任玉琴 付鴻博 雷 晨 王鵬飛 穆霄鵬 張建成 杜俊杰

(1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄉(xiāng)村振興科技研究所，黑龍江 哈爾濱 150000)

歐李[Cerasus humilis(Bge.)Sok.]是薔薇科櫻桃屬的極矮生灌木果樹(shù)[1]，叢狀生長(zhǎng)，樹(shù)高0.5 ～1 m，枝長(zhǎng)0.5 m。歐李花色多種，果色、果形各異，葉片大小、形狀不同，具有很高的觀賞價(jià)值，是我國(guó)特有的野生果樹(shù)之一[2]。歐李在我國(guó)十多個(gè)省份均有種植，其果實(shí)可食用、 加工，根、種子可入藥，葉片含有兒茶素(catechin，CC)、表兒茶素(epicatechin，EC)、蘆丁(rutin，RT)和甘草素(liquiritigenin，LG)等功能物質(zhì)，可用于生產(chǎn)綠茶和發(fā)酵茶等各種保健茶，以及其他功能性產(chǎn)品[3]，具有良好的生態(tài)、觀賞、經(jīng)濟(jì)和藥用保健價(jià)值。

類黃酮又稱生物類黃酮，是自然界植物中主要活性成分之一，廣泛存于水果、蔬菜、谷物、根莖、樹(shù)皮、花卉、茶葉和紅葡萄酒中[4]。類黃酮作為一種重要的次生代謝產(chǎn)物，對(duì)多種細(xì)菌、真菌、病原體等致病微生物有抑制作用[5]，同時(shí)具有擴(kuò)張血管、降糖降脂、美白等功效[6]，有較高的實(shí)用開(kāi)發(fā)價(jià)值[7]。兒茶素、 表兒茶素廣泛存在于藥材和茶葉等植物和植物性食物中[8-9]，屬于黃烷-3-醇類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、改善糖尿病和神經(jīng)退行性病變、調(diào)節(jié)免疫功能等生物活性[10-12]。黃舒婷等[13]通過(guò)對(duì)鉤藤葉進(jìn)行抗氧化活性部位追蹤，發(fā)現(xiàn)鉤藤葉抗氧化活性主要與黃酮和多酚等成分相關(guān)。孫建瑞等[14]發(fā)現(xiàn)豫西山茱萸葉黃酮具有顯著的抑菌和抗氧化能力。崔樹(shù)梅等[15]指出根皮素具有抗氧化、抗炎、美白、防曬、抑菌、保濕等多種功效，已被應(yīng)用于化妝品。研究發(fā)現(xiàn)歐李果實(shí)具有顯著的抗氧化能力[16-17]，但對(duì)葉片類黃酮組分含量研究較少，使葉片功能未得到廣泛開(kāi)發(fā)。

基于前期研究結(jié)果，本研究選定38 份歐李葉片種質(zhì)中含量較高和種質(zhì)間差異較大的9 種生物活性組分(兒茶素、表兒茶素、甘草素、蘆丁、槲皮素、槲皮素-7-O-葡萄糖苷、楊梅素、光甘草定、根皮素)進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)其抗氧化能力及酪氨酸酶抑制率進(jìn)行分析，旨在為歐李后期相關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)及提取提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2019年7—10月，自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站和歐李種質(zhì)資源圃采集38 份歐李種質(zhì)資源，每份歐李種質(zhì)選取3 株植株，每株采集15 ～20 片基生枝中部成熟期葉片，采后的葉片除雜放于-40℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)儀器及試劑 U3000 超高效液相色譜儀，美國(guó)Thermo 公司；UV-5200 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；SB25-12D 超聲清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司。色譜級(jí)甲醇、乙腈均為Merck 品牌，CC、EC、LG、RT、槲皮素(quercetin，QC)、槲皮素-7-O-葡萄糖苷(quercetin -7-O- glucoside，Q3G)、楊梅素(myricetin，MC)、光甘草定(glabridin，GB)、根皮素(phloretin，PR)標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶生物科技有限公司，純度≥98%。分析純甲醇，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

