滿華盛 呂霞敏 黃建穎

(浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院/浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018)

碳量子點(diǎn)(carbon dots，CDs)，也稱碳點(diǎn)或碳納米點(diǎn)，是一類新興的準(zhǔn)球形熒光碳納米材料。CDs 于2004年由Xu 等[1]在鈍化單壁碳納米管過程中首次發(fā)現(xiàn)，由于其具有優(yōu)良的水溶性，光致發(fā)光性，良好的生物相容性和低毒性以及表面功能的可調(diào)性而逐漸引起關(guān)注[2]。CDs 具有普遍的共性，如紫外熒光特性就是被廣泛研究和報(bào)道的重要特性之一[3-4]。CDs 在制備過程中因其原料的不同，表面會(huì)形成不同的親水性官能團(tuán)，如羥基、氨基和羧基等，被認(rèn)為是造成其獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)的重要原因[5]。此外，CDs 的表面易于修飾，摻雜氮、硫或金屬離子都可能會(huì)進(jìn)一步改進(jìn)其光學(xué)特性，甚至增加新的功能[6]。在過去十幾年里，CDs 已被廣泛應(yīng)用于傳感器[7]方面，而良好的生物相容性和低毒性[8-9]將它與傳統(tǒng)的基于過渡金屬的量子點(diǎn)和有機(jī)染料[10-11]區(qū)分開來，非常適用于生物或食品體系。

殼聚糖是自然界中資源豐富且廉價(jià)易得的陽離子多糖，有著豐富的氮含量及表面基團(tuán)，但其難溶于水，在很大程度上限制了自身的應(yīng)用范圍，因此將其應(yīng)用于高性能氮摻雜CDs 的制備，無疑是制備環(huán)境友好型CDs 的極佳選擇。另外作為一種氮含量豐富的天然可再生資源，殼聚糖基新型氮摻雜CDs 的制備有助于拓寬CDs 和殼聚糖在各領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

過氧化氫(H2O2)是一種強(qiáng)氧化劑，主要應(yīng)用于化工、醫(yī)藥和環(huán)境等領(lǐng)域[12]，同時(shí)H2O2在許多國家被用作漂白劑、食品包裝抗菌劑和貯存用殺菌劑，如應(yīng)用于小麥粉、食用油和雞蛋等。但是，為保障H2O2處理后食品的安全性，H2O2溶液濃度應(yīng)小于3%[13]。對于食品加工來說，控制H2O2的殘留極其重要。目前，已報(bào)道多種H2O2的檢測方法，如高效液相色譜[14]、分光光度[15-16]、熒光[17-19]、化學(xué)發(fā)光[20]以及電化學(xué)[21-22]法。然而這些方法通常存在分析時(shí)間長，維護(hù)費(fèi)用高，非現(xiàn)場檢測等缺點(diǎn)，另外在綠色CDs 未被開發(fā)關(guān)注前，為使絕大多數(shù)的CDs 獲得更好的性能，會(huì)使用有毒有害的反應(yīng)原料或摻雜具有毒性的金屬離子，不利于環(huán)境保護(hù)，且限制了其在很多方面的應(yīng)用。H2O2作為生活中常用的氧化消毒劑，具有一定的毒性，尤其在食品當(dāng)中，若殘留超標(biāo)必然會(huì)對人體健康產(chǎn)生不良影響。因此，開發(fā)新型準(zhǔn)確快速檢測H2O2的方法至關(guān)重要。本研究采用殼聚糖與DL-酒石酸為反應(yīng)前體，采用水熱法制備新型CDs，并對其進(jìn)行表征測定，通過熒光響應(yīng)的手段實(shí)現(xiàn)對H2O2的快速檢測，以期為高效快速檢測食品中的H2O2提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖[Chitosan，CH，脫乙酰度91%，粘度60 mPa·s (1%，20℃)]，青島弘海生物技術(shù)有限公司；DL-酒石酸(分析純)、溴化鉀(光譜純)，上海麥克林生物化學(xué)有限公司；濃硫酸、30%雙氧水、硫酸亞鐵、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS，pH 值4.0)均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RCT 型加熱磁力攪拌器，德國IKA 公司；TDW 溫度控制儀，余姚市長江溫度儀表廠；2-16KL 高速冷凍離心機(jī)，德國西格瑪公司；-80℃超低溫冰箱，上海汗諾儀器有限公司；Labconco FreeZone 立式冷凍干燥機(jī)，美國LABCONCO 公司；EL 204-IC 電子天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；UV-2600 紫外-可見分光光度計(jì)，RF-5301 PC 熒光分光光度計(jì)，日本SHIMADZU 公司；JEM-1010 透射電子顯微鏡，日本JEOL 公司；Nicolet Nexus 870 傅里葉變換紅外光譜儀，德國Thermo 公司；PHS-3C 型pH 計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；Smart 系列純水/超純水儀，美國默克密理博。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 殼聚糖基碳量子點(diǎn)的制備 參照文獻(xiàn)[23]的方法并略作改動(dòng)。準(zhǔn)確稱取3.9 g 殼聚糖分別溶解于50 mL 0.35 mol·L-1DL-酒石酸溶液中，60℃攪拌至膠狀，將混合物放入裝有四氟乙烯內(nèi)襯的不銹鋼高壓反應(yīng)釜中，200℃水熱處理5 h。自然冷卻至室溫后，將得到的混合物于10 000 r·min-1離心30 min，上清液用0.22 μm 濾膜過濾，再參照Wen 等[24]的方法并適當(dāng)修改，在2 L 超純水中用透析袋(截留率為100～500 Da)透析純化48 h，所得樣品水溶液進(jìn)行冷凍干燥，得到淺黃色粉末，于干燥器中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 碳量子點(diǎn)的表征

