董萬清，閆智臣，鄧 杰，李應(yīng)德，丁婷婷，段廷玉

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 /蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020）

菌根是植物根系在漫長進(jìn)化過程中與土壤真菌構(gòu)建的互惠共生體，作為生態(tài)保護(hù)和農(nóng)牧業(yè)發(fā)展的重要參與者，其在經(jīng)濟(jì)、社會(huì)和生態(tài)方面均發(fā)揮著不可替代的作用[1]。菌根真菌作為菌根共生體的關(guān)鍵性要素，受到學(xué)者的廣泛關(guān)注，尤其是叢枝菌根(arbuscular mycorrhizal, AM)真菌，可與80%的陸地植物構(gòu)建共生關(guān)系[2]，且對生存環(huán)境要求較低，在森林、草原、沙漠、農(nóng)田、河漫灘、鹽堿地、工業(yè)污染區(qū)等各種環(huán)境條件下均能存活[3-9]，不僅能促進(jìn)植物生長[10-11]、優(yōu)化根系養(yǎng)分吸收[12-13]、改善土壤結(jié)構(gòu)[14]、增強(qiáng)植物抗逆性(抗病性、抗旱性、耐鹽性、耐金屬性等)[15-18]，還可參與調(diào)控所處生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和生產(chǎn)力[19-20]，在生態(tài)系統(tǒng)中承擔(dān)著極其重要的角色。因此，AM 真菌資源調(diào)查日益受到國際社會(huì)的重視[21]。

我國是世界上物種多樣性最高的國家之一，截止2018 年，國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)AM 真菌虛擬種145 個(gè)，涵蓋8 科12 屬，約占全球已知AM 真菌的42%，這表明我國貯藏著豐富的AM 真菌資源，具有巨大的開發(fā)潛力和應(yīng)用價(jià)值[22]。近年來，諸多學(xué)者在全國范圍內(nèi)展開AM 真菌資源分布、物種多樣性、群落特征、發(fā)生規(guī)律等相關(guān)調(diào)查研究[6,9]，以便全面了解和掌握各地區(qū)AM 真菌資源現(xiàn)狀。然而，我國國土面積遼闊，氣候類型復(fù)雜，植被多樣性高，極易受小氣候影響而形成特殊生態(tài)系統(tǒng)，所以尚有諸多地區(qū)未進(jìn)行AM 真菌資源調(diào)查，且AM 真菌多樣性在不同氣候、生境下的分布差異較大，因此，要全面掌握我國AM 真菌多樣性的整體情況，仍需要進(jìn)行大量的調(diào)查研究[22]。

甘肅省興隆山國家級自然保護(hù)區(qū)地處東亞內(nèi)陸，因其地理位置的獨(dú)特性，被稱為隔離的“林島”[23]。作為森林生態(tài)系統(tǒng)，保護(hù)區(qū)內(nèi)植物資源豐富，現(xiàn)存高等植物1 022 種，常形成喬灌草混合林帶，被稱為甘肅境內(nèi)植物資源“基因庫”[23]。而植物多樣性往往與AM 真菌多樣性密切相關(guān)，兩者間存在著積極的作用[2,24]。因此，保護(hù)區(qū)內(nèi)可能蘊(yùn)藏著豐富的AM 真菌資源，且其在維持和保護(hù)當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定和發(fā)展方面可能發(fā)揮著重要作用，但目前尚缺乏該方面的基礎(chǔ)資料，所以有必要開展相關(guān)AM 真菌多樣性調(diào)查工作。

基于此，本研究以興隆山自然保護(hù)區(qū)為研究地，在不同海拔高度開展AM 真菌資源分布及多樣性調(diào)查工作，以期為興隆山AM 真菌資源應(yīng)用提供數(shù)據(jù)資料，并豐富已知AM 真菌種質(zhì)資源庫，為后續(xù)研究工作的開展奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

