邸學(xué)士 陳昭 賈育松 李晉玉 鄭晨穎 白春曉 張帆 劉楚吟 袁巧妹 龍水文 冉宇 康晟乾 陳江*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029 2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMO)是一類常見的代謝性骨骼疾病，威脅著絕經(jīng)后女性的生命健康[1]。PMO機(jī)制復(fù)雜，與女性生理退變相關(guān)，絕經(jīng)后女性由于雌激素分泌減少，體內(nèi)出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，活性氧的大量存在不僅抑制骨形成，而且促進(jìn)了骨的吸收，最終引起骨質(zhì)流失[2]。目前，西醫(yī)治療PMO的藥物主要包括鈣劑、維生素D、抗骨吸收藥物及骨活性藥物[3]等，但往往存在價格昂貴、不良反應(yīng)等問題。而中醫(yī)論治從整體出發(fā)，治病求本，中藥在抗骨質(zhì)疏松治療中逐漸發(fā)揮更多的作用。

PMO屬于中醫(yī)學(xué) “骨痿”、“骨痹”、“骨枯”的范疇，絕經(jīng)期婦女腎氣開始衰敗，并進(jìn)展為腎精虧虛，形成骨痿，治療以補(bǔ)腎健骨為主[4]。青娥丸首見于《太平惠民和劑局方》，為補(bǔ)腎壯骨的經(jīng)典方劑。由補(bǔ)骨脂、杜仲、核桃仁、大蒜四味中藥構(gòu)成。其中補(bǔ)骨脂“能暖水臟，陰中生陽氣”，為補(bǔ)腎壯陽之品；杜仲歸肝腎經(jīng)，具有“堅筋骨”之效；核桃仁，味甘性溫，補(bǔ)腎溫肺，三藥和之與大蒜共達(dá)補(bǔ)腎強(qiáng)骨之功。已有基礎(chǔ)研究證實青娥丸具有維持PMO患者骨密度、抑制骨吸收[5]、促進(jìn)骨形成[6]的作用，能夠改善機(jī)體骨代謝平衡。

現(xiàn)為了進(jìn)一步探討青娥丸治療PMO的可能作用機(jī)制，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，挖掘青娥丸治療PMO的潛在有效成分、靶標(biāo)、并對關(guān)鍵靶標(biāo)進(jìn)行基因本體功能及信號通路分析，為今后的抗PMO治療及深入研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 青娥丸中藥化合物的獲取及活性成分篩選

以“杜仲”、“補(bǔ)骨脂”、“核桃仁”、“大蒜”四味中藥為檢索詞匯，分別在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺[7](TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)、中醫(yī)藥百科全書數(shù)據(jù)庫[8](ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php)、SymMap數(shù)據(jù)庫(https://www.symmap.org/)進(jìn)行檢索，匯總獲取各中藥化合物成分，并在TCMSP平臺依據(jù)生物利用度(OB)≥30 %，與已知藥物相似性(DL)≥0.18，篩選出中藥活性成分，并通過文獻(xiàn)檢索對活性成分進(jìn)行補(bǔ)充。

1.2 青娥丸中藥活性成分靶標(biāo)預(yù)測

通過上述數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)檢索獲取各中藥活性成分CAS編號，登錄有機(jī)小分子生物活性數(shù)據(jù)庫(pubchem，https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)對CAS編號搜索，獲取活性成分的2D結(jié)構(gòu)文件，借助 SwissTargetPrediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch/)對活性成分的結(jié)構(gòu)進(jìn)行配體相似度交叉驗證和分析排列，實現(xiàn)中藥活性成分靶標(biāo)預(yù)測[9]。對預(yù)測結(jié)果，進(jìn)行“Probability值>0”的篩選，結(jié)果即為青娥丸中藥活性成分的作用靶標(biāo)。

1.3 青娥丸治療PMO潛在靶點獲取

將“Postmenopausal Osteoporosis”作為檢索詞匯，分別在GeneCards、OMIM、DisGeNET[10]三個疾病靶點數(shù)據(jù)庫進(jìn)行PMO相關(guān)靶點檢索，匯總?cè)齻€數(shù)據(jù)庫靶點結(jié)果，去除重復(fù)基因，即為疾病相關(guān)靶點。通過ImageGP平臺(http://www.ehbio.com/ImageGP/)將上述中藥活性成分靶點與PMO相關(guān)靶點映射，繪制韋恩圖，交集即為青娥丸治療PMO潛在作用靶點。

