茍艷麗，高麗莉，吳欣欣，郭 歡，包愛科

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2. 甘肅農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林工程系，甘肅 蘭州 730020）

鹽和干旱是范圍最大、影響最廣的非生物逆境脅迫，也是限制全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的兩大主要因素。鹽和干旱脅迫都會(huì)引起細(xì)胞失水，破壞細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)平衡，致使細(xì)胞內(nèi)生理生化代謝紊亂，嚴(yán)重影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。為了在日趨惡劣的環(huán)境中生存和繁殖，陸地植物進(jìn)化出復(fù)雜的調(diào)控系統(tǒng)來響應(yīng)脅迫信號(hào)以提高植物的適應(yīng)能力。在鹽和干旱脅迫下，很多抗逆相關(guān)基因被大量誘導(dǎo)表達(dá)，其中脫水應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(DREB)就在這個(gè)過程中發(fā)揮重要作用。1997 年，Stockinger 等[1]通過酵母單雜交方法首次從擬南芥(Arabidopsis thaliana)中克隆出能夠與DRE 順式作用元件結(jié)合的蛋白編碼基因CBF1 (Crepeat/DRE Binding Factor 1)。Liu 等[2]從擬南芥中分離出DREB1A 和DREB2A 兩個(gè)基因，通過凝膠移位分析與反式激活實(shí)驗(yàn)證明，DREB1A 與DREB2A 均能與DRE 順式作用元件高度特異性結(jié)合，DREB1A能夠被冷脅迫快速誘導(dǎo)表達(dá)，DREB2A 能夠被干旱和高鹽快速誘導(dǎo)表達(dá)。

目前對(duì)于 DREB 功能的研究大多集中在模式植物擬南芥與抗逆能力有限的作物中，大量研究已證實(shí)將 DREB 基因在擬南芥或作物中超表達(dá)，能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)干旱、鹽堿、低溫等各種非生物脅迫的抗性。但是關(guān)于 DREB 在旱生、鹽生植物中的功能研究目前尚少。四翅濱藜(Atriplex canescens)是一種多年生 C4半常綠灌木，具有速生、耐干旱、耐貧瘠、抗鹽堿等優(yōu)良特性，由于其粗蛋白含量高，適口性好，是改良牧場(chǎng)和水土保持的優(yōu)良樹種[3]。Pan 等[4]研 究 表 明，100 mmol·L?1NaCl 可 以 促 進(jìn) 四翅濱藜的生長(zhǎng)，且當(dāng) NaCl 濃度達(dá)到 400 mmol·L?1時(shí)，四翅濱藜的生長(zhǎng)并沒有受到顯著抑制。四翅濱藜也具有一定的抗旱能力，在重度干旱脅迫下，四翅濱藜合成的干物質(zhì)的量是花棒(Hedysarum scoparium)、檸條(Caragana korshinskii)、楊柴(Hedysarum mongolicum)等6 種旱生灌木中最大的[5]。前期關(guān)于四翅濱藜抗逆機(jī)理的研究主要集中在生態(tài)恢復(fù)、種子萌發(fā)、生理適應(yīng)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)等方面[4,6-8]，轉(zhuǎn)錄因子在其抗逆過程中的功能尚鮮見報(bào)道。

鑒于此，本研究克隆了四翅濱藜脫水響應(yīng)元件結(jié)合蛋白編碼基因AcDREB2 全長(zhǎng)cDNA，并對(duì)其序列進(jìn)行分析，有望揭示AcDREB2 在四翅濱藜抗逆過程中的作用，從而為挖掘四翅濱藜中蘊(yùn)含的抗逆基因資源、并將其應(yīng)用于作物和牧草抗逆性的遺傳改良奠定重要基礎(chǔ)[9]。

1 材料與方法

1.1 植物材料

本研究所用四翅濱藜種子采自寧夏回族自治區(qū)靈武縣。根據(jù)Pan 等[4]的種子處理和發(fā)芽方法將四翅濱藜發(fā)芽苗移栽至含有蛭石的穴盤中，用1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)4 周。培養(yǎng)室溫度為25～28 ℃，光照條件為800 μmol·(m2·s)?1、16 h (晝)/8 h (夜)。