甘肅省興隆山國家級自然保護(hù)區(qū)是蘭州市榆中縣(103°50′ ? 104°10′ E, 35°38′ ? 35°58′ N)重要的生態(tài)屏障，受地形和海拔的影響，保護(hù)區(qū)內(nèi)氣候差異較大，年平均氣溫3～7 ℃，年均降水量為340～520 mm[25-26]。植被種類豐富，主要有青杄(Picea wilsonii)、小檗(Berberis thunbergii)、珍珠梅(Sorbaria sorbifolia)、白蓮蒿(Artemisia sacrorum)等。興隆山是保護(hù)區(qū)內(nèi)三大山脈(興隆山、馬銜山和棲云山)之一，分為東、西兩峰，海拔約2 500 m。

1.2 樣品采集

本研究以植被豐富的興隆山東山(喬灌草混合林帶)為研究樣地，選取2 000～2 600 m 海拔區(qū)域，于2019 年8 月按縱軸方向自下而上采集土壤樣品共計(jì)40 份。樣地以海拔高度為基準(zhǔn)，選取了8 個(gè)海拔梯度，各海拔間間隔約50 m，從低到高依次為2 168、2 209、2 261、2 313、2 361、2 408、2 466 和2 601 m。不同海拔梯度內(nèi)設(shè)置5 個(gè)樣點(diǎn)，各樣點(diǎn)按等邊三角形三點(diǎn)取樣，采集0 - 10 cm 表層土壤，過2 mm 土壤篩后，將3 個(gè)分樣品混合均勻，取一定量土壤于2 mm 離心管內(nèi)，準(zhǔn)確編號后帶回實(shí)驗(yàn)室，置于?80 ℃冰箱保存，后送至北京百邁客生物科技有限公司測序。

1.3 AM 真菌多樣性測序

1.3.1 土壤DNA 提取及PCR 擴(kuò)增

采用MN NucleoSpin 96 Soi 試劑盒法提取土壤樣品基因組DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 提取效果，并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。第一次PCR：取適量DNA 樣品，用無菌水稀釋至1 ng·μL?1，以其為DNA模板，根據(jù)選定的測序區(qū)域，使用特異性引物AMV4.5NF-AAGCTCGTAGTTGAATTTCG、AMDGRCCCAACTATCCCTATTAATCAT 進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)熱5 min；25 個(gè)循環(huán)：95 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；72 ℃延伸10 min。

第二次PCR：對上述目標(biāo)區(qū)域PCR 純化產(chǎn)物進(jìn)行稀釋，并以其為模板進(jìn)行PCR，98 ℃預(yù)熱30 s；10個(gè)循環(huán)：98 ℃變性10 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增完成后，對其產(chǎn)物進(jìn)行1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。根據(jù)PCR 產(chǎn)物濃度進(jìn)行1 : 1 等量混樣，并利用OMEGA DNA 純化柱純化，于1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，后進(jìn)行切膠回收。

1.3.2 上機(jī)測序及數(shù)據(jù)處理

AM 真 菌 多 樣 性 檢 測 選 擇 Illumina HiSeq 測 序平臺(tái)，測序結(jié)束后選用FLASH[27](version 1.2.11)和Trimmomatic[28](version 0.33)軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行雙端拼接及質(zhì)量過濾，獲得高質(zhì)量Tags 序列，之后通過UCHIME[29](version 8.1)軟件完成嵌合體清除過程，獲得有效數(shù)據(jù)。

1.3.3 物種注釋和分類學(xué)分析

采用Usearch 軟件[30]在97%的相似度水平下對優(yōu)化序列進(jìn)行聚類，以測序所有序列數(shù)的0.005%為閾值過濾OTU，并結(jié)合NCBI 和MaarjAM 數(shù)據(jù)庫信息，對其代表序列進(jìn)行物種注釋，以確定不同分類水平下(門Phylum, 綱Class, 目Order, 科Family, 屬Genus,種Species)各樣品中AM 真菌的群落構(gòu)成及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

使用R 3.6.1 軟件[31]計(jì)算樣品物種水平Alpha 多樣性指數(shù)；利用Excel[32]柱狀堆積圖和餅狀圖分別表示AM 真菌相對豐度和物種組成；采用SPSS 22.0[33]單因素方差分析和多重比較的檢驗(yàn)方法比較不同海拔間AM 真菌多樣性指數(shù)的差異，Spearman 相關(guān)性分析描述AM 真菌多樣性指數(shù)與海拔因子的相關(guān)性；運(yùn)用MEGA 7[31]繪制不同AM 真菌系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM 真菌種屬分類