1)紫外吸收光譜的測定。使用紫外-可見分光光度計(jì)測定CDs 溶液的紫外吸收光譜，掃描范圍為200～800 nm，每個(gè)樣品測定3 次。

2)熒光發(fā)射光譜的測定。使用熒光分光光度計(jì)測定CDs 溶液的熒光發(fā)射光譜，激發(fā)波長為290 ～360 nm，掃描范圍為220～900 nm，狹縫寬度為10.0 nm，每個(gè)樣品測定3 次。

3) 透射電子顯微鏡( transmission electron microscope，TEM)測定。使用TEM 觀察CDs 的表面形態(tài)。

4)傅立葉變化紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)測定。采用KBr 壓片法制樣，使用紅外光譜儀在400～4 000 cm-1的波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行測定，分辨率為4 cm-1。

5)熒光量子產(chǎn)率(fluorescence quantum yield，QY)測定。以硫酸奎寧(量子產(chǎn)率為0.54)作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分散于0.1 mol·L-1H2SO4溶液中[24]，用來測定所制備CDs 的熒光量子產(chǎn)率。分別記錄CDs 溶液和硫酸奎寧的相應(yīng)吸光度以及在相同激發(fā)波長(320 nm)下的發(fā)射峰面積。根據(jù)公式計(jì)算量子產(chǎn)率:

式中，Q 表示QY；Ⅰ表示熒光積分面積；n 表示溶劑的折射率，nCDs為水的折射率(1.33)，ns為0.1 mol·L-1H2SO4的折射率(1.33)；A 表示相應(yīng)的吸光度。下標(biāo)“s”指硫酸奎寧，下標(biāo)“CDs”指CDs 溶液。

1.3.3 不同濃度鐵離子對0.5 mg·mL-1CDs 熒光強(qiáng)度影響以及H2O2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將不同濃度0.5 mL Fe3＋溶液添加到4.5 mL CDs 溶液中，使得5 mL 混合溶液中CDs 濃度為0.5 mg·mL-1，F(xiàn)e3＋濃度分別為0、10、15、20、25、30、40、50、60、75、90、130、150、170、200、300…900、1 000 μmol·L-1，測量320 nm 波長處的熒光發(fā)射圖。再將0.5 mL Fe2＋溶液添加到4.0 mL 的CDs 溶液中，然后將提前配制好的不同濃度的H2O2溶液各0.5 mL 分別添加至4.5 mL 上述混合溶液中，至溶液的最終體積為5.0 mL，添加得到的H2O2濃度分別為0、10、15、20、25、30、40、50、60、75、90、130、150、170、200、300…900、1 000 μmol·L-1，其中Fe2＋濃度為1 mmol·L-1，CDs 濃度為0.5 mg·mL-1，充分反應(yīng)一段時(shí)間后，在室溫下記錄320 nm 激發(fā)波長下每個(gè)混合溶液的熒光發(fā)射圖譜，根據(jù)不同濃度混合溶液的熒光強(qiáng)度繪制CDs 溶液的熒光恢復(fù)圖譜。以H2O2濃度為橫坐標(biāo)，混合溶液的相對熒光強(qiáng)度作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組試驗(yàn)進(jìn)行3 次平行，采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Origin 8.0 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外吸收光譜分析

CDs 溶液(0.1 mg·mL-1)的紫外吸收光譜如圖1所示。樣品水溶液在紫外-可見光譜中的寬吸收峰出現(xiàn)在285 nm 處，該處的吸收峰屬于氮摻雜CDs 的特征吸收峰，這是由于存在sp2域(π→π*和n→π*躍遷)[25]。插圖為CDs 溶液(1.0 mg·mL-1)在日光和紫外燈波長(365 nm)照射下的光學(xué)圖片，可以清楚看到，透明的淡黃色CDs 溶液在365 nm 波長的紫外光照射下顯示出較強(qiáng)的藍(lán)色熒光，表明其具有良好的光致發(fā)光性。

