楊占華 郝連升 張建新

1.聊城市中醫(yī)醫(yī)院骨科，山東 聊城 252000 2.山東省中醫(yī)院骨科，山東 濟(jì)南 250011

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量減低，骨強(qiáng)度降低，骨微細(xì)結(jié)構(gòu)退化，骨脆性增加，易發(fā)生骨折為特征一種全身性代謝性骨骼疾病[1]。隨著我國人口老齡化進(jìn)程加快，其發(fā)病率逐年增加，給家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)。研究表明活性氧(reactive oxygen species，ROS)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)(oxidative stress，OS)會(huì)引起骨重建穩(wěn)態(tài)的改變，使骨吸收增加、骨形成減少，引發(fā)OP[2]。中藥治療骨傷疾病歷史悠久，具有療效明顯，不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)葛根素能夠提高骨密度，改善骨代謝，同時(shí)提高雌激素水平，能有效緩解OP臨床癥狀[3-4]。本研究通過觀察葛根素對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)、骨代謝和骨密度的影響，探討葛根素防治OP的作用機(jī)制，以期為OP的防治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

健康SPF級(jí)13周齡雌性(SD大鼠50只)，未孕，體重230～260 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)：SYXK(京)2019-0005]，飼養(yǎng)于山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)條件：2～3只/籠，恒溫恒濕，人工光照明暗各12 h/d，自由飲食水。葛根素注射液(生產(chǎn)批號(hào)：1902068，陜西安康制藥廠)，苯甲酸雌二醇(生產(chǎn)批號(hào)：1905012，浙江仙居制藥廠)。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和過氧化氫(H2O2)試劑盒均購于南京建成生物工程研究所，核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)、人抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP5b)、骨鈣素(BGP)和I型原膠原分子N端前肽(PINP)試劑盒均購于武漢華美生物工程有限公司。Lunar DXA型雙能X射線骨密度檢測(cè)儀購于美國GE公司。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型：參照文獻(xiàn)“雙側(cè)卵巢摘除手術(shù)”構(gòu)建骨質(zhì)疏松大鼠動(dòng)物模型[5]，嚴(yán)格無菌操作，于大鼠背部正中線做長約3 cm縱向切口，鈍性分離，逐層進(jìn)入腹腔，找到一側(cè)粉紅色菜花狀卵巢，線結(jié)扎輸卵管，切除卵巢并止血，同樣操作切除對(duì)側(cè)卵巢，徹底止血后間斷縫合，青霉素5萬U/d預(yù)防感染治療3 d，1周后拆線。假手術(shù)組不切除卵巢，僅在卵巢周圍切除等量脂肪組織，其他操作步驟相同。術(shù)后所有大鼠均在同等條件下單籠飼養(yǎng)，自由飲水、活動(dòng)，標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)。

1.2.2分組及藥物處理：造模成功評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：造模6周后骨密度(BMD)峰值減少≥2.5 SD(標(biāo)準(zhǔn)差)，SD大鼠造模成功44只，造模成功率：88 %。按隨機(jī)數(shù)字表法分：對(duì)照組、造模組、雌二醇組、葛根素組，確認(rèn)造模成功后第2 d給予藥物干預(yù)，對(duì)照組和造模組：0.9 % NaCl 5 mL/kg；葛根素組：葛根素35 mg/kg，1次/d；雌二醇組：雌二醇150 μg/kg，皮下注射，1次/d，連續(xù)給藥6周。

1.2.3標(biāo)本取材：藥物干預(yù)6周結(jié)束后，10 %水合氯醛(3.5 mL/kg)腹腔注射麻醉，股動(dòng)脈取血，4 ℃，3 000 r/min離心5 min，分離血清-20 ℃保存待測(cè)。解剖雙側(cè)股骨和腰椎(L5)，0.9 % NaCl沖洗，用生理鹽水紗布包裹待測(cè)骨密度，另取股骨，4 %多聚甲醛固定24 h，15 %乙二胺四乙酸(EDTA-2Na)脫鈣14 d。

