陳錦成 朱國(guó)濤 劉洪文 余博飛 陳彥丞 羅駿 秦曉飛 徐杰*

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)骨傷及運(yùn)動(dòng)康復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122 2.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院(福建省立醫(yī)院)骨科，福建 福州 350001

“肌少-骨質(zhì)疏松癥”(sarco-osteoporosis，SO)是當(dāng)今世界各國(guó)老齡化社會(huì)正在面臨的突出問(wèn)題，肌少癥(sarcopenia)的臨床特征是的肌肉強(qiáng)度減退和(或)全身肌肉量占比減少或肌肉機(jī)能衰退[1-2]，其病程與自然增齡密切相關(guān)。骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)的臨床特征是骨量逐步縮減、骨結(jié)構(gòu)逐步退化和骨脆性事件增多，其屬于系統(tǒng)性骨病的范疇，OP全身性退化常伴隨的情況是骨折發(fā)生率的增高[3]。生物體是由蛋白質(zhì)構(gòu)成的，為了在蛋白水平更進(jìn)一步研究肌少-骨質(zhì)疏松癥的病理機(jī)制，本研究團(tuán)隊(duì)從基因組學(xué)逐步深入到蛋白組學(xué)相關(guān)領(lǐng)域研究，重點(diǎn)開(kāi)展差異蛋白之間的相互作用機(jī)制研究與功能信息分析；本研究團(tuán)隊(duì)采用Label-free定量蛋白組學(xué)手段對(duì)SO與OP患者骨組織樣品蛋白定量和篩選差異蛋白以及差異蛋白功能分析[4]，為SO致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)，以推動(dòng)SO生物檢測(cè)指標(biāo)的確定、有效治療藥物和設(shè)備開(kāi)發(fā)工作[5]。

1 材料和方法

1.1 納入研究對(duì)象的基本資料

隨機(jī)抽取在2017年8月至2018年8月期間于福建省醫(yī)院骨二科行手術(shù)治療的股骨頸骨折病人6例，自愿參與本臨床研究，所有納入的6例研究對(duì)象經(jīng)告知研究方案后均能主動(dòng)簽署知情同意書(shū)；根據(jù)生物學(xué)重復(fù)原則選取SO組與OP組各3例，兩個(gè)組的研究對(duì)象在族裔、性別和年齡等方面差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 臨床病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

臨床病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 臨床病例納入及排除標(biāo)準(zhǔn)詳情 Table 1 Details of inclusion and exclusion criteria of the clinical cases

1.3 樣品取樣

在手術(shù)臺(tái)上切取兩組研究對(duì)象骨組織樣品(2～5 g)，然后修剪成邊長(zhǎng)0.5 cm的小塊(重量100 mg)裝入小管中，液氮速凍5 min以上，保存于超低溫-80 ℃(Eppendorf)冰箱中，樣品用于后續(xù)上機(jī)定量蛋白檢測(cè)與分析。術(shù)中采樣統(tǒng)一由經(jīng)驗(yàn)豐富的主任醫(yī)師完成；本項(xiàng)目已申請(qǐng)并通過(guò)福建省立醫(yī)院(本部)倫理委員會(huì)研討與批準(zhǔn)(審批編號(hào)：K2019-03-034)。

1.4 Label-free定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析

1.4.1試劑材料與設(shè)備：試劑材料與設(shè)備見(jiàn)表2。

表2 實(shí)驗(yàn)試劑材料與主要儀器設(shè)備 Table 2 Experimental reagent materials and main equipments

1.4.2提取總蛋白：骨組織樣品從超低溫(-80 ℃)冰箱的凍存盒中取出，先在液氮中研磨，然后用1.5 mL的EP 管將研磨好骨組織收集并標(biāo)記好，加入蛋白裂解混合液(50 mmol/L Tris-HCl、8 mol/L尿素、0.2 %SDS、pH=8)以裂解骨組織樣本；然后開(kāi)啟并預(yù)冷機(jī)器至4 ℃，12 000g離心至少15 min，收集上清，移液器吸取4倍上清體積的冷丙酮(含終濃度為10 mmol/L DTT)加入混合，沉淀2 h；再次4 ℃，12 000g離心時(shí)間為15 min，收集沉淀；加入800 μL 的冷丙酮(含終濃度為10 mmol/L DTT)重懸沉淀，清洗各種雜質(zhì)；離心，收集沉淀，超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干沉淀。加入600 μL 8 mol/L Urea(50 mmol/L Tris buffer，8 mol/L Urea，pH=8)溶解蛋白。骨組織蛋白樣品進(jìn)行BCA定量，科研筆記本記錄實(shí)驗(yàn)定量結(jié)果。