1.2 總RNA 提取及其反轉(zhuǎn)錄

剪取4 周齡四翅濱藜的葉片，放入液氮迅速冷凍后，參照北京天根RNA prep Pure Plant Kit 操作說明書提取總RNA，通過NanoDrop1000 核酸蛋白檢測(cè)儀檢測(cè)RNA 質(zhì)量及濃度，利用凝膠電泳檢測(cè)其完 整 性。隨 后 用TAKARA PrimeScript Ⅱ 1st strand cDNA 合成試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄得到cDNA 第一鏈。

1.3 AcDREB 基因全長(zhǎng)克隆

利用DNAMAN 6.0 軟件，根據(jù)NCBI 上其他植物AcDREB 同源基因的保守氨基酸序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物(上游引物：TGGGGKAARTGGGTYGCHGARATYCG；下游引物：ACDGADGARTGNAGWGGYTTRTA)，預(yù)測(cè)其核心片段長(zhǎng)度為215 bp。用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase 試劑盒(Thermo，北京)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物后，按照StarPrep Gel Extraction Kit (GenStar)說明書回收和純化目的片斷，送蘇州金唯智(GENEWIZ)測(cè)序。

根據(jù)已獲得的四翅濱藜AcDREB2 基因核心片段序列，采用RACE 法分別克隆該基因的5′-和3′-序列。最后用MEGA5 軟件將核心片段、3′-及5′-序列進(jìn)行拼接后獲得全長(zhǎng)cDNA 序列。5′-克隆步驟如下：根據(jù)得到的核心片段序列，用DNAMAN 6.0 和Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)5′-特異性巢式引物外側(cè)P1 和內(nèi)側(cè)P2 (表1)，RACE 試劑盒自帶巢式引物分別為外側(cè)P3 和內(nèi)側(cè)P4 (表1)。擴(kuò)增時(shí)首先以5′-RACE cDNA 為模板，用引物P1 與P3 進(jìn)行擴(kuò)增得到外側(cè)PCR 產(chǎn)物，然后以此為模板，再用引物P2 與P4 進(jìn)行擴(kuò)增得到內(nèi)側(cè)PCR 產(chǎn)物。外側(cè)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃20 s，30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。內(nèi)側(cè)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：98 ℃ 30 s；98 ℃ 10 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。3′-克隆步驟如下：同樣根據(jù)核心片段設(shè)計(jì)3′-特異性巢式引物外側(cè)P5 和內(nèi)側(cè)P6。擴(kuò)增時(shí)首先以3′-RACE cDNA為模板，用引物P5 與P3 擴(kuò)增得到外側(cè)PCR 產(chǎn)物，然后以此為模板，再用引物P6 與P4 擴(kuò)增得到內(nèi)側(cè)PCR 產(chǎn)物。外側(cè)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：98 ℃ 30 s；98 ℃10 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 23 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。內(nèi)側(cè)PCR 擴(kuò)增反應(yīng)程序：98 ℃ 30 s；98 ℃10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，30 個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

表1 5′ -和3′ -RACE 所用引物Table 1 Primers for the 5′ - and 3′ - RACE analysis

1.4 序列分析

在GenBank 中進(jìn)行序列BLAST 比對(duì)，用DNAMAN 6.0 進(jìn)行序列同源性分析、翻譯、氨基酸序列比對(duì)以及系統(tǒng)進(jìn)化樹制作，在NCBI SMART 中進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.5 基因表達(dá)模式分析

依據(jù)AcDREB2 全長(zhǎng)CDS 序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物(上游引物：TCACTGGGGTAAATGGGTCG；下游引物：TGTAAGCCGCCTTGTCGTAA)，通過Real-time PCR 對(duì)1/2 Hoagland 營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)4 周的四翅濱藜幼苗根、莖、葉中AcDREB2 表達(dá)量進(jìn)行分析。隨后，將4 周的四翅濱藜幼苗分別用100 和300 mmol·L?1NaCl 處理以及?0.27 和?0.54 MPa 的滲透脅迫(滲透脅迫試劑為山梨醇)處理0、0.5、1、3、6、12、24 h后取葉樣，進(jìn)行AcDREB2 的表達(dá)模式分析。各樣品重復(fù)3 次，以四翅濱藜AcActin 基因?yàn)閮?nèi)參(上游引物：AAGAACTACGAGCTACCTGACGG；下游引物：GATACCAGAAGATTCCATTCCAAC)，Real-time PCR參照SYBR Premix Ex TaqTM II (TAKARA)試劑盒說明進(jìn)行，以反轉(zhuǎn)錄好并用ddH2O 稀釋10 倍后的cDNA為模板，進(jìn)行Real-time PCR 反應(yīng)。按照2???Ct相對(duì)定量法計(jì)算表達(dá)量，采用獨(dú)立樣本T 檢驗(yàn)分析對(duì)照和處理?xiàng)l件下表達(dá)量的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 四翅濱藜AcDREB2 基因全長(zhǎng)cDNA 克隆及序列分析