圖1 CDs 溶液的紫外吸收光譜Fig.1 UV-vis spectra of CDs in aqueous solutions

2.2 熒光發(fā)射圖譜分析

由圖2 可知，當(dāng)激發(fā)波長介于290 ～320 nm 時(shí)，CDs 溶液(0.1 mg·mL-1)的熒光發(fā)射強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，在激發(fā)波長為320 nm 時(shí)達(dá)到最大。由于CDs 具有較為均勻的尺寸，發(fā)射波長并未出現(xiàn)明顯的藍(lán)移或紅移[26]。當(dāng)激發(fā)波長從320 nm 增加到360 nm 時(shí)，發(fā)射波長隨著熒光發(fā)射強(qiáng)度的減弱出現(xiàn)紅移，說明制備的CDs 具有隨激發(fā)波長而改變發(fā)射峰位置的特性[27]。樣品溶液在不同激發(fā)波長下的發(fā)射光譜證明了其多色發(fā)射的特性，這種激發(fā)依賴行為可能是因?yàn)镃Ds 在水熱碳化過程中表面上形成的羧基和氨基等官能團(tuán)充當(dāng)了激發(fā)能阱從而導(dǎo)致不同的光致發(fā)光特性[28]。

2.3 TEM 分析

圖2 CDs 溶液在不同激發(fā)波長下的熒光發(fā)射光譜Fig.2 Fluorescence emission spectra of CDs solution under the excitations with different wavelengths

TEM 是觀察納米級熒光CDs 形態(tài)的重要工具之一。由圖3 可知，透析處理所得CDs 的平均粒徑約為20 nm，且具有較寬的尺寸分布，大多數(shù)CDs 呈現(xiàn)近似圓形或橢圓形，并有少許聚集，這與前人報(bào)道一致[28]。

圖3 CDs 的透射電子顯微鏡微觀圖Fig.3 TEM images of CDs

2.4 傅立葉變化紅外光譜分析

為了研究氮摻雜CDs 中存在的官能團(tuán)，使用FTIR 來表征其結(jié)構(gòu)。由圖4 可知，對殼聚糖粉末而言，3 430 cm-1處為胺基的O-H 和N-H 的伸縮振動(dòng)峰，2 878 cm-1處為C-H 特征峰[23]，1 654 cm-1和1 599 cm-1處為殼聚糖(酰胺Ⅰ)譜帶的乙酰化氨基[29]。殼聚糖水熱處理形成CDs 后，原本3 430 cm-1處胺基的特征吸收峰變?yōu)? 380 和3 205 cm-1處的兩個(gè)峰，而屬于C-H 的2 878 cm-1處的吸收峰幾乎消失。殼聚糖乙?；被腃 ＝O 伸縮振動(dòng)峰從1 654 cm-1移至1 719 cm-1處，Sahu 等[30]研究認(rèn)為是形成羥基和羧基所致，歸因于羧酸基團(tuán)的C ＝O 伸縮振動(dòng)，即CDs 的表面存在羧酸基團(tuán)[31]。在1 600 和1 400 cm-1處的吸收峰為C＝C、C-OH 的伸縮振動(dòng)和C-N 的彎曲振動(dòng)，與前人報(bào)道相一致[32]，而1 000 ～1 200 cm-1處的其他尖峰則為C-O 和C-N 伸縮振動(dòng)以及-OH 彎曲振動(dòng)。雖然水熱碳化的機(jī)理有待進(jìn)一步研究，但從紅外光譜圖的分析可以進(jìn)一步證實(shí)CDs 中含有羥基、羰基和羧基等官能團(tuán)，這些功能性親水基團(tuán)的存在可以大大改善所制備的熒光CDs 的水溶性及穩(wěn)定性[33]。另外，CDs 的紅外光譜中顯示出多個(gè)與殼聚糖不同的振動(dòng)峰，表明殼聚糖經(jīng)過水熱碳化形成了石墨結(jié)構(gòu)。

圖4 殼聚糖和CDs 的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra of chitosan and CDs

圖5 Fe3＋濃度對0.5 mg˙mL-1CDs 溶液熒光強(qiáng)度的影響Fig.5 Effect of Fe3＋concentration on fluorescence intensity of 0.5 mg˙mL-1 CDs solution

圖6 H2O2 濃度對CDs-Fe2＋混合溶液熒光強(qiáng)度(A)和相對熒光強(qiáng)度(B)的影響Fig.6 Effect of H2O2 concentration on fluorescence intensity (A) and relative fluorescence intensity of CDs-Fe2＋solution (B)