1.5 蛋白質(zhì)量檢測(cè)

預(yù)制備好BSA標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品液體，將G250工作液按試劑說(shuō)明中微孔板法依次向標(biāo)準(zhǔn)品與待測(cè)樣品孔中加入一定量，室溫(37 ℃)孵育5 min，在酶標(biāo)儀機(jī)器上的A595 nm波長(zhǎng)位置檢測(cè)吸光度值。準(zhǔn)備好待測(cè)樣品，取出20 μL稀釋好的蛋白溶液，放置在96孔酶標(biāo)板的其他位置，復(fù)孔3個(gè)。各組樣品10 %SDS-PAGE電泳，用考馬斯亮藍(lán)對(duì)電泳后的凝膠進(jìn)行處理、洗脫液反復(fù)洗脫、蛋白條帶清晰后分析。

1.6 蛋白質(zhì)酶解

從各實(shí)驗(yàn)樣品中提取蛋白質(zhì)約100 μg，加入2 μL胰酶(濃度：1 g/L)和500 μL TEAB(100 mmol/L)溶液；快速震蕩和渦旋混勻，微量高速離心；放置在 37 ℃水浴中，過(guò)夜酶解16 h左右；次日取出，或凍存-20 ℃，或直接使用。

1.7 質(zhì)譜上機(jī)進(jìn)行液質(zhì)檢測(cè)

A液(100 %水+0.1 %甲酸)和B液(80 %乙腈+0.1 %甲酸)液體預(yù)制備；使用Q ExactiveTMHF-X(Thermo公司，型號(hào)：Easy nanoLC 1200)質(zhì)譜儀進(jìn)行原始數(shù)據(jù)質(zhì)控并上機(jī)檢測(cè)。

1.8 Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索

采用Proteome Discoverer線上軟件(Thermo，版本2.2)開(kāi)始蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)的檢索與分析；將SO組和OP組之間蛋白定量差異顯著的 (FC≥2.0，且P≤0.05時(shí)，標(biāo)記為上調(diào)表達(dá)蛋白；當(dāng)FC≤0.60，且P≤0.05時(shí)，標(biāo)記為下調(diào)表達(dá)蛋白) 定義為差異表達(dá)蛋白。

1.9 差異蛋白信息分析

使用GO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.geneontology.org/)分別對(duì)SO組與OP組的細(xì)胞組分(CC)、分子功能(MF)和生物過(guò)程(BP)進(jìn)行分析；在KEGG軟件(http://www.genome.jp/kegg/)中進(jìn)行差異蛋白的富集通路重點(diǎn)分析，旨在確定差異蛋白最主要參與哪些代謝途徑和調(diào)控哪些相關(guān)的信號(hào)通路，還可以明確差異蛋白之間相互協(xié)調(diào)以啟動(dòng)其生物學(xué)行為發(fā)揮調(diào)控作用。

2 結(jié)果

2.1 Label-free質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢測(cè)結(jié)果與差異蛋白分析

在SO組和OP組樣品中共篩選出1 395個(gè)差異蛋白，定義為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白共30個(gè)，上調(diào)蛋白篩選出21個(gè)，下調(diào)蛋白篩選出9個(gè)(表3)；對(duì)這30個(gè)蛋白進(jìn)行差異分析可知有12個(gè)蛋白與代謝途徑密切相關(guān)，還有一些重要的差異表達(dá)蛋白則參與了細(xì)胞氧化還原過(guò)程，部分差異表達(dá)蛋白可以通過(guò)氧化磷酸化途徑激活氧化還原酶活性，這提示了提高機(jī)體成骨細(xì)胞和成肌細(xì)胞抗氧化活性對(duì)于延緩SO進(jìn)程意義重大。此外，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的重要成分如肌球蛋白輕鏈激酶2、骨調(diào)節(jié)蛋白前體微管蛋白β-1鏈，這些差異蛋白的激活在調(diào)節(jié)骨礦化、細(xì)胞外基質(zhì)形成和調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架組織以及在肌少癥罹患骨質(zhì)疏松癥病程進(jìn)展中扮演重要角色；根據(jù)SO組與OP組的蛋白差異分析結(jié)果繪制了火山圖(圖1)；并運(yùn)用聚類熱圖分析在組間比較的上調(diào)與下調(diào)差異蛋白表達(dá)水平(圖2)。