1.2.2 樣品提取、制備及組分測(cè)定 提取液的制備:利用超聲輔助提取法[17-18]，用液氮將保存?zhèn)溆萌~片研磨成粉末，用40%的酸化甲醇作提取液，料液比1 ∶10(g ∶mL)，漩渦震蕩混勻，超聲提取30 min(40 kHz)，然后于10 000×g離心15 min，取上清液，共提取3 次，合并上清液，待測(cè)。

類黃酮含量(flavonoid content，F(xiàn)C)測(cè)定:采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 比色法測(cè)定。吸取0.3 mL 提取液于10 mL 容量瓶，先加0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，避光靜置6 min，再加0.3 mL 10%六水硝酸鋁溶液，搖勻，避光靜置6 min，最后加4 mL 4%氫氧化鈉溶液，用40%甲醇定容至10 mL，搖勻靜置10 min，在510 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。以標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

類黃酮組分測(cè)定:采用超高效液相色譜儀測(cè)定歐李葉片黃酮組分，取1 mL 提取液過(guò)0.22 μm 微孔濾膜后，裝于液相進(jìn)樣瓶中待測(cè)定，使用美國(guó)安捷倫Agela Venusil ABS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱子。

流動(dòng)相:A 相0.5%甲酸水，B 相乙腈，進(jìn)樣量20 μL，流速0.8 mL·min-1。洗脫程序:0 mim，10%乙腈；0～5 min，13%乙腈；5 ～25 min，16% 乙腈；25 ～30 min，21%乙腈；30 ～45 min，22%乙腈；45 ～50 min，24%乙腈；50～65 min，25%乙腈；65～66 min，10%乙腈；平衡3 min。檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm 和360 nm，測(cè)定CC、EC、LG、RT、MC、LG、Q3G；

表1 38 份歐李種質(zhì)采集地點(diǎn)和日期Table 1 Collection location and date of thirty-eight Chinese Dwarf Cherry Germplasms

流動(dòng)相:乙腈∶水＝60 ∶40，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，測(cè)定GB。

流動(dòng)相:A 相0.02%甲酸水，B 相甲醇，進(jìn)樣量10 μL，流速0.8 mL·min-1。洗脫程序:0 mim，10%甲醇；0～5 min，20%甲醇；5 ～10 min，35%甲醇；10 ～20 min，40%甲醇；20 ～35 min，75%甲醇；35 ～40 min，10%甲醇；平衡5 min。檢測(cè)波長(zhǎng)280 nm，測(cè)定PR。定性分析根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間確定、定量分析采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法。

1.2.3 抗氧化能力測(cè)定 1，1-二苯基-2-三硝基苯脅(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)法[17]測(cè)定抗氧化能力。樣品組:吸取0.2 mL 樣品稀釋液，加入2.8 mL 0.1 mmol·L-1的DPPH 溶液，室溫避光反應(yīng)30 min；空白組:用40%甲醇替代樣品稀釋液。于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，蒸餾水調(diào)零。

1.2.4 酪氨酸酶抑制率測(cè)定[19]分別配制pH 值6.8 的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)、1.0 mg·mL-1的L-酪氨酸溶液和0.1 mg·mL-1的酪氨酸酶溶液。按照以下配比加樣，測(cè)試樣1:2.0 mL PBS＋0.5 mL 酪氨酸酶溶液＋0.5 mL L-酪氨酸溶液；測(cè)試樣2:2.5 mL PBS＋0.5mL 酪氨酸酶溶液；測(cè)試樣3:0.5 mL 樣品溶液＋1.5 mL PBS＋0.5 mL 酪氨酸酶溶液＋0.5 mL L-酪氨酸溶液；測(cè)試樣4:0.5 mL 樣品溶液＋2.0 mL PBS ＋0.5 mL 酪氨酸酶溶液。將各測(cè)試樣混勻，將每個(gè)樣品的1 ～4 種測(cè)試樣混勻，37℃水浴30 min，立即取出在475 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值(A1～A4)。按照公式計(jì)算提取物對(duì)酪氨酸酶抑制率:

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007、SAS 9.2 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種質(zhì)歐李葉片類黃酮含量變異分析