通過簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增得到核心序列長(zhǎng)度為215 的條帶(圖1a)，與預(yù)測(cè)長(zhǎng)度一致。以此序列為基礎(chǔ)利用RACE 法獲得5′-和3′-序列，分別為234 和509 bp 的cDNA (圖1b, c)。

圖1 AcDREB2 基因核心片段(a)、5′-RACE (b)和3′-RACE (c)克隆Figure 1 The core fragment, 5′- and 3′- end fragments of AcDREB2

將以上3 段序列進(jìn)行拼接后得到總長(zhǎng)度為867 bp，且3′-具有完整的Poly (A)尾巴的cDNA 序列(圖2)。將此全長(zhǎng)序列在NCBI 中BLAST 比對(duì)發(fā)現(xiàn)，該基因與其他植物DREB2 基因具有較高的同源性，故命名為AcDREB2。將全長(zhǎng)序列進(jìn)行氨基酸翻譯后，發(fā)現(xiàn)該基因包含19 bp 的5′-非翻譯區(qū)(untranslated region:UTR)，119 bp 的3′-非翻譯區(qū)及729 bp 的開放閱讀框(open reading frame: ORF)，共編碼242 個(gè)氨基酸(圖2)。

圖2 AcDREB2 基因的核苷酸序列及其編碼氨基酸序列Figure 2 Nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of AcDREB2

2.2 AcDREB2 氨基酸序列的同源性比較與結(jié)構(gòu)域分析

將AcDREB2 與其他植物DREB 氨基酸序列進(jìn)行多重比較分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白具有高度保守的典型AP2/EREBP 結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域中包含3 個(gè)β 折疊和1 個(gè)α 螺旋，其中第14 位是保守的纈氨酸殘基(V)，19 位為亮氨酸殘基(L)，與其他植物DREB 的保守氨基酸位點(diǎn)相一致(圖3)。利用在線軟件NCBI SMART 預(yù)測(cè)AcDREB2 蛋白結(jié)構(gòu)域，顯示起始密碼子之后第41-104 區(qū)域中含有一個(gè)典型的AP2 保守結(jié)構(gòu)域，并存在兩個(gè)低復(fù)雜區(qū)(low-complexity region)(圖4)。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用DNAMAN 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，發(fā)現(xiàn)AcDREB2 與同科植物地中海濱藜AhDREB2 和榆錢菠菜AhoDREB2 同源性最高，分別高達(dá)96%和93%；與同為鹽生植物的鹽地堿蓬SsDREB2 的相似度也較高，達(dá)到72%；與其他荒漠植物如野菊CiDREB1-2 和檸條CkDREB2 等的相似度再38%以上；此外，與大豆GmDREB2、小麥TaDREB2 和玉米ZmDREB2b 等作物和模式植物擬南芥AtDREB2A的同源性都較低(圖5)。

2.4 AcDREB2 表達(dá)的組織特異性分析

用Real-time PCR 的方法分析AcDREB2 基因在4 周齡四翅濱藜幼苗根、莖、葉各組織中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，AcDREB2 在四翅濱藜各組織中均有表達(dá)，其中在葉中的表達(dá)量最高，莖中最低(圖6)。因此，后續(xù)選取表達(dá)豐度最高的葉組織樣進(jìn)行各脅迫處理下AcDREB2 的表達(dá)模式分析。

