（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，黑龍江 大慶 163319）

運(yùn)輸對(duì)畜牧業(yè)是一種常見的應(yīng)激源，當(dāng)動(dòng)物處于一系列負(fù)面刺激，如振動(dòng)、噪聲、環(huán)境的變化等因素，都可能導(dǎo)致應(yīng)激的發(fā)生，進(jìn)而影響動(dòng)物的生產(chǎn)性能[1]。運(yùn)輸引起的應(yīng)激已經(jīng)成為危害肉牛生產(chǎn)性能的重要元素之一。在應(yīng)激發(fā)生的過程中，機(jī)體的多種生物系統(tǒng)會(huì)響應(yīng)應(yīng)激反應(yīng)。研究表明，miRNAs與多種應(yīng)激反應(yīng)密切相關(guān)[2]。在應(yīng)激發(fā)生時(shí)，機(jī)體內(nèi)多種系統(tǒng)會(huì)作出反應(yīng)，來抵抗應(yīng)激帶來的不良影響，其中，miRNAs便是參與者之一，其通過調(diào)控靶基因翻譯過程，影響一系列蛋白表達(dá)，從而抵抗應(yīng)激反應(yīng)。了解miRNAs與應(yīng)激之間的聯(lián)系，對(duì)闡明運(yùn)輸應(yīng)激發(fā)生發(fā)展機(jī)制有著深遠(yuǎn)意義。miR-23a的表達(dá)失調(diào)會(huì)導(dǎo)致多種疾病，某些miRNA基因已被分類為癌基因或抑癌基因。此外，在應(yīng)激細(xì)胞中抑制miR-23a能夠闡釋誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一般機(jī)制，并被分子伴侶HSP70調(diào)控。miR-23a參與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程。有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-23a在結(jié)腸癌、胃癌和肺癌等腺癌中具有高表達(dá)的特性[3,4],具有調(diào)控細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和分化，和多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為具有密切相關(guān)性。miR-23a在應(yīng)激發(fā)生中可能發(fā)揮的生物學(xué)功能，是本研究的目的所在。

1 試驗(yàn)方法

1.1 材料與方法

試驗(yàn)動(dòng)物及分組試驗(yàn)與牛場(chǎng)隨機(jī)選取10頭體重相近的健康雜交肉牛分為對(duì)照組和運(yùn)輸刺激組，運(yùn)輸刺激組以單層動(dòng)物運(yùn)輸汽車運(yùn)輸進(jìn)行運(yùn)輸刺激，速度為80 km/h。運(yùn)輸過程中禁食、禁水。

1.2 高通量測(cè)序

采集肝臟組織深圳基因組學(xué)研究所的程序（BGI BGISEQ-500，中國(guó)）進(jìn)行高通量測(cè)序，制備運(yùn)輸應(yīng)激肉牛肝臟miRNA文庫(kù)。

1.3 對(duì)miR-23a進(jìn)行生物信息學(xué)分析

應(yīng)用Targetscan、miRWalk和miRTarBase三款軟件對(duì)miR-23a的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析，對(duì)miR-23a可能發(fā)揮的潛在功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，以便了解miR-23a的生物學(xué)功能。

1.4 miR-23a候選靶基因功能富集分析

利用Gene ontology(http://geneontology.org/)對(duì)miR-23a參與的生物學(xué)進(jìn)程進(jìn)行Geneontology分析，進(jìn)行靶基因的功能研究，以牛（bos taurus）基因組作為背景基因，對(duì)miR-23a靶基因參與的生物學(xué)過程進(jìn)行富集分析。從而篩選出與運(yùn)輸應(yīng)激相關(guān)性強(qiáng)的靶基因。

2 結(jié)果

2.1 肝臟組織中miR-23a表達(dá)量的變化

使用高通量測(cè)序方法檢測(cè)肉牛肝臟中miR-23a的相對(duì)表達(dá)量。與運(yùn)輸0 h組相比，運(yùn)輸6 h組肝臟組織中miR-23a表達(dá)量上升（見表1）。

表1 肉牛肝臟miR-23a表達(dá)量

2.2 Go富集分析結(jié)果

應(yīng)用Targetscan、miRWalk和miRTarBase三款軟件對(duì)miR-23a靶基因預(yù)測(cè)，Targetscan中預(yù)測(cè)到1 238種靶基因；miRWalk中預(yù)測(cè)到10 112種靶基因；miRTarBase中預(yù)測(cè)到427種靶基因。三款軟件預(yù)測(cè)到的靶基因重合情況如圖1和表2所示。

