孫 凱 趙孟麗 郝志云 王建清 沈繼源 宋宜澤 柯 娜 王繼卿

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/甘肅省草食動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070)

山羊絨纖維由次級(jí)毛囊產(chǎn)生，具有細(xì)而柔軟、輕而保暖、絨面柔滑豐滿、彈性和吸濕性好、風(fēng)格獨(dú)特和穿著舒適等優(yōu)點(diǎn)，其價(jià)格也遠(yuǎn)高于綿羊毛和馬海毛，在業(yè)界被稱為“軟黃金”和“纖維鉆石”[1-3]。產(chǎn)絨量和平均纖維直徑是羊絨最重要的經(jīng)濟(jì)性狀，直接決定了山羊絨的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。角蛋白(keratins，Ks)和角蛋白關(guān)聯(lián)蛋白(keratin-associated proteins，KAPs； 其編碼基因標(biāo)識(shí)為KRTAPs)是羊絨纖維的主要結(jié)構(gòu)蛋白，約占其總重量的90%。前者形成角蛋白中間絲(keratin intermediate filaments，KIFs)，后者交聯(lián)形成KIFs 的基質(zhì)。Ks 和KAPs 直接決定了羊絨纖維的理化特性[4]。KAPs 是一類復(fù)雜的蛋白質(zhì)，最明顯的特點(diǎn)是含有大量的半胱氨酸(cysteine，Cys)或甘氨酸(glycine，Gly)和酪氨酸(tyrosine，Tyr)[5]。根據(jù)氨基酸成分和含量，KAPs 可以分為3 類:高甘氨酸/酪氨酸KAPs(HGTKAPs，含有35 ～60 mol%的Gly 和Tyr)、高硫KAPs(HS-KAPs，含有≤30 mol%的Cys)和超高KAPs(UHS-KAPs，含有＞30 mol%的Cys)[6]。根據(jù)序列相似性，可將KAPs 進(jìn)一步分為不同的家族。目前，已經(jīng)在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)了來自27 個(gè)基因家族的100 多個(gè)KRTAPs基因[7]。然而，在山羊中只發(fā)現(xiàn)了來自11 個(gè)家族的14 個(gè)KRTAPs基因[1，8-10]。山羊基因組中還有大量的KRTAPs基因有待進(jìn)一步鑒定。

已有研究表明，KRTAPs基因的核苷酸序列變異與山羊的產(chǎn)絨性狀有很強(qiáng)的相關(guān)性。王杰等[11]在高原型藏山羊上發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)基因型，其中BB基因型個(gè)體的羊絨纖維直徑比AB基因型個(gè)體小0.9 μm，比AA基因型個(gè)體小0.37 μm(P＜0.05)。Wang 等[1]發(fā)現(xiàn)存在KRTAP20-2 等位基因A的隴東絨山羊有較大的產(chǎn)絨量(P＜0.001)，存在等位基因B的個(gè)體有較小的產(chǎn)絨量和纖維自然長(zhǎng)度(P＜0.05)，推測(cè)KRTAP20-2 基因可以作為隴東絨山羊產(chǎn)絨量和纖維長(zhǎng)度的有效分子標(biāo)記。Fang 等[12]研究表明，新疆絨山羊KRTAP13-1 中GT基因型個(gè)體的絨層厚度比GG基因型個(gè)體增加0.393 cm(P＜0.05)。上述結(jié)果表明，研究山羊KRTAPs基因的核苷酸序列變異及其與產(chǎn)絨性狀的相關(guān)性對(duì)山羊生產(chǎn)實(shí)踐有重要意義。KRTAPs基因一般只含1 個(gè)不到1 000 bp 的外顯子，無內(nèi)含子。人類基因組中已鑒定出KRTAP2 基因家族，由KRTAP2-1、KRTAP2-2、KRTAP2-3、KRTAP2-4 和KRTAP2-5P(假基因)5 個(gè)成員組成[13]，而鮮有關(guān)于山羊KRTAP2 基因家族的研究報(bào)道。本研究以隴東絨山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，利用比較基因組、生物信息學(xué)、聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性( polymerase chain reaction-single stranded conformation polymorphism，PCR-SSCP)和測(cè)序等方法，在山羊基因組中鑒定KRTAP2-1 基因，研究該基因的單核苷酸多態(tài)性 ( single nucleotide polymorphisms，SNPs)和氨基酸序列特征，最后分析KRTAP2-1 基因的核苷酸序列變異對(duì)隴東絨山羊羊絨性狀的影響，旨在為改良羊絨性狀提供有效的分子遺傳標(biāo)記。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在甘肅省慶陽市環(huán)縣鈺生絨山羊繁育有限責(zé)任公司，以8 只無血緣關(guān)系的隴東絨山羊作為父本，采用人工授精技術(shù)對(duì)隴東絨山羊母羊進(jìn)行配種。在后代中隨機(jī)選擇249 只發(fā)育正常的隴東絨山羊，待其周歲時(shí)，現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定產(chǎn)絨量和絨層高度。在背中線處采集羊絨樣品，帶回實(shí)驗(yàn)室測(cè)定羊絨平均纖維直徑(mean fibre diameter，MFD)。對(duì)于上述249 只個(gè)體，每只羊頸靜脈采血8 mL，加入酸性檸檬酸葡萄糖(citric acid dextrose，ACD)抗凝，-20℃凍存，采用苯酚-氯仿抽提法[14]提取基因組DNA。