在一定范圍內(nèi)，隨著測序條數(shù)的加大，稀釋曲線總體上趨于平緩(圖1)，說明本研究測序數(shù)據(jù)量足以反映當(dāng)?shù)赝寥乐蠥M 真菌的基本情況，可以進(jìn)行后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

圖1 樣品稀釋曲線Figure 1 Sample rarefaction curves

本研究分離獲得AM 真菌共52 種，隸屬于4 目8 科13 屬(表1)，具體為原囊霉目(Archaeosporales)2 科2 屬，多樣孢囊霉目(Diversisporales) 3 科4 屬，球 囊 霉 目(Glomerales) 2 科6 屬， 類 球 囊 霉 目(Paraglomerales) 1 科1 屬。通過對測序OTU 代表序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫比對，采用鄰接法(Neighbor-joining)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析(圖2、圖3)，鑒定為球囊霉屬(Glomus) 20 種，原 囊 霉 屬 (Archaeospora) 9 種，類球 囊 霉 屬 (Paraglomus) 6 種， 近 明 球 囊 霉 屬(Claroideoglomus) 5 種，多樣孢囊霉屬 (Diversispora)3 種，硬 囊 霉 屬 (Sclerocystis) 2 種，雙 型 囊 霉 屬(Ambispora)、無梗囊霉屬 (Acaulospora)、盾巨孢囊霉屬 (Scutellospora)、巨孢囊霉屬 (Gigaspora)、多氏囊霉屬 (Dominikia)、根孢囊霉屬 (Rhizophagus)和斗管囊霉屬 (Funneliformis)各1 種。但部分菌種系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育并不完全符合規(guī)律，如球囊霉屬的Glomus sp.2、Glomus sp.6、Glomus sp.8、Glomus sp.10、Glomus sp.11 和Glomus sp.12，其在進(jìn)化樹中與其他同屬菌種并未聚在同一分支(圖3)。

表1 Arbuscular mycorrhizal (AM)真菌種屬分類Table 1 Classification of arbuscular mycorrhizal fungal species

續(xù)表1Table 1 (Continued)

圖2 屬水平上arbuscular mycorrhizal 真菌的物種數(shù)目Figure 2 The number of arbuscular mycorrhizal fungal species at the genus level

2.2 AM 真菌豐度及海拔分布特征

2.2.1 不同海拔梯度AM 真菌資源分布

興隆山東山地區(qū)AM 真菌資源分布總體上表現(xiàn)為：優(yōu)勢種屬和特有種屬隨海拔變化呈現(xiàn)規(guī)律性分布，其余各屬種則均勻分布于不同海拔梯度。屬水平上，從低海拔到高海拔，AM 真菌優(yōu)勢屬由球囊霉屬逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轭惽蚰颐箤?除2 168 m 海拔梯度)，其中球囊霉屬在2 209～2 313 m海拔范圍內(nèi)為優(yōu)勢屬，分別占各海拔的73.87%、81.23%和47.10%，類球囊霉屬為2 361～2 601 m 海拔優(yōu)勢屬，占各海拔的72.50%～89.41%；無梗囊霉屬和巨孢囊霉屬為部分海拔特有屬(圖4)。

不同海拔梯度AM 真菌種水平上組成存在差異(表2)。類球囊霉屬sp.2、球囊霉屬sp.8 和近明球囊霉屬sp.1 為該地區(qū)不同海拔優(yōu)勢種，其類球囊霉屬sp.2 為各海拔共有優(yōu)勢種(除2 261 m 海拔外)，球囊霉屬sp.8 在2 209～2 313 m 和2 466 m 海拔內(nèi)為優(yōu)勢種，近明球囊霉屬sp.1 為2 313 m 海拔優(yōu)勢種。蜜色無梗囊霉、球狀巨孢囊霉、白色球囊霉、球囊霉屬sp.1、球囊霉屬sp.4 和彎絲硬囊霉僅在部分海拔梯度出現(xiàn)，分別為不同海拔特有種。