2.5 熒光量子產(chǎn)率分析

以硫酸奎寧(0.1 mol·L-1H2SO4為溶劑；QY ＝0.54)為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，測定CDs 溶液和硫酸奎寧溶液相應(yīng)的吸光度以及在320 nm 激發(fā)波長下兩者的發(fā)射峰面積，根據(jù)公式(1)計(jì)算得出所制備CDs 的QY 為5.22%。

2.6 不同濃度Fe3＋對0.5 mg˙mL-1 CDs 熒光強(qiáng)度的影響以及H2O2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

由圖5 可知，F(xiàn)e3＋對于CDs 溶液的熒光有著猝滅作用，當(dāng)Fe3＋濃度到達(dá)1 000 μmol·L-1時(shí)熒光幾乎完全消失。另外，由圖6 可知，F(xiàn)e2＋與CDs 溶液混合后熒光依舊較強(qiáng)，當(dāng)添加不同濃度的H2O2時(shí)，CDs-Fe2＋混合溶液的熒光發(fā)射光譜如圖6-A 所示，隨著H2O2濃度的增加，CDs-Fe2＋混合溶液的熒光強(qiáng)度逐漸降低，當(dāng)添加的H2O2濃度達(dá)到1 000 μmol·L-1時(shí)，熒光幾乎完全猝滅。研究進(jìn)一步揭示了CDs-Fe2＋混合溶液的熒光強(qiáng)度與H2O2濃度在0 ～60 μmol·L-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系(圖6-B)，可作為標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為F/F0＝-3.614 4×C(H2O2)＋0.995 3，相關(guān)系數(shù)(R2)約為0.990 0，其中F0和F分別是不存在和存在H2O2時(shí)CDs-Fe2＋混合溶液在320 nm 激發(fā)波長處的熒光強(qiáng)度，根據(jù)公式3S/k(其中S 表示標(biāo)準(zhǔn)偏差，k 是線性回歸方程的斜率)，預(yù)估檢測限為0.65 μmol·L-1。

3 討論

本研究以殼聚糖和酒石酸為反應(yīng)前體，水熱處理制備了熒光量子產(chǎn)率為5.22%的新型氮摻雜CDs，經(jīng)透射電鏡測得其粒徑約為20 nm，TEM 圖中顆粒穩(wěn)定性較好，并采用傅里葉變換紅外光譜等對其進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，證明形成了石墨烯結(jié)構(gòu)且其表面存在豐富的含氧和氮的功能性官能團(tuán)，熒光效應(yīng)較好并能用于檢測。

本研究結(jié)果表明，F(xiàn)e3＋可以淬滅殼聚糖衍生的氮摻雜CDs 的熒光，而同等濃度Fe2＋對其影響不大，由此推斷，H2O2將Fe2＋氧化為Fe3＋，F(xiàn)e3＋與CDs 產(chǎn)生配位，同時(shí)它可以轉(zhuǎn)移到Fe3＋的空d 軌道，從而導(dǎo)致混合溶液的熒光猝滅，這是一個(gè)靜態(tài)猝滅過程，與前人的報(bào)道一致[34]。因此CDs-Fe2＋氧化還原型熒光開關(guān)傳感器可以成為檢測H2O2的理想傳感器。這種新型熒光傳感器，對比已報(bào)道的其他方法，如Pradeep 等[35]利用 3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺( 3，3′，5，5′-tetramethylbenzidine，TMB)與其自制的綠色CDs 混合來檢驗(yàn)H2O2，其檢測限為35 μmol·L-1，而本研究采用更易獲得且環(huán)保的Fe2＋與CDs 混合，無需昂貴的設(shè)備，也不用復(fù)雜的操作步驟或苛刻的試驗(yàn)條件，響應(yīng)范圍類似，且檢測限更低，靈敏度更高。但本研究制備的熒光傳感器偏向于定量監(jiān)測食品中H2O2或氧化自由基的含量，對于成分定性的研究有待進(jìn)一步深入。

4 結(jié)論

本研究以氮含量豐富的殼聚糖及酒石酸作為反應(yīng)前體，通過溫和的水熱處理制備得一種新型氮摻雜CDs，并利用Fe2＋和H2O2之間的氧化反應(yīng)構(gòu)建了可用于分析H2O2的熒光傳感器，可定量檢測低濃度下的H2O2，具有易于操作，安全環(huán)保，線性范圍寬，檢測限低，靈敏度高和響應(yīng)速度快等優(yōu)點(diǎn)，在食品和生物系統(tǒng)中具有巨大的應(yīng)用潛力。