1.2 山羊基因組序列分析

根據(jù)人類KRTAP2-1 基因的編碼區(qū)序列(GenBank 登錄號(hào):NM001123387.1)，利用GenBank 的BLAST 軟件在山羊基因組GCF_001704415.1(www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCF_001704415.1)進(jìn)行同源性搜索。在比對(duì)結(jié)果中，與人類KRTAP2-1 基因同源性最高的DNA 序列被假定為山羊KRTAP2-1 基因的序列。

1.3 KRTAP2-1 基因的引物設(shè)計(jì)和PCR 擴(kuò)增

根據(jù)上述序列，設(shè)計(jì)引物，特異性擴(kuò)增山羊KRTAP2-1 基因的假定序列，目的片段長(zhǎng)度為565 bp。上游引物:5′-AACAAGGAATGGCATGAGTC-3′，下游引物:5′-G TTGCTTTATAGGAAAGTGGG-3′，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。PCR 反應(yīng)總體系為20 μL，其中Taq 預(yù)混酶10 μL(上海華大基因科技有限公司)，ddH2O 7.6 μL，0.25 μmol·L-1上下游引物各0.8 μL，約50 ng·μL-1的基因組DNA 模板0.8 μL。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，64℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35 個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸7 min，4℃保存PCR 產(chǎn)物。

1.4 山羊KRTAP2-1 基因的SSCP 分析

取1 μL PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物加入8 μL 變性上樣緩沖液[98%去離子甲酰胺、10 mmol·L-1乙二胺四乙酸二鈉(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、0.025%溴酚藍(lán)和0.025%二甲苯氰]，105℃變性10 min 后，立刻放入冰水混合物中，快速上樣于14%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶甲叉＝37.5 ∶1)中，在0.5×Tris-硼酸緩沖液中，先于350 V、35℃條件下電泳40 min，最后在170 V、35℃條件下電泳23 h。電泳完成后，根據(jù)Byun 等[15]的方法對(duì)聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行染色。

1.5 KRTAP2-1 等位基因的測(cè)序

通過SSCP 分析來判斷個(gè)體基因型是純合子還是雜合子。如個(gè)體基因型為純合子，直接用PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序；如果個(gè)體基因型全部為雜合子(無純合子)，則采用Gong 等[16]的方法進(jìn)行切膠測(cè)序。測(cè)序在西安奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使 用 MEGA (V5. 2. 10，Lynnon BioSoft，Vaudreuil，加拿大)進(jìn)行DNA 序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)用到的KAPs 序列有:JN012101.1 (gKAP1-4)、NM_001285774 (gKAP3-1)、 NM _ 001285767.1 (gKAP11 - 1)、 AY510115(gKAP13 - 1)、 JX426138 (gKAP13 - 3)、 X01610(sKAP1-1 和sKAP1-4)、HQ897973 (sKAP1-2)、X02925 (sKAP1-3)、P02443 (sKAP2-1)、P02441(sKAP2-3)、P02446 (sKAP3-1)、P02444 (sKAP3-2)、P02445 (sKAP3-3)、HQ595347 (sKAP11-1)、JN377429 (sKAP13-3)、KX817979 (sKAP15-1)、JX112014 (sKAP24-1)、KX644903 (sKAP26-1)、NM_030967.2 (hKAP1-1)、NM_030966.1 (hKAP1-3)、NM_001257305.1 (hKAP1-4)、NM_031957.1 (hKAP1-5)、NM_001123387.1 (hKAP2-1)、NM_033032.2(hKAP2-2)、NM_001165252.1 (hKAP2-3)、NM_033184.3 (hKAP2-4)、NM_031958.1 (hKAP3-1)、NM_031959.2 (hKAP3-2)、NM_033185.2 (hKAP3-3)、NM _ 175858.2 (hKAP11 - 1)、 NM _ 181599.2(hKAP13-1)、NM_181621.3 (hKAP13-2)、NM_181622.1 (hKAP13-3)、NM_181600.1 (hKAP13-4)、NM _ 181623.1 (hKAP15 - 1)、 NM _ 001146182.1(hKAP16-1)、NM_181624.1 (hKAP23-1)、NM_001085455.2 ( hKAP24 - 1)、 NM _ 001128598.1(hKAP25-1)、NM_203405.1 (hKAP26-1)和NM_001077711.1 (hKAP27-1)。

用GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST 軟件(http:/ /www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行序列同源性比對(duì)，用Popgen(V32.0) 計(jì)算等位基因頻率、 遺傳雜合度(heterozygosity，He) 和有效等位基因數(shù)(effective number of alleles，Ne)，用PIC 軟件計(jì)算群體多態(tài)信息含量(polymorphism information content，PIC)，用在線軟件NetPhos 3.1 Server (http:/ /www. cbs. dtu. dk/services/NetPhos-3.1/)預(yù)測(cè)氨基酸序列的磷酸化位點(diǎn)。采用SPSS 20.0 軟件的一般線性混合效應(yīng)模型(general liner mixed-effect models，GLMMs)分析等位基因狀態(tài)(存在或缺失)對(duì)隴東絨山羊羊絨性狀的影響。為確定模型分析中的因素，進(jìn)一步分析出生等級(jí)(單羔和雙羔)、父本(配種公羊)和性別對(duì)249 只隴東絨山羊產(chǎn)絨性狀的影響。結(jié)果表明，出生等級(jí)(單羔和雙羔)對(duì)產(chǎn)絨性狀無顯著影響(P＞0.05)，父本(配種公羊)和性別對(duì)羊絨性狀有極顯著影響(P＜0.01)。因此，在模型中，把基因型與父本作為固定效應(yīng)，把性別作為隨機(jī)效應(yīng)。由于所有羊只年齡均相同，且在統(tǒng)一管理?xiàng)l件下飼養(yǎng)，因此在模型中未考慮年齡和環(huán)境因素。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊KRTAP2-1 基因鑒定

利用人類KRTAP2 - 1 基因的編碼區(qū)序列(GenBank 登錄號(hào):NM001123387.1)，用GenBank 中Blast 程序在山羊基因組中搜索，結(jié)果在山羊19 號(hào)染色體上發(fā)現(xiàn)一個(gè)399 bp(40927134 ～40927532)的開放閱讀框，該序列與人類的KRTAP2-1 基因序列的相似性為97%。在該區(qū)域附近有4 個(gè)已被鑒定的山羊KRTAPs基因，分別是KRTAP1-3、KRTAP1-4、KRTAP1-1 和KRTAP9-2(圖1)。

通過PCR-SSCP 分析發(fā)現(xiàn)，從249 只隴東絨山羊中檢測(cè)到7 個(gè)等位基因(分別是A、B、C、D、E、F和G)和11 種基因型(AA、BB、CC、DE、AB、AC、AF、AG、BC、BF和BG)(圖2)。7 個(gè)等位基因中，等位基因F的序列與山羊基因組完全相同，其他等位基因的核苷酸序列與山羊基因組的序列相似性均超過98%。

根據(jù)本研究發(fā)現(xiàn)的上述7 條A～G序列所編碼的氨基酸序列，以及從人類、綿羊和山羊中鑒定出的HSKAPs 氨基酸序列，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。結(jié)果表明，7 條氨基酸序列與人類和綿羊的KAP2-1 序列具有較高的同源性，說明這7 條序列是山羊KRTAP2-1的7 個(gè)等位基因。