表3 差異顯著的蛋白質(zhì)詳細(xì)信息 Table 3 Details of significantly different proteins

續(xù)表3 差異顯著的蛋白質(zhì)詳細(xì)信息Continued table 3 Details of significantly different proteins

注：橫坐標(biāo)log2值定為差異倍數(shù)，縱軸的-log10值則定為P-value，差異表達(dá)的閾值用黑色的虛線來(lái)表示(臨界值=倍數(shù)變化>1.30或<0.83，P值<0.05)；上調(diào)的蛋白則是紅色散點(diǎn)來(lái)標(biāo)記，下調(diào)的蛋白則是綠色散點(diǎn)來(lái)標(biāo)記，還有差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的蛋白則用黑色散點(diǎn)來(lái)標(biāo)記。圖1 差異蛋白質(zhì)火山圖Fig.1 Volcano diagram of the differentially expressed proteins

2.2 GO功能富集分析

將篩選出的蛋白質(zhì)運(yùn)用GO數(shù)據(jù)庫(kù)[6]進(jìn)行重點(diǎn)分析其蛋白主要參與的生物過(guò)程、分子功能和細(xì)胞組分的作用；GO數(shù)據(jù)庫(kù)注釋結(jié)果顯示，共3 322個(gè)蛋白質(zhì)有GO注釋結(jié)果，其中運(yùn)用生物信息學(xué)方法和專業(yè)軟件對(duì)鑒定到的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行GO富集分析，有856個(gè)屬于BP，782屬于CC，1 684個(gè)屬于MF；通過(guò)注釋結(jié)果可知這些差異蛋白可能參與細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)、氧化還原過(guò)程、氧化磷酸化過(guò)程及代謝過(guò)程等。

2.3 差異蛋白KEGG富集與功能分析

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)[7]的注釋結(jié)果，充分運(yùn)用差異蛋白KEGG富集氣泡圖來(lái)梳理注釋結(jié)果(圖3)；通過(guò)KEGG富集氣泡圖分析可知，SO組代謝途徑與蛋白加工受到影響，從而影響蛋白質(zhì)合成，最終可能會(huì)抑制成肌、成骨分化與增殖；此外，從SO組與OP組比較中得到的GO去除冗余結(jié)果的柱狀圖，經(jīng)過(guò)分析也同樣富集到差異蛋白的氧化還原途徑與代謝途徑相關(guān)的生物過(guò)程功能。

2.4 差異蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖分析

在基因測(cè)序的同時(shí)，越來(lái)越多的研究需要借助蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)解釋各種生物學(xué)現(xiàn)象。本研究團(tuán)隊(duì)使用String DB數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)分析了SO實(shí)驗(yàn)組(TB1)與OP對(duì)照組(CB1)之間的特征性蛋白互相關(guān)系與作用機(jī)制，并且以隨機(jī)式互作網(wǎng)絡(luò)圖更直觀和形象的呈現(xiàn)出來(lái)(圖4)。

注：樣品的聚類是縱向排列，蛋白的聚類則是橫向排列，相似性越高則聚類枝越短；上調(diào)的蛋白對(duì)應(yīng)紅色標(biāo)記，藍(lán)色則表示下調(diào)的蛋白；蛋白質(zhì)的表達(dá)水平則通過(guò)顏色強(qiáng)度來(lái)指示。圖2 差異顯著蛋白表達(dá)聚類熱圖Fig.2 Clustering heat map of significantly different protein expression

