宋潔玉 王松梅 汪萱怡復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海0000；復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院暨教育部/衛(wèi)生部醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海000；復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，上海000；上海市重大傳染病和生物安全研究院000；復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，上海0110

宋潔玉和王松梅對(duì)本文有同等貢獻(xiàn)

甲型肝炎是一種古老的疾病，主要通過(guò)糞-口途徑傳播，人群對(duì)其普遍易感[1-3]。甲型肝炎在世界各地均有流行，我國(guó)曾屬于甲型肝炎高度流行區(qū)[4]。1988年，由于江蘇呂泗港海域毛蚶被污染，導(dǎo)致上海甲型肝炎大流行，發(fā)病率超過(guò)4%，總臨床病例數(shù)高達(dá)29.2萬(wàn)[5]，之后，在黨和政府的大力支持和推動(dòng)下，我國(guó)甲型肝炎疫苗的研制開始加速，并獲得了成功，有效地控制了甲型肝炎在我國(guó)的流行。

一、我國(guó)已上市甲型肝炎疫苗的研制

我國(guó)甲型肝炎疫苗研制始于1985年，被列為國(guó)家“七五”重大科技攻關(guān)項(xiàng)目，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒所毛江森主持，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所與中國(guó)藥品生物制品檢定所共同參與開發(fā)。根據(jù)當(dāng)時(shí)的社會(huì)條件，我國(guó)甲型肝炎疫苗的研制首先采取減毒活疫苗，到“九五”期間，甲型肝炎滅活疫苗的研制又被列入國(guó)家重大科技攻關(guān)項(xiàng)目，由中國(guó)藥品生物制品檢定所李成明、張華遠(yuǎn)主持，聯(lián)合唐山怡安生物工程公司與中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所共同開發(fā)。迄今，我國(guó)共有2株減毒活疫苗、3株滅活疫苗批準(zhǔn)上市。

1.減毒活疫苗H2株

1978年9—12月，杭州近郊一個(gè)81戶486名居民的村莊因飲用水源污染，導(dǎo)致67人罹患甲型肝炎。毛江森等在調(diào)查中對(duì)該村56名17歲以下與一代病例有接觸史、尚未發(fā)病的居民進(jìn)行糞便樣本采集，隨后其中26名被診斷為甲型肝炎[6]。從這批病例黃疸前期或轉(zhuǎn)氨酶升高前的糞便樣本中初提取到3份病毒抗原液，分別命名為杭州甲-1、杭州甲-2與杭州甲-3，其中杭州甲-2來(lái)自于樣本號(hào)為T-086的12歲男性病例糞便樣本，抗原滴度較高[6-7]。1980年，用原代猴腎細(xì)胞于35℃培養(yǎng)分離而獲得原代野生毒株H2株。1985年，毛江森等與中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所董德祥等合作，將分離的病毒通過(guò)細(xì)胞傳代減毒，先在原代猴腎細(xì)胞中傳20代，其中前15代置35℃，后5代置32℃，為H2M20株；其后再在KMB17人胚肺二倍體細(xì)胞于32℃連續(xù)傳5代[8]。其安全性和免疫原性得以證實(shí)，由此建立了疫苗種子庫(kù)的原始種子[9]。K5株再用KMB17細(xì)胞傳2代，獲得H2M20K7（K7）株為主種子；K7株再經(jīng)KMB17細(xì)胞連續(xù)傳代三次，建立了K10株為工作種子[8]。1987年用K5株生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)性疫苗在12名18~27歲健康志愿者中進(jìn)行了安全性與免疫原性的初步觀察[10]，其后至1989年又在11 439名4~12歲兒童中進(jìn)一步驗(yàn)證了安全性與免疫效果[11]。1992年3月獲原衛(wèi)生部頒發(fā)的新藥證書。