2.2 山羊KRTAP2-1 基因的SNPs

測(cè)序結(jié)果表明(表1)，隴東絨山羊KRTAP2-1 的7 個(gè)等位基因中存在12 個(gè)SNPs 位點(diǎn)和2 個(gè)插入/缺失位點(diǎn)，占序列位點(diǎn)總數(shù)的2.12%(表1)。12 個(gè)SNPs位點(diǎn)中，7 個(gè)SNPs(c.-121C＞T、c.-108T＞G、c.-103T＞C、c.-80A＞C、c.-74A＞G、c.-38G＞T 和c.-31G＞A)位于5’UTR 區(qū)域，5 個(gè)SNPs(c.48C＞T、c.67C＞G、c.71A＞G、c.99A＞C 和c.117C＞T)位于KRTAP2-1 基因的編碼區(qū)域。c.67C＞G 和c.71A＞G 是非同義突變，分別引起了p.Arg23Gly 和p.Tyr24Cys 氨基酸的改變。與A、B、C、E、F和G等位基因序列相比，等位基因D發(fā)生了3-bp 的堿基缺失(c.-61_-63delCTC)。與A、C、D、E、F和G等位基因序列相比，等位基因B發(fā)生了3-bp 的堿基缺失(c.93_95delCCG)，引起了第32 位精氨酸的移碼缺失。

表1 隴東絨山羊KRTAP2-1 基因的SNPsTable 1 SNPs of KRTAP2-1 in Longdong cashmere goats

2.3 隴東絨山羊KAP2-1 多肽鏈的氨基酸組成

山羊KAP2-1 多肽鏈包含132 個(gè)氨基酸。其中半胱氨酸的比例最高，為23.48 mol%～24.24 mol%，其次為絲氨酸(9.85 mol%)、脯氨酸(13.64 mol%)和蘇氨酸(11.36 mol%)，天冬氨酸、組氨酸和賴氨酸在7條多肽鏈中未出現(xiàn)。在等位基因A、C、D、E、F和G翻譯的多肽鏈中發(fā)現(xiàn)了15 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，包含8個(gè)絲氨酸和7 個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)。在等位基因B翻譯的多肽鏈中發(fā)現(xiàn)了14 個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，包括7 個(gè)絲氨酸和7 個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)(圖4)。

圖3 基于山羊、綿羊和人類的HS-KAPs 的氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.3 Phylogenetic tree of the amino acid sequences from high-sulphur (HS)-KAPs identified in sheep，humans and goats

2.4 隴東絨山羊KRTAP2-1 基因的遺傳多態(tài)性分析

圖4 山羊和人類KAP2-1 的氨基酸序列對(duì)比結(jié)果Fig.4 Alignment of KAP2-1 amino acid sequence from goat and human

在249 只隴東絨山羊中，各個(gè)等位基因的頻率分別為:A:67.81%，B:12.75%，C:12.55%，D:1.01%，E:1.01%，F(xiàn):4.66%，G:0.2%。共檢測(cè)到11 種基因型，其中AA、AB、AC和AF為優(yōu)勢(shì)基因型，這4 種基因型的總頻率為90.77%，其他7 種基因型(BB、CC、DE、AG、BC、BF和CF)的頻率均小于5%。有效等位基因數(shù)(Ne)、遺傳雜合度(He)和多態(tài)信息含量(PIC)3 個(gè)指標(biāo)可以用來評(píng)價(jià)一個(gè)群體的遺傳多態(tài)性。結(jié)果表明，隴東絨山羊的多態(tài)信息含量為0.48，屬于中度多態(tài)，有效等位基因數(shù)為2.02，遺傳雜合度為0.55。

2.5 KRTAP2-1 基因核苷酸序列變異與羊絨性狀的關(guān)系

在發(fā)現(xiàn)的7 個(gè)等位基因中，由于等位基因D、E、F和G的頻率都低于5%，因此在相關(guān)性分析中，只分析了等位基因A、B和C對(duì)隴東絨山羊羊絨性狀的影響。結(jié)果表明，等位基因C的存在與較小的羊絨纖維直徑相關(guān)(存在:13.4 μm；缺失:13.6 μm；P＝0.010)(表2)。

表2 KRTAP2-1 基因核苷酸序列變異與隴東絨山羊羊絨性狀的相關(guān)性Table 2 Association of caprine KRTAP2-1 variants with cashmere traits in Longdong cashmere goats