2.5 NaCl 和滲透脅迫處理下AcDREB2 在四翅濱藜葉中的表達(dá)模式

100 和300 mmol·L?1NaCl 處理不同時(shí)間(0、0.5、1、3、6、12 和24 h)后，AcDREB2 在四翅濱藜葉中的表達(dá)模式如圖7 所示。低鹽(100 mmol·L?1NaCl)和高鹽(300 mmol·L?1NaCl)處理后，AcDREB2的表達(dá)模式類似，表達(dá)量均隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增高，直至處理3 h 時(shí)達(dá)到峰值，為處理前表達(dá)量的2 倍以上(圖8)。由此可見，葉中AcDREB2 的表達(dá)受NaCl處理的顯著誘導(dǎo)。

圖3 AcDREB2 與其他植物DREB 氨基酸序列多重比較Figure 3 Amino acid sequence alignment of AcDREB2 with DREBs from other plants

圖4 AcDREB2 功能域分析Figure 4 Functional domain analysis of AcDREB2

滲透脅迫處理下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，AcDREB2在四翅濱藜葉中的相對(duì)表達(dá)量總體上呈先上升后下降的趨勢(shì)，但其表達(dá)量峰值因滲透脅迫程度不同而有所差異；?0.27 MPa 輕度滲透脅迫下，AcDREB2的表達(dá)量在處理3 和6 h 時(shí)均大幅增加，其中處理6 h時(shí)達(dá)到峰值且比處理前高出2.8 倍；而?0.54 MPa重度滲透脅迫下，AcDREB2表達(dá)量在處理3 h 時(shí)達(dá)到最高(圖8)。由此可見，AcDREB2 的表達(dá)受滲透脅迫處理(尤其是輕度滲透脅迫)的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。

3 討論與結(jié)論

已有研究表明，植物在遭遇干旱、低溫、高鹽等逆境脅迫時(shí)會(huì)產(chǎn)生一系列應(yīng)答反應(yīng)，這些反應(yīng)受植物體內(nèi)多種因素的調(diào)節(jié)，其中轉(zhuǎn)錄因子可以激活很多靶基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，進(jìn)而使下游靶基因發(fā)揮作用[10-12]。目前從各種植物中已克隆出許多抗逆基因，這些抗逆基因可以一定程度的提高植物的某些抗性，但是對(duì)其上游轉(zhuǎn)錄激活區(qū)的研究較少，從而不能全面的分析植物的抗逆機(jī)制。植物中DREB 轉(zhuǎn)錄因 子(dehydration reesponsive element binding protein)在調(diào)控功能基因表達(dá)與非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有非常重要的作用，當(dāng)其受到逆境脅迫時(shí)，該蛋白編碼基因會(huì)與DRE/CRT 順式作用元件結(jié)合，并激活下游相應(yīng)功能基因的表達(dá)[13]。因此，轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆機(jī)制中發(fā)揮的作用不容忽視。

圖5 AcDREB2 的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Figure 5 Phylogenetic tree analysis of AcDREB2

圖6 AcDREB2 在4 周齡四翅濱藜根、莖、葉中的相對(duì)表達(dá)量Figure 6 Relative expression levels of AcDREB2 in roots,stems, and leaves of four-week-old Atriplex canescens seedlings

圖7 NaCl 處理下AcDREB2 在四翅濱藜葉中的表達(dá)模式Figure 7 Expression pattern of AcDREB2 in Atriplex canescens leaves under NaCl treatments

圖8 滲透脅迫下AcDREB2 在四翅濱藜葉中的表達(dá)模式Figure 8 Expression pattern of AcDREB2 in A. canescens leaves under osmotic stress