由表2 可知，38 份歐李種質(zhì)葉片類黃酮的平均值為33.235 mg·g-1，變異系數(shù)為41.669%，超過(guò)了20%，表明歐李葉片類黃酮的變異較大，遺傳多樣性豐富。38 份種質(zhì)葉片中CC 含量范圍在6.271 ～935.295 mg·100g-1之間，平均值為304.141 mg·100g-1，在黃酮類化合物中含量占比接近10%，明顯高于其他已測(cè)組分含量，且變異系數(shù)超過(guò)了20%，達(dá)到了80.894%。EC、LG、RT、Q3G 含量的平均值分別為43.038、32.133、36.292、27.982 mg·100g-1，而MC、QC、GB 和PR 含量的平均值僅為4.713、6.876、0.032、4.151 mg·100g-1，明顯低于其他組分，表明在已測(cè)的類黃酮化合物組分中，MC、QC、GB 和PR 含量較低，但各物質(zhì)的變異系數(shù)均達(dá)到60%以上，說(shuō)明38 份歐李種質(zhì)葉片中類黃酮各組分含量的變異較大，遺傳多樣性豐富。

表2 38 份歐李種質(zhì)葉片類黃酮及不同組分含量變異分析Table 2 Analysis of flavonoids and different components in leaves of thirty-eight Chinese Dwarf Cherry Germplasms

2.2 不同歐李種質(zhì)葉片類黃酮含量的聚類分析

依據(jù)歐李葉片類黃酮含量，對(duì)38 份歐李種質(zhì)進(jìn)行聚類分析，如圖1 和表3 所示。將歐李種質(zhì)分成可大類，其中:第Ⅰ類超高類黃酮含量種質(zhì)1 份，含量為64.84 mg·g-1；第Ⅱ類高類黃酮含量種質(zhì)5 份，含量在48.38～55.67 mg·g-1之間；第Ⅲ類中類黃酮含量種質(zhì)28 份，含量在19.21 ～47.83 mg·g-1之間；第Ⅳ類低類黃酮含量種質(zhì)4 份，含量在3.29 ～9.33 mg·g-1之間。其中第Ⅲ類占比相對(duì)較高，為73.68%。表明38 份歐李種質(zhì)類黃酮含量主要集中在19.21 ～47.83 mg·g-1之間。

2.3 不同種質(zhì)歐李葉片黃酮類物質(zhì)含量分析

圖1 不同種質(zhì)歐李葉片類黃酮含量的聚類分析Fig.1 Cluster analysis of leave flavonoid content of different Chinese Dwarf Cherry Germplasms

表3 不同類黃酮含量類型的歐李種質(zhì)Table 3 Different flavonoid content types in of Chinese dwarf cherry germplasms

對(duì)不同種質(zhì)歐李葉片中黃酮類物質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，由表4 可知，9 種物質(zhì)在不同種質(zhì)葉片間含量有極顯著差異。其中CC、EC、RT、Q3G 在38 份種質(zhì)中均能檢測(cè)到，CC 含量在6.27 ～935.29 mg·100g-1之間，高于另外3 種物質(zhì)，且變化范圍最大。LG 在除15-02、15-01、15-51、XLN19-1 4 份種質(zhì)以外的34 份種質(zhì)中均被檢測(cè)到。在除DG-7、XLN19-01、Ft-1 3 份種質(zhì)以外的35 份種質(zhì)中檢測(cè)到，含量在0.00 ～12.04 mg·100g-1之間。有11 份種質(zhì)中不含，其含量在0.00 ～19.67 mg·100g-1之間。GB 含量較低，且僅在9 份種質(zhì)中檢測(cè)到，含量最高為0.19 mg·100g-1，在9種物質(zhì)中含量最低，且變化范圍最小。PR 在8 份種質(zhì)中未檢測(cè)到，且含量較低，最高含量?jī)H為16.00 mg·100g-1。

