14-16]。研究表明,DREB 的AP2/EREBP 保守結構域中第14 位是保守的纈氨酸殘基(V),第19 位是保守的谷氨酸殘基(G),在該蛋白與特異性的順式元件結合過程中起關鍵作用[17]。在本研究結果中,AcDREB2 的AP2 保守結構域第14 位同樣是纈氨酸殘基(V14),而第19 位是亮氨酸殘基(L19)。研究發(fā)現(xiàn),將擬南芥AP2/ERF 結構域中第14 位的纈氨酸替換為丙氨酸后,DREB 不會與DRE 順式元件序列結合,導致DREB 轉錄因子功能喪失,而將第19 位的谷氨酸替換為天冬氨酸,DREB 仍可與DRE順式元件相結合,正常發(fā)揮功能[18]。因此,AcDREB2 AP2 保守結構域中第14 位保守的纈氨酸殘基是決定其功能的關鍵氨基酸,在與對應元件特異性結合中發(fā)揮重要作用,而第19 位的亮氨酸很可能并不會影響到該蛋白與DRE 順式元件的結合。因此,推測AcDREB2 可以正常激活轉錄,參與調控下游相關報告基因的表達。

        同源性比對及進行系統(tǒng)進化樹分析結果表明,四翅濱藜AcDREB2 與同屬植物地中海濱藜AhDREB2和榆錢菠菜AhoDREB2 的同源關系最近,分別高達96%和93%以上;與同科植物鹽地堿蓬SsDREB2的同源性達到72%;此外,與其他荒漠植物檸條等的同源性也較高。這表明AcDREB2 很可能與親緣關系相近的植物中的同源基因具有相似功能。研究發(fā)現(xiàn),鹽地堿蓬SsDREB2 能特異性結合DRE 順式元件,發(fā)揮轉錄激活功能,且在煙草中超表達SsDREB2顯著提高了植株的耐鹽抗旱性,同時發(fā)現(xiàn)轉基因植株中與非生物脅迫響應相關的6 個功能基因的表達量顯著高于野生型[19-20]。這表明DREB 轉錄因子可以通過調控干旱和高鹽等脅迫響應相關基因的表達,提高植物對逆境環(huán)境的適應能力。因此推斷四翅濱藜AcDREB2 在其響應高鹽干旱環(huán)境的過程中發(fā)揮重要作用。

        通過實時熒光定量PCR 方法分析了AcDREB2在四翅濱藜響應鹽和滲透脅迫中的表達模式。結果發(fā)現(xiàn),AcDREB2 主要在四翅濱藜葉中發(fā)揮作用(圖8),這可能與四翅濱藜在鹽和干旱條件下能通過葉片表面鹽囊泡將多余Na+排出體外以提高植株在脅迫環(huán)境中的保水能力和光合能力,從而提高其抗逆性有關[4,21]。此外,在鹽和滲透脅迫處理3 h 后,AcDREB2的表達豐度就迅速上調,這說明其能快速響應鹽和干旱缺水環(huán)境,及時調控葉中脅迫相關基因的表達。上述結果表明,AcDREB2 與四翅濱藜對鹽和滲透脅迫環(huán)境的響應密切相關。

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