圖1 miR-23a靶基因預(yù)測(cè)統(tǒng)計(jì)圖

2.3 生物信息學(xué)分析結(jié)果

2.3.1 生物進(jìn)程 通過GO分析(http://amigo.geneontology.org/amigo/search/anno-tation) 繪制出miR-23a靶基因參與的生物進(jìn)程。如圖2所示，miR-23a主要參與14種生物過程，其中富集靶基因較多的前三項(xiàng)過程為細(xì)胞過程，代謝過程，生物調(diào)節(jié)富集靶基因這些過程均與應(yīng)激存在聯(lián)系，其中對(duì)刺激的反應(yīng)這一過程與應(yīng)激聯(lián)系密切。

圖2 miR-23a參與的生物學(xué)進(jìn)程圖

2.3.2 分子功能 通過GO分子功能分析，miR-23a主要參與7種“分子功能”過程（見圖3），包括斑點(diǎn)、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)劑、結(jié)構(gòu)分子活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子活性、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性。

表2 miR-23a的靶基因統(tǒng)計(jì)

圖3 miR-23a參與的分子功能

2.3.3 細(xì)胞組分 miR-23a主要參與11種“細(xì)胞組分”過程（見圖4），包括細(xì)胞組分、細(xì)胞、細(xì)胞外區(qū)部分、含蛋白復(fù)合物、超分子復(fù)合物。

圖4 miR-23a參與的細(xì)胞組分圖

3 討論

在集約化養(yǎng)殖發(fā)展的過程中，運(yùn)輸成為一項(xiàng)常見且危害極大的應(yīng)激原，運(yùn)輸可造成肉牛運(yùn)輸應(yīng)激綜合征等多種疾病進(jìn)而影響肉牛的健康，同時(shí)也會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，運(yùn)輸會(huì)造成肉牛發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，影響免疫力，同時(shí)造成細(xì)胞因子和應(yīng)激相關(guān)激素的變化，同時(shí)造成miRNSs表達(dá)失調(diào)，影響相關(guān)蛋白的表達(dá)。檢測(cè)肉牛肝臟中miRNAs的表達(dá)變化，可以作為評(píng)估肉牛應(yīng)激狀態(tài)的新手段。本試驗(yàn)通過高通量測(cè)序技術(shù)篩選出肉牛運(yùn)輸后差異表的miR-23a，并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。通過對(duì)靶基因的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-23a可能與HSPA13、MAP3K5、AKT3、IL6R等基因結(jié)合，從而調(diào)控其靶向蛋白的表達(dá)。研究表明，miR-23a-5p對(duì)大鼠腦缺血再灌注氧化應(yīng)激反應(yīng)具有抑制作用[5]，沉默miR-23a并過表達(dá)gls1，可以逆轉(zhuǎn)H2O2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，對(duì)細(xì)胞氧化損傷的抑制作用[6]。miR-23a參與多種疾病的發(fā)展過程，并可以調(diào)控細(xì)胞周期[7]。研究顯示，肝細(xì)胞癌組織中miR-23a-3p的表達(dá)水平明顯上調(diào)，并可以促進(jìn)肝細(xì)胞癌G1/S細(xì)胞周期轉(zhuǎn)化[8]，HSPA13家族與應(yīng)激關(guān)系密切，研究表明，HSPA13的下調(diào)會(huì)提升細(xì)胞凋亡的敏感性，促進(jìn)炎癥反應(yīng)并維持細(xì)胞存活[9]。當(dāng)運(yùn)輸刺激發(fā)生時(shí),miR-23a表達(dá)量的降低，有可能會(huì)促進(jìn)Akt基因的表達(dá)，Akt蛋白激酶在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、生理代謝等細(xì)胞生理病理活動(dòng)的調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，因此，miR-23a、HSPA13、Akt三者密切相關(guān)。李夢(mèng)雯等人研究結(jié)果顯示氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)細(xì)胞中HSPA13表達(dá)上調(diào)，通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)，HSPA13與PI3K-Akt信號(hào)通路、TGFβ信號(hào)通路相關(guān)，這與研究相符，同時(shí)HSPA13可以保護(hù)細(xì)胞，減輕氧化損傷。當(dāng)動(dòng)物處在應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，miR-23a表達(dá)發(fā)生改變，且調(diào)控HSPA13、Akt等蛋白表達(dá)來抵抗應(yīng)激的發(fā)生，減輕或避免疾病發(fā)生，因此在畜牧疾病防控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本文通過對(duì)運(yùn)輸應(yīng)激肉牛肝臟miR-23a進(jìn)行生物功能分析，能夠?yàn)槿馀?yīng)激的發(fā)生發(fā)展提供理論參考。