1.2.4檢測(cè)各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)：取出上清液，采用ELISA法檢測(cè)各組血清MDA、CAT、SOD和GSH水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.5檢測(cè)各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)：取出上清液，采用ELISA法檢測(cè)各組血清TRACP5b、RANKL、PINP和BGP水平，嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.6檢測(cè)各組大鼠骨組織氧化應(yīng)激指標(biāo)：取出股骨，將其轉(zhuǎn)入裝有液氮的研缽中磨成粉末狀，取0.05 g，加PBS，轉(zhuǎn)移至勻漿器，4 ℃，3 000 r/min，離心5 min，收集上清液，得到樣本蛋白。采用BCA法檢測(cè)各組指標(biāo)，嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.7檢測(cè)各組大鼠骨組織骨密度(BMD)：取大鼠L5椎體和右側(cè)股骨，在Lunar DXA型雙能X線吸收掃描儀掃測(cè)，采用小物體Discovery Wi掃描模式，用儀器選定興趣區(qū)，以2.0 mm*2.0 mm為中心區(qū)域，軟件分析計(jì)算BMD值。

1.2.8蘇木精-伊紅(HE)染色法觀察骨組織形態(tài)學(xué)：參照HE染色法操作步驟，制作石蠟切片，脫蠟去水、蘇木精-伊紅染色，1 %鹽酸乙醇分化，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡觀察染色效果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)

造模組大鼠血清SOD和GSH-Px較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，雌二醇組、葛根素組SOD和GSH-Px較造模組均顯著升高(P<0.05)，葛根素組升高幅度大于雌二醇組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模組大鼠血清H2O2和MDA較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，雌二醇組、葛根素組H2O2和MDA較造模組均顯著降低(P<0.05)，葛根素組降低幅度大于雌二醇組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清氧化應(yīng)激指標(biāo)比較Table 1 Comparison of serum oxidative stress indicators among rats in each

2.2 各組大鼠血清骨代謝生化指標(biāo)

造模組大鼠血清TRACP5b、RANKL、PINP和BGP較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，雌二醇組、葛根素組TRACP5b、RANKL、PINP和BGP較造模組均顯著降低(P<0.05)，葛根素組降低幅度大于雌二醇組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組大鼠血清骨代謝生化指標(biāo)比較Table 2 Comparison of serum bone metabolism and biochemical indexes among rats in each

2.3 各組大鼠骨組織氧化應(yīng)激指標(biāo)

造模組大鼠骨組織SOD和GSH-Px水平較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，雌二醇組、葛根素組SOD和GSH-Px水平較造模組均顯著升高(P<0.05)，葛根素組升高幅度大于雌二醇組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；造模組大鼠骨組織H2O2和MDA水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)，雌二醇組、葛根素組H2O2和MDA水平較造模組均顯著降低(P<0.05)，葛根素組降低幅度大于雌二醇組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠骨組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較Table 3 Comparison of oxidative stress indexes in the bone tissue among rats in various

2.4 各組大鼠骨組織BMD

造模組大鼠腰椎和股骨BMD較對(duì)照組顯著降低(P<0.05)，雌二醇組、葛根素組BMD較造模組均顯著升高(P<0.05)，葛根素組升高幅度大于雌二醇組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4 各組大鼠骨組織BMD比較Table 4 Comparison of BMD among rats in each

2.5 各組大鼠骨形態(tài)學(xué)

對(duì)照組骨皮質(zhì)骨板層次清晰，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，骨小梁排列規(guī)則有序，粗大，骨細(xì)胞清晰完整，形態(tài)正常，造血細(xì)胞豐富。造模組骨皮質(zhì)明顯變薄，典型骨質(zhì)疏松改變，骨小梁明顯稀疏，排列紊亂，間距增寬，髓腔明顯擴(kuò)大，形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整，骨細(xì)胞明顯減少，脂肪空泡增多。葛根素組和雌激素組骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)尚完整，新生骨小梁數(shù)量增多，小梁稍細(xì)但排列較規(guī)則，髓腔稍小，連續(xù)性、完整性較好。見圖1。

注：A 對(duì)照組；B 造模組；C 雌二醇組；D 葛根素組。圖1 HE染色觀察股骨組織病理學(xué)變化(200*)Fig.1 HE staining to observe the pathological changes of the femur(200*)