1.4 中藥-活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

上述中藥、活性成分、交集靶點分列整理，通過Cytoscape 3.7.1軟件，構(gòu)建中藥-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖，應(yīng)用“Network analyzer”插件對網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點度值進(jìn)行分析，其值越大，表示該節(jié)點在網(wǎng)絡(luò)中越重要。

1.5 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將青娥丸治療PMO潛在作用靶點基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，Organism設(shè)置為“Homo sapiens”，勾選高信度(high confidence0.7)，并隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開連接的節(jié)點，獲取青娥丸治療PMO潛在作用靶點的蛋白質(zhì)互相作用關(guān)系(protein-protein interaction，PPI)，通過Cytoscape內(nèi)置的網(wǎng)絡(luò)分析插件，對其進(jìn)行拓?fù)浞治?，并繪制蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO功能富集分析及KEGG通路分析

通過上述PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霁@得青娥丸治療PMO關(guān)鍵靶點，并導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)，分別進(jìn)行基因本體(Gene Ontology，GO)功能富集分析及KEGG通路富集分析，其中GO分析包含：生物過程(biological process,BP)、分子功能(molecular function,MF)、細(xì)胞組分(cellular component,CC)三個內(nèi)容，篩選排名靠前的基因功能及通路，應(yīng)用http://www.bioinformatics.com.cn/平臺繪圖。

2 結(jié)果

2.1 青娥丸活性成分篩選結(jié)果

經(jīng)過TCMSP數(shù)據(jù)庫、ETCM數(shù)據(jù)庫、SymMap數(shù)據(jù)庫搜索，同時滿足OB≥30 %、DL≥0.18篩選，獲得活性成分37種，文獻(xiàn)補(bǔ)充已被證實的3種活性成分補(bǔ)骨脂素[11]、紫云英苷[12-13]、異補(bǔ)骨脂素[14-15]，共計40種活性成分，其中olivil、3-Hydroxymethylenetanshinquinone、ent-Epicatechin、Helenali、liriodendrin_qt及(E)-3-[4-[(1R,2R)-2-hydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-1-methylol-ethoxy]-3-methoxy-phenyl]acrolein 此6種活性成分因無對應(yīng)靶標(biāo)被剔除，將剩余34種活性成分納入本研究，詳見表1。

表1 活性成分Table 1 The active components

續(xù)表1 活性成分Continued table 1 The active components

2.2 靶點預(yù)測

通過SwissTargetPrediction平臺，對篩選出的40種青娥丸活性成分進(jìn)行靶點預(yù)測，其中6種成分無對應(yīng)靶標(biāo)，對剩余34種活性成分靶標(biāo)預(yù)測結(jié)果進(jìn)行Probability值>0的篩選，去掉重復(fù)值，共獲取532個青娥丸作用靶點。通過GeneCards數(shù)據(jù)庫、OMIM數(shù)據(jù)庫、DisGeNET數(shù)據(jù)庫獲取1 166個PMO相關(guān)靶點基因，通過ImageGP平臺，對兩組基因取交集，獲得178個青娥丸治療PMO的潛在作用靶點，見圖1。

圖1 “青娥丸靶標(biāo)基因-PMO相關(guān)基因”韋恩圖Fig.1 Venn diagram of Qinge pill target gene - PMO-related genes

2.3 中藥-活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

構(gòu)建“中藥-活性成分-交集靶點”網(wǎng)絡(luò)圖，詳見圖2。該網(wǎng)絡(luò)由216個節(jié)點、688條邊組成，其中飛燕草素、槲皮素、桑色素、丁香亭、山奈酚、異補(bǔ)骨脂黃酮度值排名前6位，度值分別為47、46、46、46、45、34，在青娥丸治療PMO過程中可能發(fā)揮著重要作用。

注：其中青色圓形節(jié)點代表青娥丸中藥，紫色六邊形節(jié)點代表補(bǔ)骨脂活性成分，黃色六邊形節(jié)點代表杜仲活性成分，粉色六邊形節(jié)點代表核桃仁活性成分，墨綠色六邊形節(jié)點代表大蒜活性成分，藍(lán)色棱形節(jié)點代表青娥丸治療PMO潛在作用靶點。圖2 “中藥-活性成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of traditional Chinese medicine-active ingredients-intersection targets