注：TB1表示：SO實(shí)驗(yàn)組；CB1表示：OP對(duì)照組；圖中橫坐標(biāo)Ratio比值為所篩選的差異蛋白個(gè)數(shù)/共鑒定到總蛋白個(gè)數(shù)，差異蛋白在通路的富集程度的高低通過(guò)Ratio數(shù)值的大小反應(yīng)；-log10(P-value)的值用不同顏色的小圓點(diǎn)表示，當(dāng)檢驗(yàn)越具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義和可靠性越大時(shí)其值越??；相應(yīng)通路中差異蛋白的數(shù)目通過(guò)點(diǎn)的大小來(lái)表示，當(dāng)通路內(nèi)差異蛋白越多則其相應(yīng)的點(diǎn)越大。圖3 KEGG富集氣泡圖Fig.3 KEGG enriched bubble chart

注：圖中每一個(gè)蛋白用一個(gè)節(jié)點(diǎn)來(lái)表示，互作的蛋白越多則相應(yīng)的節(jié)點(diǎn)越大；蛋白上調(diào)表達(dá)為紅色節(jié)點(diǎn)，蛋白下調(diào)表達(dá)為藍(lán)色節(jié)點(diǎn)。圖4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Diagram of the protein interaction network

3 討論

本研究團(tuán)隊(duì)在SO與OP骨組織樣品差異蛋白質(zhì)譜研究中采用Label-free 技術(shù)(數(shù)據(jù)掃描模式：DDA)篩選與鑒定出過(guò)氧化物酶-1、潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β結(jié)合蛋白1亞型X1、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A (mitochondrial transcription factor A，TFAM)、細(xì)胞色素C氧化酶等4個(gè)差異蛋白，并通過(guò)結(jié)合文獻(xiàn)資料梳理上述4個(gè)差異蛋白的具體作用機(jī)制和調(diào)控功能，旨在為進(jìn)一步闡明肌少-骨質(zhì)疏松癥病理演變過(guò)程和臨床診治提供更多的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

顏曉芳等[8]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)成骨細(xì)胞Wnt通路相關(guān)蛋白表達(dá)被抑制時(shí)，過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ(peroxisome proliferatorsa- ctived receptor γ，PPARγ)的活化水平會(huì)受到一定影響。老年性肥胖、高糖疾病狀態(tài)下機(jī)體可引起PPARγ表達(dá)的上調(diào)，而PPARγ的激活伴隨著Wnt相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制，進(jìn)而影響了成骨細(xì)胞骨形態(tài)發(fā)生蛋白等功能蛋白表達(dá)水平的降低，導(dǎo)致骨形成減少，最終加速OP的進(jìn)程。自然增齡往往伴隨著脂質(zhì)氧化過(guò)程相關(guān)的PPAR基因調(diào)控功能的下調(diào)，機(jī)體成肌細(xì)胞的脂肪氧水平也隨之下降，進(jìn)而導(dǎo)致ATP合成縮減，最終影響肌肉的收縮功能[9]。邢麗等[10]也研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體脂肪細(xì)胞的分化、胰島素抵抗及骨代謝水平的變化和PPARγ表達(dá)水平密切相關(guān)。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 (transforming growth factor-β1，TGF-β1)可以介導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白表達(dá)進(jìn)而誘導(dǎo)成骨分化與骨形成，其可能是通過(guò)增強(qiáng)成骨細(xì)胞增殖能力與促進(jìn)細(xì)胞分化成熟，以及增強(qiáng)機(jī)體基質(zhì)鈣化能力以加速修復(fù)骨損傷；TGF-β1的促細(xì)胞分裂與增殖作用的強(qiáng)弱會(huì)影響機(jī)體的間充質(zhì)細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞數(shù)量的增減，這為骨組織再生修復(fù)提供了更多的物質(zhì)基礎(chǔ)[11]。Joyce等[12]研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可促進(jìn)成骨細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白形成，以加快骨缺損機(jī)體自我修復(fù)。