2.4 不同種質(zhì)歐李葉片類黃酮和不同組分與DPPH自由基清除率、酪氨酸酶抑制率的相關(guān)性分析

通過(guò)對(duì)38 份歐李種質(zhì)葉片的類黃酮含量及DPPH 自由基清除率、酪氨酸酶抑制率進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(圖3)，歐李葉片的類黃酮與MC 和QC 呈負(fù)相關(guān)，與CC、EC、RT、Q3G 呈極顯著正相關(guān)，其中CC、EC、RT 與類黃酮含量的相關(guān)系數(shù)都接近0.6。類黃酮含量與DPPH 自由基清除率呈極顯著正相關(guān)，與酪氨酸酶抑制率呈正相關(guān)，但相關(guān)系數(shù)僅為0.13，表明類黃酮中對(duì)酪氨酸酶起抑制作用的物質(zhì)含量較低。在9種組分中，除MC、QC、GB 和PR 外，其他5 種組分與DPPH 自由基清除率均呈極顯著正相關(guān)，RT 與DPPH自由基清除率正相關(guān)系數(shù)最大，達(dá)到0.67，表明RT 可能是歐李葉片抗氧化活性的主要成分之一。9 種類黃酮組分與酪氨酸酶抑制率相關(guān)系數(shù)較低，表明9 種組分對(duì)酪氨酸酶抑制作用較差。MC 和QC 與除GB 和PR 外其他5 種組分均呈負(fù)相關(guān)，但MC 與QC 之間呈極顯著正相關(guān)，且二者與DPPH 自由基清除率呈負(fù)相關(guān)。DPPH 自由基清除率與酪氨酸酶抑制率間呈負(fù)相關(guān)，表明歐李葉片抗氧化和美白之間可能無(wú)相關(guān)性。

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圖2 不同種質(zhì)歐李葉片類黃酮和不同組分與DPPH 自由基清除率、酪氨酸酶抑制率的相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of flavonoids and components in leaves of different Chinese dwarf cherry germplasms with DPPH clearance rate and tyrosinase inhibition rate

3 討論

歐李葉片葉形多樣，常呈倒卵圓形，葉互生，呈螺旋狀排列。葉片上半部寬、下半部窄是歐李區(qū)別于其他近緣種(如郁李、麥李)的重要標(biāo)志。黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于高等植物及羊齒植物的根、莖、葉、花、果實(shí)中，是許多中草藥的有效成分[20]，由于其生理活性多種多樣，近年來(lái)引起了國(guó)內(nèi)外化學(xué)家、藥物學(xué)家的廣泛重視。

本研究測(cè)定了38 份歐李種質(zhì)葉片的類黃酮、兒茶素、表兒茶素、蘆丁、楊梅素等生物活性物質(zhì)，并對(duì)38份種質(zhì)類黃酮及各組分進(jìn)行變異分析，發(fā)現(xiàn)各物質(zhì)的變異系數(shù)均超過(guò)了20%，表明歐李類黃酮及各組分的變異較大，遺傳多樣性豐富。38 份歐李葉片種質(zhì)中，類黃酮的含量變化范圍為3.29 ～64.84 mg·g-1，兒茶素含量范圍為6.27 ～935.29 mg·100g-1，平均含量在黃酮類化合物中占比接近10%，高于其他已測(cè)組分含量。本研究前期通過(guò)對(duì)歐李不同種質(zhì)果實(shí)的類黃酮及各組分含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)成熟期果實(shí)類黃酮含量顯著低于葉片[21-22]。李國(guó)莉等[23]研究表明寧夏枸杞葉片中黃酮含量大于枸杞果實(shí)。薛曉芳等[24]比較了棗和酸棗不同器官黃酮含量并分析了抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)成熟葉片總黃酮含量為7.01 ～9.02 mg·g-1，平均值為7.98 mg·g-1； 且葉片中總黃酮含量高于果實(shí)，這與本研究結(jié)果一致。

表兒茶素、甘草素、蘆丁、槲皮素7-O-葡萄糖苷含量的平均值分別為43.038、32.133、36.292、27.982 mg·100g-1，而楊梅素、槲皮素、光甘草定、根皮素含量的平均值僅為4.713、6.876、0.032、4.151 mg·100g-1，明顯低于其他組分的含量。其中兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素-7-O-葡萄糖苷在38 份種質(zhì)中均能檢測(cè)到，而有11 份種質(zhì)中不含有槲皮素。付桂香等[25]比較了7 個(gè)不同種質(zhì)沙棘葉片3 種黃酮類物質(zhì)的含量，發(fā)現(xiàn)蘆丁的含量范圍為9.47 ～389.17 mg·100g-1，且7個(gè)種質(zhì)中都可以檢測(cè)到，而槲皮素含量為5.59 ～16.35 mg·100g-1，僅在3 個(gè)種質(zhì)中檢測(cè)到。陸勝波等[26]對(duì)泡核桃不同器官的黃酮及組分進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)泡核桃葉片中蘆丁含量顯著高于槲皮素和楊梅素，這與本研究一致，但泡核桃葉片中不含有表兒茶素，且兒茶素含量顯著低于蘆丁，表明不同物種間黃酮類物質(zhì)含量間存在差異。

