張 凱,馬靈珍
(1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)管理部,沈陽(yáng) 110032;2.亳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院,亳州 236800)
草香胃康膠囊由木香、阿魏、決明子、雞內(nèi)金、海螵蛸和牡蠣6味中藥制成,主治胃脘疼痛、饑后尤甚、泛吐酸水、食欲不佳和心煩易怒等肝氣犯胃所致胃痛、胃及十二指腸球部潰瘍、慢性胃炎等癥[1]。草香胃康膠囊現(xiàn)收載于《中國(guó)藥典》2015年版一部,標(biāo)準(zhǔn)中僅對(duì)佐藥決明子所含大黃酚進(jìn)行了定量研究,而大黃酚來(lái)源廣泛,作為草香胃康膠囊定量測(cè)定指標(biāo)成分專(zhuān)屬性不強(qiáng),同時(shí)檢索到與該制劑定量檢測(cè)相關(guān)的文獻(xiàn)也僅限單一組分檢測(cè)[2-6]。中藥及其制劑具有多靶點(diǎn)、整體協(xié)同作用等特點(diǎn),單一組分檢測(cè)具有一定的片面性,多指標(biāo)成分質(zhì)量控制模式近年來(lái)已廣泛應(yīng)用于其質(zhì)量控制中。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)君臣佐使中醫(yī)組方理論,選取以下成分為檢測(cè)指標(biāo):君藥木香所含指標(biāo)性成分木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯,臣藥阿魏所含活性成分阿魏酸,佐藥決明子所含代表性成分紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素,采用HPLC法同時(shí)測(cè)定草香胃康膠囊中7種成分的含量,并采用統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所測(cè)含量進(jìn)行聚類(lèi)分析,為全面評(píng)價(jià)草香胃康膠囊的整體質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持。
1.1儀器 Shimadzu LC-20A型高效液相色譜儀(日本島津公司);ME204E型電子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司);KQ-500E型臺(tái)式超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。
1.2試藥 對(duì)照品:阿魏酸(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.4%,批號(hào)110773-201915),木香烴內(nèi)酯(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.9%,批號(hào)111524-201911),去氫木香內(nèi)酯(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.5%,批號(hào)111525-201912),橙黃決明素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.3%,批號(hào)111900-201605),均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院;紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.5%,批號(hào)PRFM90308-04),美決明子素(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%,批號(hào)PRF8101721),均購(gòu)自成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司;決明子苷C(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.0%,批號(hào)CFS201901),購(gòu)自武漢天植生物技術(shù)有限公司。乙腈,色譜純,德國(guó)Merck公司;其他試劑均為分析純,均購(gòu)自上海吉至生化科技有限公司。草香胃康膠囊(規(guī)格:0.5 g·粒-1,批號(hào)分別為280084、280086、280088、280094、280102、280107、280063、280075、280077、280079,編號(hào)分別為S1~S10),均購(gòu)于廣西玉林制藥集團(tuán)有限責(zé)任公司。
2.1溶液的制備
2.1.1混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素對(duì)照品各適量,用甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.112、0.378、0.406、1.182、0.454、0.338、0.262 mg·mL-1的混合儲(chǔ)備液。精密吸取上述儲(chǔ)備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL,分別用甲醇稀釋至20 mL,制成系列溶液1~6;取系列溶液3作為混合對(duì)照品溶液(7種成分質(zhì)量濃度分別為5.6、18.9、20.3、59.1、22.7、16.9、13.1 μg·mL-1)。