線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，TFAM)與骨骼肌萎縮存在密切關(guān)系，TFAM的過(guò)表達(dá)對(duì)緩解肌萎縮有著積極的作用，宋銀娟等[13]發(fā)現(xiàn)TFAM過(guò)表達(dá)會(huì)使線粒體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生減少，以保證線粒體的調(diào)控功能正常發(fā)揮[14]。Tasaki等[15]研究發(fā)現(xiàn)TFAM作為與骨骼肌萎縮重要的蛋白質(zhì)分子之一，運(yùn)動(dòng)會(huì)促進(jìn)TFAM表達(dá)，以提高線粒體的調(diào)控能力，從而防治肌少癥。運(yùn)動(dòng)具體通過(guò)哪些分子機(jī)制以調(diào)控TFAM的表達(dá)，從而達(dá)到預(yù)防和治療肌少癥的問(wèn)題仍有待深入研究。此外，歐陽(yáng)劍鋒[16]研究發(fā)現(xiàn)OP疾病狀態(tài)下往往伴隨氧化應(yīng)激水平的高表達(dá)，此時(shí)OP患者體內(nèi)TFAM 表達(dá)水平會(huì)有所降低，一但缺少TFAM保護(hù)，被氧化損傷的線粒體轉(zhuǎn)錄DNA在機(jī)體內(nèi)的數(shù)量將會(huì)增加，此時(shí)，缺少了修復(fù)酶對(duì)損傷線粒體轉(zhuǎn)錄DNA的逐步修復(fù)，則線粒體調(diào)控作用失常，由此證明OP的演變過(guò)程可能和TFAM表達(dá)下調(diào)引起的線粒體轉(zhuǎn)錄DNA 拷貝數(shù)的多少有重要關(guān)聯(lián)。

細(xì)胞色素氧化酶(cytochrome oxidase，COX)主要參與細(xì)胞的氧化磷酸化過(guò)程，并且在機(jī)體內(nèi)會(huì)影響細(xì)胞氧化磷酸化對(duì)其相對(duì)應(yīng)下游靶基因的調(diào)控作用[17]。眾所周知，氧化代謝過(guò)程是維持骨骼肌功能所必需的，而這種代謝的重要成分是COX，即線粒體電子傳輸鏈的13個(gè)亞基末端復(fù)合物[18]。李穎等[19]研究骨骼肌與OP的關(guān)系，創(chuàng)新性提出肌肉線粒體內(nèi)通透轉(zhuǎn)換孔(MPTP)的表達(dá)水平可能與OP病理過(guò)程有密切關(guān)系，研究中發(fā)現(xiàn)OP患者肌肉中MPTP的通透性明顯偏高，其中MPTP通透性水平高低受COX的活性介導(dǎo)；因此，保持COX的活性對(duì)于有效控制MPTP的變化意義重大，可以有效實(shí)現(xiàn)延緩細(xì)胞的衰老進(jìn)程。此外，劉慶浩[20]發(fā)現(xiàn)COX的活性與肌細(xì)胞的凋亡有一定聯(lián)系，而肌細(xì)胞的衰退有可能加速肌少癥的到來(lái)并誘發(fā)骨質(zhì)疏松，綜上，研究者認(rèn)為COX的活性與SO的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，但其復(fù)雜的分子機(jī)制需深入研究。

SO屬于肌肉-骨骼系統(tǒng)疾病，差異蛋白PPARγ在維持成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的平衡體系中發(fā)揮重要作用。TGF-β1參與調(diào)控骨形態(tài)發(fā)生蛋白表達(dá)過(guò)程，可為機(jī)體骨骼修復(fù)過(guò)程提供必要的物質(zhì)基礎(chǔ)。TFAM的主要作用是參與了氧化應(yīng)激過(guò)程，深入研究其是否參與氧化和抗氧化的疾病過(guò)程將為揭示OP的氧化應(yīng)激具體分子機(jī)制提供更多可能；此外，COX參與了骨骼肌功細(xì)胞的氧化代謝過(guò)程，并且在肌少-骨質(zhì)疏松癥骨組織樣品中存在顯著差異表達(dá)，提示其可能也同時(shí)參與了OP的成骨細(xì)胞氧化代謝過(guò)程。

綜上，本研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用Label-free質(zhì)譜篩選技術(shù)在SO上進(jìn)行蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集與研究分析，并且初步篩選出過(guò)氧化物酶-1、潛在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β結(jié)合蛋白1亞型X1、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A、細(xì)胞色素C氧化酶等4個(gè)差異顯著的蛋白，這些差異蛋白可能參與調(diào)控著SO發(fā)病的全過(guò)程；此蛋白質(zhì)譜研究結(jié)果將為后續(xù)開(kāi)展有關(guān)肌少-骨質(zhì)疏松癥細(xì)胞或動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)研究提供了更多思路與方向。