本研究通過(guò)對(duì)38 份歐李種質(zhì)葉片類黃酮含量進(jìn)行聚類分析，將其分成了四大類，其類黃酮含量大多集中在中類型種質(zhì)中，占比超過(guò)了80%，表明大多數(shù)種質(zhì)葉片類黃酮含量較高。

本研究對(duì)38 份歐李種質(zhì)葉片的類黃酮含量及DPPH 自由基清除率、酪氨酸酶抑制率進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，歐李種質(zhì)葉片的類黃酮與楊梅素和槲皮素呈負(fù)相關(guān)，與其他7 種組分呈正相關(guān)。類黃酮含量與DPPH 自由基清除率呈極顯著正相關(guān)，且兒茶素、表兒茶素與抗氧化活性呈極顯著正相關(guān)。李鑫等[27]研究發(fā)現(xiàn)，酚酸及黃烷-3-醇類物質(zhì)與抗氧化活性呈顯著正相關(guān)，說(shuō)明這兩類物質(zhì)在蘋果的抗氧化活性中可能起主要作用。這與本研究中兒茶素和表兒茶素等黃烷醇類物質(zhì)與DPPH 自由基清除率呈顯著正相關(guān)結(jié)果一致。王臨賓等[28]對(duì)蘋果葉的多酚純化后，發(fā)現(xiàn)蘋果葉多酚對(duì)DPPH 自由基清除能力有所增強(qiáng)。王磊[29]對(duì)天津等地14 種果樹(shù)葉的黃酮進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)其均有抗氧化和抑菌效果，表明部分黃酮類物質(zhì)有抗氧化效果，與本研究結(jié)果相同。

歐李葉片根皮素與酪氨酸酶抑制率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，且歐李葉片類黃酮抗氧化能力與酪氨酸酶抑制率之間呈負(fù)相關(guān)性，表明歐李葉片抗氧化和美白之間可能無(wú)相關(guān)關(guān)系。張國(guó)文等[30]發(fā)現(xiàn)根皮素對(duì)酪氨酸酶活性有一定的抑制作用，是一種潛在的可逆混合型酪氨酸酶抑制劑。而本研究發(fā)現(xiàn)根皮素與酪氨酸酶抑制率呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，可能是因?yàn)楸狙芯恐蟹N質(zhì)較少，且根皮素含量較低。宋建平等[31]發(fā)現(xiàn)三七葉黃酮提取物具有抗氧化能力，并且可以抑制酪氨酸酶活性，而抗氧化能力與抑制酪氨酸酶活性之間呈負(fù)相關(guān)性，表明三七葉的抗氧化作用是否與其美白功效有關(guān)，還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)測(cè)定38 份歐李種質(zhì)葉片類黃酮及9種(兒茶素、表兒茶素、甘草素、蘆丁、槲皮素、槲皮素-7-0-葡萄糖苷、楊梅素、光甘草定、根皮素)活性物質(zhì)含量，并分析其抗氧化及酪氨酸酶抑制率能力，確定了歐李03 - 25 品種的兒茶素含量最高為935.29 mg·100g-1，且兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素-7-0-葡萄糖苷與DPPH 自由基清除率呈極顯著正相關(guān)，表明其抗氧化能力較強(qiáng)；蘆丁、槲皮素-7-0-葡萄糖苷、光甘草定與酪氨酸酶抑制率有正相關(guān)關(guān)系。本研究為歐李后期葉片中抗氧化及抑制酪氨酸酶活性物質(zhì)的提取提供了理論依據(jù)，同時(shí)有利于歐李葉片功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。