2.1.2供試品溶液的制備 取草香胃康膠囊內(nèi)容物,研細(xì),精密稱(chēng)取1.0 g,加入25 mL甲醇,稱(chēng)質(zhì)量,超聲處理45 min,放冷后用甲醇補(bǔ)質(zhì)量,搖勻,用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò),即得草香胃康膠囊供試品溶液。取按草香胃康膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)處方比例及制法制備的缺木香、缺阿魏、缺決明子的陰性供試品適量,按上述方法制成陰性供試品溶液。
2.2色譜條件 以乙腈-1 mL·L-1甲酸為流動(dòng)相,流速:0.8 mL·min-1。梯度洗脫,洗脫程序:0~8 min,12%乙腈;8~19 min,12%~25%乙腈;19~27 min,25%~42%乙腈;27~36 min,42%~65%乙腈;36~40 min,65%~12%乙腈。Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。檢測(cè)波長(zhǎng):320 nm(0~12 min檢測(cè)阿魏酸)[5-11],225 nm(12~19 min檢測(cè)木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯)[12-15],284 nm(19~40 min檢測(cè)紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素)[16-19]。精密吸取2.1.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液及2.1.2項(xiàng)下溶液各10μL,進(jìn)樣分析檢測(cè),記錄色譜圖(圖1)。結(jié)果在供試品色譜圖中7種成分色譜峰峰形對(duì)稱(chēng),拖尾因子符合《中國(guó)藥典》規(guī)定,分離度均>1.5;理論板數(shù)按7種成分色譜峰計(jì)算均≥3 500,陰性樣品對(duì)草香胃康膠囊中7種成分的測(cè)定無(wú)干擾。
圖1 HPLC圖A.混合對(duì)照品溶液;B.供試品溶液;C.阿魏陰性樣品;D.木香陰性樣品;E.決明子陰性樣品;1.阿魏酸;2.木香烴內(nèi)酯;3.去氫木香內(nèi)酯;4.紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷;5.決明子苷C;6.橙黃決明素;7.美決明子素。Fig.1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance solution;B.sample solution;C.negative sample without Ferulae Resina;D.negative sample without Aucklandiae Radix;E.negative sample without Cassiae Semen;1.ferulic acid;2.costunolide;3.dehydrocostuslactone;4.rubrofusarin-6-O-β-gentiobioside;5.cassiaside C;6.aurantio-obtusin;7.obtusifolin.
2.3線性關(guān)系考察 精密吸取2.1.1項(xiàng)下6個(gè)系列溶液各10 μL,進(jìn)樣分析檢測(cè)草香胃康膠囊中7種成分的峰面積,以各成分的峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性回歸,得7種成分的回歸方程、線性范圍及r值。見(jiàn)表1。
表1 7種化合物的線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of the 7 constituents
2.4精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.1.1項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL,重復(fù)進(jìn)樣檢測(cè)6次,測(cè)得7種成分峰面積的RSD值分別為1.13%、0.99%、0.91%、0.56%、0.67%、0.83%、1.04%。
2.5重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取草香胃康膠囊6份,按2.1.2項(xiàng)下步驟配制供試品溶液,依法進(jìn)樣分析檢測(cè),記錄所檢測(cè)成分的峰面積,計(jì)算,得7種成分含量的RSD值分別為1.87%、1.63%、1.76%、0.92%、1.35%、1.69%、1.77%。
2.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按2.1.2項(xiàng)下步驟臨用新配1份草香胃康膠囊供試品溶液,于0、2、4、6、12、18 h進(jìn)樣檢測(cè)7種成分的峰面積,結(jié)果供試品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定,7種成分峰面積的RSD值分別為1.09%、1.01%、0.88%、0.57%、0.71%、0.82%、0.98%。