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析及關(guān)鍵靶點獲取

經(jīng)STRING數(shù)據(jù)庫獲取獲青娥丸治療PMO潛在作用靶點的互相作用關(guān)系，通過Cytoscape 3.7.1繪制靶點蛋白互相作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3所示，圖中節(jié)點表示靶點蛋白，邊表示兩個蛋白相連，網(wǎng)絡(luò)中共計172個靶點蛋白，927條邊。度值越高，節(jié)點越大，在網(wǎng)絡(luò)中所占有的地位越大，節(jié)點度值平均值為10.5，并以度值大于10.5為條件共篩選出68個靶點蛋白，作為青娥丸治療PMO的關(guān)鍵靶點。其中度值排名前10位分別為：MAPK1、AKT1、PIK3CA、PIK3R1、APP、SRC、MAPK8、HSP90AA1、EGFR、JAK2，度值分別為：47、46、44、43、37、37、35、33、32、30，推測其在青娥丸治療PMO過程中具有重要地位。

注：依據(jù)節(jié)點度值屬性對節(jié)點大小及顏色進(jìn)行調(diào)節(jié)，依據(jù)節(jié)點間相互作用強(qiáng)度對邊的粗細(xì)和顏色進(jìn)行調(diào)節(jié)。圖3 青娥丸治療PMO的靶點基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The target gene protein-protein interaction network of Qinge pill for PMO

2.5 GO富集分析及KEGG通路分析

對篩選得到的關(guān)鍵靶點進(jìn)行GO和KEGG分析。應(yīng)用bioinformatics平臺繪圖。圖4所示為GO分析結(jié)果：其中，BP相關(guān)條目278條，生物過程主要涉及一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、可卡因反應(yīng)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程。MF相關(guān)條目75條，分子功能包括：與酶結(jié)合、激酶活性、胰島素受體底物結(jié)合、與蛋白質(zhì)結(jié)合、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性等；CC相關(guān)條目46條，細(xì)胞組成涉及質(zhì)膜、膜筏、細(xì)胞核等部位。

圖4 青娥丸關(guān)鍵靶點GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of the key targets of Qinge pill

圖5為KEGG通路富集分析結(jié)果，篩選了青娥丸治療PMO關(guān)鍵靶點前20個相關(guān)通路，主要包括：癌癥通路、PI3K-Akt信號通路、神經(jīng)活性配體-受體相互作用信號通路、HIF-1信號通路，以及雌激素、催乳素、甲狀腺激素三個激素類信號通路等。

圖5 青娥丸關(guān)鍵靶點KEGG 通路富集Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis of key targets of Qinge pill

3 討論

青娥丸作為PMO中醫(yī)藥診療指南推薦用方[16]，其組成中補(bǔ)骨脂不僅具有類雌激素作用[17]，還可通過介導(dǎo)信號通路調(diào)節(jié)骨代謝進(jìn)而緩解PMO[18]。杜仲已被證實可以調(diào)節(jié)去卵巢大鼠的雌激素水平，促進(jìn)骨代謝平衡[19]。核桃仁則能夠改善體內(nèi)脂質(zhì)過氧化，清除體內(nèi)過多的氧自由基[20]，由于活性氧的大量存在會引起骨質(zhì)流失，所以筆者推測核桃仁的抗氧化作用為其治療PMO提供潛在可能。

本研究篩選出飛燕草素、槲皮素、山奈酚、異補(bǔ)骨脂黃酮等重要化合物，其中，飛燕草素已被證實可通過上調(diào)BMP-2、Runx-2兩個骨細(xì)胞特異基因來促進(jìn)骨的形成[21]，同時可抑制破骨細(xì)胞分化來防止骨吸收[22]。此外，飛燕草素對氧化應(yīng)激反應(yīng)具有防護(hù)作用[23-24]，其也可能通過抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮抗PMO作用。王雪峰等[25]發(fā)現(xiàn)山奈酚可調(diào)節(jié)鈣離子代謝，促進(jìn)骨的生成；國外學(xué)者[26]通過細(xì)胞試驗發(fā)現(xiàn)山奈酚能夠抑制細(xì)胞自噬活動，限制破骨細(xì)胞生成。同樣，槲皮素不僅可以抑制骨吸收[27]，還能夠通過刺激骨形成作用蛋白BMP2及上調(diào)Smad4的表達(dá)水平來促進(jìn)成骨分化，改善PMO病情[28]。槲皮素和山奈酚均具有成骨和破骨雙向調(diào)節(jié)的作用，二者在改善骨代謝平衡及在治療PMO方面具有廣泛應(yīng)用前景。