本研究從鹽生植物四翅濱藜中克隆到一個(gè)DREB類轉(zhuǎn)錄因子家族成員的編碼基因 AcDREB2，在豐富了基因資源信息庫(kù)的同時(shí)，以期為深入探究該類植物的抗逆機(jī)制奠定基礎(chǔ)。該基因編碼氨基酸序列的全長(zhǎng)為867 bp，共編碼242 個(gè)氨基酸。進(jìn)一步對(duì)其氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其含有該類基因特有的AP2/EREBP 保守結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)低復(fù)雜區(qū)(low complexity region)，這種低復(fù)雜區(qū)普遍存在于該類蛋白中，能促進(jìn)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，有時(shí)也會(huì)呈現(xiàn)出彈性結(jié)構(gòu)以便與其他多種蛋白質(zhì)結(jié)合共同發(fā)揮功能。而AP2 保守結(jié)構(gòu)域中包含1 個(gè)α 螺旋和3 個(gè)β 折疊結(jié)構(gòu)，整個(gè)結(jié)構(gòu)域中由64 個(gè)氨基酸殘基組成，這與已經(jīng)報(bào)道的其他同科植物和抗逆性強(qiáng)的荒漠植物中DREB 蛋白保守結(jié)構(gòu)域特征相符合[14-16]。研究表明，DREB 的AP2/EREBP 保守結(jié)構(gòu)域中第14 位是保守的纈氨酸殘基(V)，第19 位是保守的谷氨酸殘基(G)，在該蛋白與特異性的順式元件結(jié)合過程中起關(guān)鍵作用[17]。在本研究結(jié)果中，AcDREB2 的AP2 保守結(jié)構(gòu)域第14 位同樣是纈氨酸殘基(V14)，而第19 位是亮氨酸殘基(L19)。研究發(fā)現(xiàn)，將擬南芥AP2/ERF 結(jié)構(gòu)域中第14 位的纈氨酸替換為丙氨酸后，DREB 不會(huì)與DRE 順式元件序列結(jié)合，導(dǎo)致DREB 轉(zhuǎn)錄因子功能喪失，而將第19 位的谷氨酸替換為天冬氨酸，DREB 仍可與DRE順式元件相結(jié)合，正常發(fā)揮功能[18]。因此，AcDREB2 AP2 保守結(jié)構(gòu)域中第14 位保守的纈氨酸殘基是決定其功能的關(guān)鍵氨基酸，在與對(duì)應(yīng)元件特異性結(jié)合中發(fā)揮重要作用，而第19 位的亮氨酸很可能并不會(huì)影響到該蛋白與DRE 順式元件的結(jié)合。因此，推測(cè)AcDREB2 可以正常激活轉(zhuǎn)錄，參與調(diào)控下游相關(guān)報(bào)告基因的表達(dá)。

同源性比對(duì)及進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，四翅濱藜AcDREB2 與同屬植物地中海濱藜AhDREB2和榆錢菠菜AhoDREB2 的同源關(guān)系最近，分別高達(dá)96%和93%以上；與同科植物鹽地堿蓬SsDREB2的同源性達(dá)到72%；此外，與其他荒漠植物檸條等的同源性也較高。這表明AcDREB2 很可能與親緣關(guān)系相近的植物中的同源基因具有相似功能。研究發(fā)現(xiàn)，鹽地堿蓬SsDREB2 能特異性結(jié)合DRE 順式元件，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能，且在煙草中超表達(dá)SsDREB2顯著提高了植株的耐鹽抗旱性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株中與非生物脅迫響應(yīng)相關(guān)的6 個(gè)功能基因的表達(dá)量顯著高于野生型[19-20]。這表明DREB 轉(zhuǎn)錄因子可以通過調(diào)控干旱和高鹽等脅迫響應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)，提高植物對(duì)逆境環(huán)境的適應(yīng)能力。因此推斷四翅濱藜AcDREB2 在其響應(yīng)高鹽干旱環(huán)境的過程中發(fā)揮重要作用。

通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法分析了AcDREB2在四翅濱藜響應(yīng)鹽和滲透脅迫中的表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AcDREB2 主要在四翅濱藜葉中發(fā)揮作用(圖8)，這可能與四翅濱藜在鹽和干旱條件下能通過葉片表面鹽囊泡將多余Na+排出體外以提高植株在脅迫環(huán)境中的保水能力和光合能力，從而提高其抗逆性有關(guān)[4,21]。此外，在鹽和滲透脅迫處理3 h 后，AcDREB2的表達(dá)豐度就迅速上調(diào)，這說明其能快速響應(yīng)鹽和干旱缺水環(huán)境，及時(shí)調(diào)控葉中脅迫相關(guān)基因的表達(dá)。上述結(jié)果表明，AcDREB2 與四翅濱藜對(duì)鹽和滲透脅迫環(huán)境的響應(yīng)密切相關(guān)。