2.2.2 不同海拔AM 真菌多樣性

不同海拔AM 真菌多樣性指數(shù)(表3)顯示，測序文庫覆蓋度均在0.999 9 以上，測序結(jié)果準(zhǔn)確可靠。在97%相似性水平下，沿低海拔至高海拔梯度，Chao1 和ACE 指數(shù)總體上呈現(xiàn)出先增后減的變化趨勢(除2 168 m 海拔外)，且在2 361 m 海拔梯度達(dá)到峰值。其中，在2 361 m 時(shí)，Chao1 指數(shù)極顯著高于2 209、2 408 和2 466 m (P ＜ 0.01)，ACE 指數(shù)顯著高于2 408 m (P ＜ 0.05)。Simpson 指數(shù)和Shannon指數(shù)在不同海拔間差異均不顯著，表明各海拔梯度物種多樣性組成相似。

2.3 AM 真菌分布與海拔高度相關(guān)性

圖3 Arbuscular mycorrhizal 真菌系統(tǒng)進(jìn)化樹Figure 3 A phylogenetic tree of arbuscular mycorrhizal fungi

圖4 Arbuscular mycorrhizal 真菌屬水平相對豐度Figure 4 The relative abundance of arbuscular mycorrhizal fungi at the genus level

利用AM 真菌豐富度和多樣性指數(shù)(Chao1、ACE、Shannon 和Simpson 指數(shù))與海拔高度進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果表明各指數(shù)與海拔間相關(guān)系數(shù)依次為?0.291, ?0.277, 0.026 和?0.041，均未達(dá)到顯著水平(P ＞ 0.05)，說明該地區(qū)AM 真菌資源分布受海拔因子的影響較小，兩者間不具有直接的相關(guān)性。

3 討論

興隆山自然保護(hù)區(qū)作為甘肅蘭州榆中縣的“綠色巖島”，因其獨(dú)特的地理位置，對當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)穩(wěn)定、物質(zhì)循環(huán)、能量流動(dòng)等方面具有重要意義，保護(hù)區(qū)基于氣候、海拔、土壤等多種環(huán)境因子綜合調(diào)控，孕育了豐富的生物資源[34-35]。本研究首次對興隆山東山AM 真菌資源多樣性進(jìn)行調(diào)查研究，并分析了海拔高度對其種屬分布的影響，研究結(jié)果是對我國AM 真菌資源分布情況的有益補(bǔ)充。

利用AM 真菌最新分類系統(tǒng)對高通量測序結(jié)果進(jìn)行種屬鑒定，發(fā)現(xiàn)研究區(qū)內(nèi)AM 真菌可分為4 目8 科13 屬52 種，約占我國已知AM 真菌總數(shù)的三分之一，說明興隆山東山AM 真菌資源較豐富。因此，后續(xù)工作應(yīng)擴(kuò)大調(diào)查范圍，對興隆山自然保護(hù)區(qū)其余地區(qū)深入開展資源調(diào)查工作，以全面了解和掌握該地區(qū)的AM 真菌資源狀況，豐富我國已知AM 真菌種質(zhì)資源數(shù)據(jù)庫。

不同AM 真菌對環(huán)境因子的適應(yīng)性不同，常因環(huán)境條件的差異而呈現(xiàn)不均衡分布[36]。本研究表明，興隆山東山不同海拔梯度下AM 真菌優(yōu)勢種屬隨海拔變化呈現(xiàn)規(guī)律性變化，其中球囊霉屬在2 209～2 313 m 海拔為優(yōu)勢屬。尚昆等[37]對梵凈山不同海拔AM 真菌多樣性的研究表明，球囊霉屬在梵凈山地區(qū)主要分布于1 800 m 海拔以下地區(qū)，在2 100～2 200 m 海拔范圍內(nèi)未見其分布，而蔡曉布和彭岳林[38]研究發(fā)現(xiàn)，球囊霉屬可在西藏高原2 200～5 300 m 海拔地區(qū)廣泛分布，說明AM 真菌在水平和垂直方向的種屬分布可能受海拔及由此引致的溫度等因素的調(diào)控，且球囊霉屬具有較為廣泛的生態(tài)適應(yīng)性，可分別在低、中、高海拔地區(qū)生存。