3 討論

雌激素水平下降一直被認(rèn)為是導(dǎo)致女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的主要機(jī)制，然而補(bǔ)充雌激素骨質(zhì)疏松癥并未得到明顯改善，深入研究發(fā)現(xiàn)雌激素對(duì)骨質(zhì)疏松的防治作用可能與其全身抗氧化作用有關(guān)[6-7]。雌激素分泌減少、ROS增加是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)發(fā)生的重要原因[8]。OS是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的重要發(fā)病機(jī)制[9]。研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)積累過多的ROS通過調(diào)控多條細(xì)胞信號(hào)通路，干預(yù)骨形成相關(guān)細(xì)胞的凋亡和破骨細(xì)胞的增殖及分化，使骨形成小于骨吸收，打破骨重建的動(dòng)態(tài)平衡過程[10-11]。本研究同樣表明骨質(zhì)疏松造模組大鼠血清和骨組織氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、GSH-Px水平顯著升高，MDA、H2O2水平顯著降低。說明氧化應(yīng)激反應(yīng)參與PMOP的發(fā)生。同樣研究[12]表明骨質(zhì)疏松可顯著改變氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、GSH-Px、MDA和H2O2水平。孫振雙等[13]研究發(fā)現(xiàn)去卵巢大鼠BMD明顯降低，血清MDA活力升高，CAT活力下降，血清TRACP5b、BGP、PINP水平升高，而OPG、OPG/sRANKL比值下降，骨形態(tài)改變與骨質(zhì)疏松癥一致。

中醫(yī)學(xué)將骨質(zhì)疏松癥歸屬“骨痿、骨枯、骨痹”范疇，中醫(yī)認(rèn)為腎藏精，主骨生髓，腎虛則骨質(zhì)生成不足，絕經(jīng)后，精虧髓少，骨失充養(yǎng)而筋骨不堅(jiān)[14]。近年來中草藥植物雌激素在防治OP方面引起學(xué)者的廣泛關(guān)注，其具有多種藥理活性，藥效明確，且可減少雌激素的不良反應(yīng)。葛根素是一種異黃酮類植物雌激素，結(jié)構(gòu)類似雌二醇，具有雌激素樣作用[15]。葛根素可與骨細(xì)胞雌激素受體(ER)結(jié)合，促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖與分化、增加骨密度和骨強(qiáng)度，同時(shí)能直接抑制破骨細(xì)胞骨吸收，具有抗骨吸收、促進(jìn)骨形成作用[16-17]。本研究表明葛根素能顯著升高骨質(zhì)疏松大鼠血清和骨組織氧化應(yīng)激指標(biāo)H2O2和MDA，顯著降低血清和骨組織氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD和GSH-Px水平，顯著降低血清骨代謝指標(biāo)PINP、TRACP5b、BGP和RANKL水平，顯著提高骨組織BMD，顯著改善骨組織病理形態(tài)結(jié)構(gòu)，且其效果優(yōu)于雌激素。表明葛根素通過增強(qiáng)骨質(zhì)疏松大鼠體內(nèi)抗氧化酶活性和抗氧化能力，改善機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)，降低骨代謝高轉(zhuǎn)換水平，從而提高骨密度，改善骨組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。說明氧化應(yīng)激與骨代謝和骨密度密切相關(guān)，即氧化應(yīng)激的改變，導(dǎo)致骨代謝、骨密度的異常的，葛根素可以改善這一趨勢(shì)。同樣，王昌等[18]發(fā)現(xiàn)葛根素對(duì)成骨細(xì)胞具有清除自由基、活性氧和抗氧化，增加成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化功能作用。Zhao等[19]研究發(fā)現(xiàn)葛根素提高體內(nèi)SOD的活性，降低MDA水平，保護(hù)機(jī)體免受超氧化應(yīng)激損傷。申彥菊等[20]研究發(fā)現(xiàn)葛根素聯(lián)合阿侖膦酸鈉可升高PMOP患者E2水平，顯著增強(qiáng)骨密度，具有較高的安全性。

綜上所述，葛根素通過調(diào)控去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，改善骨代謝指標(biāo)，降低骨轉(zhuǎn)換，減少骨吸收，提高骨密度，改善骨組織結(jié)構(gòu)，而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用。但本研究是以實(shí)驗(yàn)研究為主，缺乏大樣本、多中心的臨床試驗(yàn)對(duì)照研究，同時(shí)葛根素抗氧化應(yīng)激防治OP的具體作用機(jī)制目前尚未完全闡明，有待進(jìn)一步研究。我國擁有豐富的中醫(yī)藥資源，相信隨著研究的不斷深入，立足于葛根素抗氧化的研究或許可為骨質(zhì)疏松的防治提供新的方法，具有良好的科研前景。