2.減毒活疫苗LA-1株

1980年底，黑龍江省的幾個(gè)托兒所發(fā)生了甲型肝炎流行，黑龍江省衛(wèi)生防疫站從住院患兒發(fā)病早期收集的糞便樣本中獲得了一批抗原液，命名為龍甲-X，其中龍甲-1糞便樣本來(lái)自哈爾濱市1例2歲王姓男患兒[12]。1983年底，上海市衛(wèi)生防疫站胡孟冬與黑龍江省衛(wèi)生防疫站合作，從龍甲-1抗原液中用人胚肺二倍體細(xì)胞（SL7）于32℃培養(yǎng)分離到HAV，為L(zhǎng)A-1原代野生毒株[13]。該毒株先經(jīng)SL7細(xì)胞于32℃?zhèn)?代，后經(jīng)人胚肺二倍體細(xì)胞2BS分別于32℃條件下傳4代和35℃條件下傳7~14代，進(jìn)行絨猴感染實(shí)驗(yàn)及攻擊保護(hù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，獲得LA-1減毒株[14]。1989—1991年，實(shí)驗(yàn)性疫苗在380名健康志愿者（主要為12歲以下兒童）中進(jìn)行了安全性與免疫原性研究[15-16]，于1992年獲原衛(wèi)生部頒發(fā)的新藥證書。

3.滅活疫苗TZ-84株

1983年10月，河北省唐山農(nóng)村發(fā)生甲型肝炎暴發(fā)事件，唐山市衛(wèi)生防疫站尹衛(wèi)東收集了患者早期的糞便，于1984年同中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒學(xué)研究所一起用人胚肺二倍體細(xì)胞2BS，從1例唐山5歲張姓女患兒糞便中分離到TZ-84原代野生毒株[17]。TZ-84株在2BS細(xì)胞中于32℃?zhèn)鞔?，?gòu)建了疫苗用毒株，由此毒株制備成甲型肝炎滅活疫苗[18]。1998—1999年以葛蘭素史克公司的甲型肝炎滅活疫苗作為對(duì)照疫苗，TZ-84株制備的疫苗在18～22歲和5～15歲成人與兒童易感人群中均具有良好的安全性和免疫原性[19-20]。該疫苗自1996年開始研制，2002年獲新藥證書。

4.滅活疫苗Lv-8株

1988年初，上海及周邊甲型肝炎大流行，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所從南通呂泗鎮(zhèn)甲型肝炎患者中收集發(fā)病早期糞便樣本，其中樣本號(hào)為呂8、合34與合52的糞便樣本于1988年4月用人胚肺二倍體細(xì)胞KMB17在35℃進(jìn)行了病毒分離[21]。呂8樣本分離的毒株在KMB17細(xì)胞上35℃培養(yǎng)28 d適應(yīng)6代，再以12 d為一代適應(yīng)培養(yǎng)19代共25代，測(cè)定其感染性滴度達(dá)8.22 log10CCID50/mL，作為甲型肝炎滅活疫苗候選株[22]，此候選毒株制備的滅活疫苗接種普通狨猴和恒河猴均有較好的抗體反應(yīng)，可抵抗HAV強(qiáng)毒株的攻擊[22-23]。2001年在廣西176名兒童與206名成人中進(jìn)行臨床試驗(yàn)，結(jié)果具有良好安全性和免疫原性[24]，2003年獲國(guó)家藥品食品監(jiān)督管理局新藥證書。

5.滅活疫苗YN5

1995年3—9月，云南沃森生物技術(shù)有限公從昆明鐵路中心醫(yī)院收集到6份甲型肝炎急性期患者糞便，分別編號(hào)為YN1~YN6。于35℃接種人胚肺二倍體細(xì)胞2BS，傳5代后轉(zhuǎn)而接種Vero細(xì)胞35℃再傳14代，結(jié)果僅有YN5株能適應(yīng)Vero細(xì)胞，感染性滴度達(dá)8.23 log10CCID50/mL[25]。該毒株經(jīng)傳代后作為候選毒株并制備滅活疫苗，疫苗接種普通狨猴具有較好的免疫原性[26-27]，該候選疫苗于2004年12月至2005年7月在廣西開展臨床試驗(yàn)，于2009年2月由上海澤潤(rùn)生物科技有限公司獲國(guó)家藥品食品監(jiān)督管理局新藥證書。