諸多研究表明，同一研究區(qū)內(nèi)，不同海拔梯度下AM 真菌豐富度及物種多樣性存在顯著差異[38-39]。本研究中AM 真菌豐富度指數(shù)在部分海拔間存在顯著差異，且隨海拔變化呈現(xiàn)出“單峰”分布，但物種多樣性指數(shù)在不同海拔梯度間差異較小，未表現(xiàn)出顯著差異。Gai 等[40]對西藏高原地區(qū)AM 真菌多樣性研究發(fā)現(xiàn)，隨海拔高度的增加，AM 真菌物種多樣性指數(shù)無明顯變化，這與本研究結(jié)果保持一致，但尚昆等[37]和Wu 等[41]對梵凈山和富士山AM 真菌群落相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，AM 真菌多樣性隨海拔的增加分別呈現(xiàn)出增加和減少的趨勢。由此可見，不同地區(qū)AM 真菌多樣性分布隨海拔變化的分布狀況不盡一致。與此類似，研究區(qū)不同，海拔高度對AM 真菌豐富度指數(shù)的影響也不同。李曉亮[42]對藏東南地區(qū)海拔對AM 真菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)影響的研究發(fā)現(xiàn)，海拔可直接影響AM 真菌OTU 豐富度，而李龍等[43]在高黎貢山的研究中表示，隨海拔的升高，AM 真菌豐富度指數(shù)逐漸降低，但其原因主要是不同海拔間植物豐富度和土壤理化性質(zhì)不同而引起的變化，即海拔間接影響該地區(qū)AM 真菌物種豐富度。

表2 不同海拔arbuscular mycorrhizal 真菌物種組成Table 2 The composition of arbuscular mycorrhizal fungal species at different altitudes

續(xù)表2Table 2 (Continued)

根據(jù)不同海拔間AM 真菌多樣性分布結(jié)果分析可知，AM 真菌物種豐富度及多樣性受海拔因子的調(diào)控。本研究中，研究區(qū)內(nèi)AM 真菌資源分布特征在一定程度上受海拔變化的影響，但相關(guān)性不顯著。經(jīng)分析，原因可能有以下兩個(gè)方面：一是研究區(qū)內(nèi)海拔跨度較小，不同海拔間環(huán)境條件基本一致，不足以引起AM 真菌群落的顯著性差異。蔡曉布和彭岳林[35]對西藏高原AM 真菌群落相似度分析結(jié)果表明，同一海拔區(qū)內(nèi)，不同海拔梯度間差異越小，其AM 真菌群落特征相似性越高；Pérez 和Frangi[44]也發(fā)現(xiàn)，在草原生態(tài)系統(tǒng)中，絕對海拔低且海拔間跨度較小時(shí)，海拔對AM 真菌群落無影響。二是影響AM 真菌種屬組成及多樣性分布的環(huán)境因素較多，如植物種類、土壤有機(jī)質(zhì)、pH、溫度、降水量等，推測海拔高度可能不是直接影響興隆山東山AM 真菌資源分布的主導(dǎo)因子，但具體情況有待進(jìn)一步研究。

表3 不同海拔arbuscular mycorrhizal 真菌多樣性指數(shù)Table 3 Diversity indices for arbuscular mycorrhizal fungi at different altitudes

此外，本研究中AM 真菌資源在2 168 m 海拔梯度的分布狀況并不遵循其他海拔的變化規(guī)律，分析原因可能是該海拔位于東山旅游區(qū)入口附近，受人類活動(dòng)干擾較大，致使其AM 真菌群落隨海拔等環(huán)境因子的規(guī)律性分布遭到了破壞，應(yīng)加以保護(hù)。

4 結(jié)論

甘肅省興隆山東山AM 真菌資源豐富，約52 種，隸屬于4 目8 科13 屬，其中Glomus 和Paraglomus 為優(yōu)勢屬，Glomus albidum、Acaulospora mellea、Gigaspora margarita、 Glomus sp.1、 Glomus sp.4、 Sclerocystis sinuosa 為部分海拔特有種，上述優(yōu)勢物種及特有物種分布表現(xiàn)出了一定的海拔特異性。