通過PPI靶點網(wǎng)絡(luò)分析得到青娥丸治療PMO的重要靶點：MAPK1、AKT1、PIK3CA、PIK3R1、MAPK8、JAK2等。其中MAPK1、MAKE8均屬MAPK信號通路成員，該通路可通過線粒體途徑干預(yù)成骨細(xì)胞凋亡[29]，MAPK1(絲裂原活化蛋白激酶1)又名ERK2(細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶2)，可通過ERK1/2通路介導(dǎo)成骨細(xì)胞分化[30-31]。AKT1是AKT(蛋白激酶B)的基因族成員，研究發(fā)現(xiàn)對大鼠進(jìn)行去AKT1基因敲除處理后，大鼠出現(xiàn)骨骼發(fā)育受限，提示AKTI在骨骼發(fā)育中可能發(fā)揮促進(jìn)骨生長作用[32]，同時AKT1與PIK3CA、PIK3R1共同作為PI3K-Akt信號通路成員，通過該通路在骨代謝過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[33-34]。JAK2作為JAK/STAT信號通路成員，李常虹等[35]認(rèn)為JAK/STAT信號通路可通過參與炎癥反應(yīng)引起骨破壞的發(fā)生。通過GO富集分析可推測，這些關(guān)鍵靶點主要在質(zhì)膜、膜筏、細(xì)胞核等位置發(fā)揮作用，并通過一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、蛋白質(zhì)磷酸化等生物過程，發(fā)揮激酶活性、與蛋白質(zhì)結(jié)合、與蛋白激酶結(jié)合等分子功能。

KEGG富集分析排名靠前的通路中，PI3K-Akt信號通路是骨代謝過程中的重要信號通路，具有介導(dǎo)成骨細(xì)胞增殖[36-37]、成骨細(xì)胞分化[38]、干預(yù)破骨細(xì)胞凋亡[39]作用，值得一提的是，本研究篩選出的關(guān)鍵靶點AKT1、PIK3CA、PIK3R1均屬于該通路成員，研究結(jié)果相互驗證。HIF-1信號通路此前已被證實能夠促進(jìn)骨形成[40]，但國內(nèi)學(xué)者在動物實驗中發(fā)現(xiàn)抑制HIF-1信號通路，實驗小鼠的骨質(zhì)疏松程度得到改善，骨代謝破骨指標(biāo)降低的同時，骨代謝成骨指標(biāo)也降低[41]，筆者推測該通路可能以參與破骨細(xì)胞活性調(diào)節(jié)為主發(fā)揮抗PMO作用。本研究還涉及三個激素類信號通路：雌激素信號通路通過雌激素受體上調(diào)OPG/RANKL表達(dá)來促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖分化[42]，同時上調(diào)CFTR誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的凋亡，具有成骨和破骨雙向調(diào)節(jié)作用。泌乳素信號通路通過作用于生殖軸，抑制甾體激素的合成，介導(dǎo)骨代謝[43]；甲狀腺素則是通過直接或間接作用于軟骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞實現(xiàn)對骨轉(zhuǎn)化的作用[44]，但其具體病理機(jī)制，尚未達(dá)成學(xué)術(shù)共識。癌癥信號通路盡管在本研究通路富集分析中位列首位，但因該通路與PMO相關(guān)研究報道甚少，其能否介導(dǎo)PMO及介導(dǎo)機(jī)制有待后續(xù)研究探討。

綜上所述，青娥丸治療PMO是通過青娥丸中多種活性成分作用于多個基因靶點，各靶點基因功能復(fù)雜多樣，通過不同信號通路調(diào)節(jié)骨代謝，體現(xiàn)了青娥丸治療PMO具有多成分、多靶點、多途徑的特點，并為今后青娥丸治療PMO作用機(jī)制的深入研究提供參考。