二、我國(guó)甲型肝炎疫苗的有效性與持久性研究

作為國(guó)家“八五”重大科技攻關(guān)項(xiàng)目，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所董德祥主持，于1991年在湖南、四川、廣東、云南和山東5個(gè)省采用非隨機(jī)對(duì)照的開放性設(shè)計(jì)，對(duì)H2株與LA-1株減毒活疫苗進(jìn)行了大規(guī)模人群（92 700名受試對(duì)象）保護(hù)效果觀察。結(jié)果表明減毒活疫苗安全性良好。對(duì)湖南株州和岳陽(yáng)兩地前瞻性隊(duì)列研究結(jié)果進(jìn)行分析，2種疫苗保護(hù)效果均在90%以上[28]。

上海醫(yī)科大學(xué)徐志一在河北正定、江蘇蘇州采用隨機(jī)對(duì)照開放性試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在57 700名0~13歲兒童中評(píng)價(jià)了H2株與LA-1株減毒活疫苗效力：河北正定現(xiàn)場(chǎng)測(cè)得H2株疫苗效力為70.9%[29]；蘇州現(xiàn)場(chǎng)測(cè)得H2株與LA-1株疫苗效力分別為76.1%與72.4%。應(yīng)用Abbott試劑與WHO anti-HAV標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得H2株和LA-1株疫苗1劑免后3個(gè)月的抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分別為36.3%和35.3%[30]。大規(guī)模的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，1劑減毒活疫苗接種后免疫原性及效力均不理想，可能是疫苗滴度偏低（估計(jì)約為5.0～5.5log10CCID50/mL）所致。為此，1994年徐志一在河北正定將甲型肝炎易感兒童隨機(jī)分為4組，分別接種劑量為106.83TCID50、106.5TCID50、106.17TCID50的活疫苗，以及將106.83TCID50劑量疫苗以60℃3 h滅活的疫苗，免后3個(gè)月抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率分別為95.7%、90.4%、79.5%與73.9%，呈明顯劑量效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果表明，提高疫苗滴度，有望提高抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率與保護(hù)率，規(guī)范化活疫苗劑量應(yīng)在106.5TCID50以上。此建議被原衛(wèi)生部采納，自1995年1月起，要求疫苗滴度提高到106.5TCID50以上[31]。

1996年，徐志一對(duì)提高滴度的減毒活疫苗在廣西、河北、上海等地457 251名受試對(duì)象中進(jìn)行隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)，隨訪3年評(píng)價(jià)免疫原性與保護(hù)效力。結(jié)果H2株（107.0TCID50）與LA-1株（106.75TCID50）疫苗保護(hù)效果均達(dá)95%，抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)率峰值分別出現(xiàn)在疫苗接種后2個(gè)月與6個(gè)月，為94.9%（GMT：131.3 mIU/mL）與86.0%（GMT：122.7 mIU/mL），具有很好免疫原性與保護(hù)效力[31]。

復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院汪萱怡通過(guò)對(duì)1996年在河北建立的甲型肝炎減毒活疫苗長(zhǎng)期縱向隊(duì)列持續(xù)17年的研究，發(fā)現(xiàn)接種疫苗1劑免后17年抗體陽(yáng)性率為68.4%，GMT為73.3 mIU/mL（95%CI：57.4~93.5 mIU/mL）[32]。選擇該隊(duì)列中一個(gè)村共51名觀察對(duì)象，檢測(cè)甲型肝炎減毒活疫苗1劑免疫后17年研究對(duì)象的外周血淋巴細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)所有研究對(duì)象中疫苗誘導(dǎo)的甲型肝炎特異性T細(xì)胞免疫記憶及B細(xì)胞免疫記憶均存在，無(wú)論甲型肝炎抗體陰性或陽(yáng)性，且免疫記憶應(yīng)答水平與其甲型肝炎抗體水平無(wú)關(guān)。上述研究對(duì)象再接種1劑活疫苗2周后檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，接種前無(wú)論抗體能否檢測(cè)到，再接種后均能誘導(dǎo)良好的細(xì)胞免疫，以CD8+T細(xì)胞免疫反應(yīng)最為顯著，反映了活疫苗的特性[33]。由此可知接種1劑活疫苗17年，抗體持久性及免疫記憶良好，無(wú)需進(jìn)行加強(qiáng)免疫。