3 討論

本研究在山羊基因組中鑒定了一個(gè)編碼HS-KAP蛋白的KRTAP2-1 基因，同時(shí)分析了該基因的核苷酸序列變異對(duì)隴東絨山羊羊絨性狀的影響。KRTAP2-1基因位于山羊19 號(hào)染色體上，與人類和綿羊的KRTAP2-1 序列具有較高的同源性。KRTAP2-1 的鑒定使得山羊基因組中已鑒定的KRTAPs基因總數(shù)從14個(gè)增加到15 個(gè)。應(yīng)用比較基因組學(xué)和PCR-SSCP 相結(jié)合的方法是鑒定綿羊和山羊KRTAPs基因的常用方法，前人已用相同的方法在山羊基因組中鑒定出了KRTAP15- 1[10]、KRTAP20 - 1[8]、KRTAP20 - 2[1]和KRTAP24-1[9]基因，這也表明了本研究鑒定山羊KRTAP2-1 基因方法的可靠性和可行性。

雖然山羊和人類的KAP2-1 序列具有較高的相似性，但是兩者的氨基酸序列間存在一定的差異。首先，兩物種KAP2-1 序列的長(zhǎng)度不同。人類KRTAP2-1 基因編碼的多肽鏈共有128 個(gè)氨基酸[13]，而山羊KAP2-1 多肽鏈有132 個(gè)氨基酸，它在C 末端比人類蛋白多了SPCC 4 個(gè)氨基酸殘基。在KAP26-1 和KAP20-2蛋白上也發(fā)現(xiàn)了上述物種間的氨基酸序列差異[1，18]。其次，人類與山羊的KAP2-1 多肽鏈中含有不同比例的半胱氨酸。山羊KAP2-1 蛋白含有24.24 mol%的半胱氨酸，低于人類的27.34 mol%[13]。半胱氨酸對(duì)羊絨纖維合成至關(guān)重要，是合成羊絨纖維的第一限制性氨基酸，其形成的二硫鍵連接了KAPs 和KIFs[19]。半胱氨酸數(shù)量的改變，可能影響KAPs 與KIFs 或其他KAPs 的交聯(lián)，從而導(dǎo)致羊絨纖維的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變。最后，兩物種的“CCXPX”五聚體重復(fù)序列數(shù)量也存在差異(圖4)。在人的氨基酸序列中，存在7 個(gè)五聚體重復(fù)序列，而山羊的氨基酸序列中存在6 個(gè)。

值得注意的是，與其他等位基因相比，等位基因B發(fā)生了3-bp 的堿基缺失(c.93_95delCCG)，導(dǎo)致了1個(gè)潛在磷酸化位點(diǎn)的消失。蛋白質(zhì)磷酸化是一種廣泛存在的翻譯后修飾，參與和調(diào)控生物體內(nèi)的許多生命活動(dòng)[20-21]。雖然在KAPs 蛋白中鮮見磷酸化的相關(guān)報(bào)道，但它對(duì)Ks 的結(jié)構(gòu)和功能有重要影響，進(jìn)而對(duì)山羊的羊絨性狀產(chǎn)生影響[22]。因此，鑒于在羊絨纖維形成過程中，KAPs 蛋白和Ks 的密切關(guān)系，本研究在KAP2-1 中發(fā)現(xiàn)的磷酸位點(diǎn)可能也有重要作用，需要進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