2.7回收率實(shí)驗(yàn) 取7種成分含量均已知的同一批草香胃康膠囊9份,傾出內(nèi)容物,研細(xì),精密稱(chēng)取0.5 g,3份,分別精密加入混合對(duì)照品溶液(根據(jù)樣品中化合物含量另行配制,7種成分質(zhì)量濃度分別為0.029、0.104、0.139、0.432、0.161、0.089、0.067 mg·mL-1)1.0、2.0、3.0 mL,再按2.1.2項(xiàng)下步驟制成加樣供試品溶液,進(jìn)樣分析檢測(cè)7種成分的峰面積并計(jì)算其含量。7種成分回收率及RSD值見(jiàn)表2。
表2 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (n=9)Tab.2 Results of recovery tests (n=9)
2.8樣品含量測(cè)定 取10個(gè)批次的草香胃康膠囊,按照2.1.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液,各批次平行制備3份,按照2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)7種成分的峰面積和含量,結(jié)果見(jiàn)表3。
表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of the sample content determination
2.9聚類(lèi)分析 為了考察不同批次草香胃康膠囊中7種成分的含量差異,采用SPSS 26.0軟件組間聯(lián)接聚類(lèi)方法,以歐氏距離為測(cè)度,對(duì)10批草香胃康膠囊進(jìn)行聚類(lèi)分析,結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知,當(dāng)類(lèi)間距離為10時(shí),10批樣品聚為4類(lèi),S1、S3、S2、S4聚為第一類(lèi),S5、S6聚為第二類(lèi),S9、S10、S8聚為第三類(lèi),S7為第四類(lèi);當(dāng)類(lèi)間距離為15時(shí),10批樣品聚為2類(lèi),第一類(lèi)和第二類(lèi)合并為一類(lèi),第三類(lèi)和第四類(lèi)合并為另一類(lèi)。由分類(lèi)結(jié)果可知,目標(biāo)化合物含量差異與樣品相關(guān),可能與草香胃康膠囊生產(chǎn)所用原藥材的產(chǎn)地來(lái)源、采收時(shí)節(jié)以及原藥材不同批次間的質(zhì)量差異有關(guān)。
圖2 10批草香胃康膠囊聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖Fig.2 Cluster analysis tree diagram of 10 batches of Caoxiang Weikang Capsules
3.1目標(biāo)化合物的確定 草香胃康膠囊由阿魏、木香、決明子、雞內(nèi)金、海螵蛸和牡蠣6味中藥材配伍而成,方中木香行氣止痛、健脾消食、調(diào)暢氣機(jī)而解郁,雞內(nèi)金健胃、消積食,共為君藥;阿魏消積化瘕,可增強(qiáng)君藥雞內(nèi)金的消食化積之功,為臣藥;決明子清熱明目、潤(rùn)腸通便,海螵蛸收斂止血、制酸止痛,牡蠣軟堅(jiān)散結(jié)、重鎮(zhèn)安神,共為佐使藥。諸藥合奏,以達(dá)泄肝和胃、行氣止痛的臨床功效。木香為菊科植物木香的干燥根,木香烴內(nèi)酯和去氫木香內(nèi)酯為其指標(biāo)性成分;阿魏為傘形科植物新疆阿魏或阜康阿魏的樹(shù)脂,阿魏酸為其主要活性成分;決明子為豆科植物決明或小決明的干燥成熟種子,紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素等為其代表性成分。本文參考中藥質(zhì)量標(biāo)志物確認(rèn)原則,選取阿魏酸、木香烴內(nèi)酯、去氫木香內(nèi)酯、紅鐮霉素-6-O-β-龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素和美決明子素為定量測(cè)定目標(biāo)成分,為全面評(píng)價(jià)草香胃康膠囊的整體質(zhì)量提供參考。
3.2流動(dòng)相的選擇 在進(jìn)行梯度洗脫時(shí),本實(shí)驗(yàn)先后考察了甲醇-水[12-13]、甲醇-3 mL·L-1冰醋酸[5-7]、乙腈-1 mL·L-1磷酸[16,18-21]和乙腈-1 mL·L-1甲酸[17]4個(gè)流動(dòng)相體系。結(jié)果顯示,以乙腈-1 mL·L-1甲酸為流動(dòng)相時(shí),基線平穩(wěn),7種成分色譜峰對(duì)稱(chēng)度良好,且與相鄰色譜峰分離效果較好。故采用乙腈-1 mL·L-1甲酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,同時(shí)檢測(cè)草香胃康膠囊中7種成分的含量。
本實(shí)驗(yàn)建立了能同時(shí)測(cè)定草香胃康膠囊中7種成分含量的HPLC法,該方法結(jié)果準(zhǔn)確、操作便捷,并對(duì)含量測(cè)定結(jié)果進(jìn)行了聚類(lèi)分析,有利于藥品生產(chǎn)企業(yè)和監(jiān)管部門(mén)不斷提升草香胃康膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),完善制劑生產(chǎn)所用原藥材的來(lái)源及內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn),確保藥品臨床療效一致性,為全面、科學(xué)地評(píng)價(jià)草香胃康膠囊的整體質(zhì)量提供參考。