之后，我國(guó)首個(gè)甲肝滅活疫苗（孩爾來(lái)福）也開展了多個(gè)臨床試驗(yàn)與上市后臨床研究，顯示了疫苗良好的安全性與有效性[34-35]。近期的一項(xiàng)隊(duì)列研究，將400名甲肝易感兒童按3∶1比例隨機(jī)分為2組，分別接種2劑TZ-84株滅活疫苗或葛蘭素史克公司滅活疫苗，隨訪11年后，2組甲型肝炎抗體陽(yáng)性率均為100%，GMT分別為166.2和117.1 mIU/mL。模型預(yù)測(cè)，以GMT的95%CI的下限大于20 mIU/mL為標(biāo)準(zhǔn)，TZ-84株滅活疫苗抗體至少可以維持30年[36]。

三、我國(guó)甲型肝炎疫苗的應(yīng)用成效

受益于甲型肝炎疫苗的成功研發(fā)和普及應(yīng)用，甲型肝炎流行在我國(guó)得到了很好的控制。1993年全國(guó)病毒性肝炎流行率調(diào)查顯示，全國(guó)抗-HAV IgG流行率為80.5%，城市兒童在10歲累積感染率達(dá)到50%，農(nóng)村地區(qū)更是在3歲即達(dá)50%，屬于典型的高流行區(qū)[37]。2000—2005年間，我國(guó)整體上甲型肝炎的流行模式完成了從高流行區(qū)到低流行區(qū)的轉(zhuǎn)換[38-39]，年發(fā)病率從1992年的56/10萬(wàn)下降到2020年的1.07/10萬(wàn)[40-41]。流行模式的這一快速轉(zhuǎn)換得益于我國(guó)經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展與國(guó)家的疫苗免疫政策：一方面20世紀(jì)90年代以來(lái)，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)總值（GDP）從1992年的4 269.1億美元上升到2020年的15.6萬(wàn)億美元，我國(guó)人民居住條件、衛(wèi)生條件及生活水平有了很大提高，甲型肝炎、細(xì)菌性痢疾等與衛(wèi)生條件密切相關(guān)的腸道傳染病發(fā)病率急劇下降[42]；另一方面，20世紀(jì)90年代初與2000年前后，甲型肝炎減毒活疫苗與滅活疫苗在我國(guó)相繼研制成功，隨即在青少年及兒童中大規(guī)模推廣應(yīng)用。2008年，我國(guó)更是將甲型肝炎疫苗納入兒童擴(kuò)大免疫規(guī)劃（EPI）項(xiàng)目，對(duì)1歲半兒童實(shí)行免費(fèi)接種。至2014年，我國(guó)5歲以下兒童甲型肝炎疫苗接種率達(dá)到91.7%，血清抗-HAV陽(yáng)性率達(dá)88.1%；5~9歲兒童接種率也達(dá)到81.6%，血清抗-HAV陽(yáng)性率達(dá)76.6%[43]。既往浙江椒江疫苗普種研究結(jié)果表明，隨著疫苗累積接種率在15歲以下兒童中達(dá)到90%以上，甲型肝炎年發(fā)病率從1990年剛引入疫苗時(shí)的77/10萬(wàn)下降到1999年的0；同時(shí)，15歲以上人群（未免疫）的年發(fā)病率亦從49.6/10萬(wàn)下降到1.2/10萬(wàn)，顯示了疫苗免疫消除人群甲型肝炎流行的可能與可及性[44]。相信伴隨我國(guó)經(jīng)濟(jì)水平持續(xù)提高，黨和政府的高度重視，甲型肝炎疫苗將更廣地普及應(yīng)用，必將更好地為國(guó)民健康保駕護(hù)航。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突