SNPs 是基因組上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA 序列多態(tài)性，是動(dòng)物基因組中最常見的一種變異類型[23]。在綿羊基因組中每1 kb 堿基就有4.9 個(gè)SNPs[10]，但山羊基因組中的SNPs 分布密度尚不清楚。本研究在山羊KRTAP2-1 基因524 bp 的目的片段內(nèi)(除去兩端的引物序列)，檢測(cè)到12 個(gè)SNPs，它的平均分布密度是23 SNPs/1 kb。由此發(fā)現(xiàn)，山羊KRTAP2-1 基因的SNPs 分布密度遠(yuǎn)高于綿羊基因組的平均密度，表明該基因具有非常豐富的多態(tài)性。山羊KRTAP2-1 編碼區(qū)序列中共發(fā)現(xiàn)了5 個(gè)SNPs 位點(diǎn)，2 個(gè)SNPs 是非同義突變。其中，c.67C＞G 導(dǎo)致了甘氨酸含量的改變(p.Arg23Gly)。甘氨酸是分子量最小的氨基酸，且缺少一個(gè)側(cè)鏈，能破壞多肽鏈的螺旋結(jié)構(gòu)，使KAPs 結(jié)構(gòu)更加靈活，有助于KAPs 與Ks 之間更好地交聯(lián)[24]。c.71A＞G 引起了半胱氨酸含量的變化(p.Tyr24Cys)，李少斌[24]研究表明半胱氨酸在羊絨纖維之間形成二硫鍵的過程中發(fā)揮重要作用，最終影響羊絨纖維的生長(zhǎng)。等位基因B發(fā)生了3-bp 的堿基缺失(c.93_95delCCG)，這種KRTAPs的長(zhǎng)度變異在綿羊KRTAP6-3 基因中已有相關(guān)報(bào)道[19]。該3-bp 的堿基缺失引起第32 位精氨酸的缺失。精氨酸通常傾向于在蛋白質(zhì)表面參與鹽橋反應(yīng)，它與帶負(fù)電荷的天冬氨酸或谷氨酸配對(duì)，形成穩(wěn)定的氫鍵，這對(duì)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性有重要作用。本研究中精氨酸含量的變化可能會(huì)影響KAP2-1 蛋白的穩(wěn)定性。本研究還發(fā)現(xiàn)了3 個(gè)同義突變SNPs 和7 個(gè)位于5’UTR 區(qū)域的SNPs，雖然這些SNPs 不會(huì)引起氨基酸的改變，但仍會(huì)通過其他途徑發(fā)揮生物學(xué)功能。Hurst[25]發(fā)現(xiàn)，同義突變SNPs 可能影響mRNA 的翻譯率，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)折疊的方式。非編碼區(qū)的SNPs 能夠影響mRNA 的加工速度，對(duì)維持染色體特定結(jié)構(gòu)有重要作用，并在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)基因表達(dá)起調(diào)控作用[26-27]。因此，這些SNPs 最終會(huì)影響KAP2-1 蛋白的表達(dá)和結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響羊絨纖維的結(jié)構(gòu)和性狀。

本研究發(fā)現(xiàn)隴東絨山羊KRTAP2-1 基因的PIC 值為0.48，表明該群體處于中度多態(tài)(0.25 ＜PIC ＜0.5)，說明該群體中性狀變異程度較大，這為羊絨性狀選育提供了育種材料，也說明隴東絨山羊具有很大的育種空間。同時(shí)，隴東絨山羊群體的遺傳雜合度為0.55，有效等位基因數(shù)為2.02，進(jìn)一步證實(shí)了該群體有較大的遺傳變異。相關(guān)性分析表明，等位基因C的存在與較小的羊絨纖維直徑相關(guān)(表2)。因此，在生產(chǎn)實(shí)踐中，可選留含有等位基因C的個(gè)體，以降低隴東絨山羊的羊絨纖維直徑。序列分析發(fā)現(xiàn)，與另外2個(gè)優(yōu)勢(shì)等位基因A和B相比，等位基因C在非編碼區(qū)有一個(gè)SNP (c.-80A＞C)，在編碼區(qū)有一個(gè)非同義突變SNP(c.67C＞G)，導(dǎo)致精氨酸變?yōu)楦拾彼?。因此，等位基因C有可能通過調(diào)節(jié)精氨酸和甘氨酸的含量，或通過影響mRNA 的轉(zhuǎn)錄和翻譯，最終影響隴東絨山羊的羊絨纖維直徑。目前在山羊基因組中已鑒定的14個(gè)KRTAPs基因中，KRTAP8 - 2、KRTAP15-1和KRTAP24-1 對(duì)羊絨纖維直徑有影響[9-10，28]，KRTAP1-1、KRTAP20-1、KRTAP20-2 對(duì)產(chǎn)絨量有影響[1，8，29]，KRTAP13-1、KRTAP8-2 對(duì)絨層高度有影響[12，28]。本研究在KRTAP2-1 中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果與KRTAP8-2、KRTAP15-1 和KRTAP24-1 基因一致。由于KRTAP2-1 基因與上述基因均不在同一個(gè)染色體上，故推測(cè)KRTAP2-1 對(duì)羊絨纖維直徑有獨(dú)立的影響，而不是與其他基因緊密連鎖的結(jié)果。

4 結(jié)論

本研究在山羊19 號(hào)染色體上鑒定出了KRTAP2-1 基因，在249 只隴東山羊的該基因中檢測(cè)出7 個(gè)等位基因，發(fā)現(xiàn)了12 個(gè)SNPs 和2 個(gè)3-bp 的堿基缺失。相關(guān)性分析表明，等位基因C對(duì)羊絨纖維直徑有顯著影響。本研究豐富了山羊基因組數(shù)據(jù)，可將該基因用作分子標(biāo)記，以降低隴東絨山羊的羊絨纖維直徑，從而提高羊絨纖維品質(zhì)。