李生強 謝冰穎 陳娟 謝麗華 葉云金 黃景文 葛繼榮

福建省中醫(yī)藥科學院骨質疏松證候基因組學研究室，福建 福州 350003

隨著老齡社會的到來，骨骼健康逐漸引起人們的重視。骨質疏松癥以骨骼脆弱和微結構退化為特點，主要出現(xiàn)在絕經(jīng)后婦女，與椎體和非椎體骨折的風險增加密切相關。骨質疏松癥導致的骨折是最常見的殘疾原因之一，具有較高的致死率，給社會和家庭帶來沉重的醫(yī)療負擔。因此骨質疏松癥的發(fā)病機制及防治研究具有重要的臨床和公共衛(wèi)生意義[1-2]。絕經(jīng)后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis,PMOP)是由于舊骨的清除(骨吸收)與新骨的產生(骨生成)之間平衡受到破壞，從而引起骨微結構破壞，造成骨量下降[2]。這種動態(tài)平衡受到許多因素的影響與調節(jié)等。長鏈非編碼RNA(1ong noncoding RNA，lncRNA)是長度超過200個核苷酸且沒有蛋白編碼能力的轉錄本，大量證據(jù)表明，lncRNA參與了多種分子機制和疾病[3-4]。前期課題組以lncRNA-mRNA芯片技術為手段，比較分析PMOP患者與對照組外周血lncRNAs 表達譜變化，獲得了差異表達lncRNAs[5]。本研究在lncRNA-mRNA共表達分析的基礎上，分析差異表達lncRNAs及其靶基因的關系，預測lncRNAs二級結構，從臨床納入人群驗證 lncRNAs及靶基因的表達變化，為從長鏈非編碼RNA角度闡釋骨質疏松癥的機制提供思路。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1研究對象：從常住福州地區(qū)的漢族絕經(jīng)后婦女中隨機選擇受試者，進行血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功、腎功能、腹部B超和心電圖等檢查，結合問卷調查排除嚴重疾病者；采用雙能 X 線骨密度儀檢測受試者正位腰椎(L2-4)、左側股骨頸、大轉子和 Ward區(qū)骨密度(g/cm2)；根據(jù)骨密度檢測結果，納入骨質疏松癥組及對照組各25例。

納入標準：①骨質疏松癥診斷標準參照《中國人骨質疏松癥建議診斷標準(第二稿)》[6]；②受試者均簽署知情同意書。本研究方案獲得福建省中醫(yī)藥研究院中醫(yī)藥臨床研究倫理委員會審批通過[7]。

排除標準：①不符合中國人骨質疏松癥診斷標準者；②類風濕性關節(jié)炎、糖尿病、甲狀腺功能亢進等繼發(fā)性骨質疏松癥者；③合并有心腦血管、胃腸道等嚴重疾病者；④肝、腎功能檢查異常者；⑤近 3個月內用激素替代治療，使用降鈣素者；近 6 個月內有連續(xù) 15 d 用雙膦酸鹽等防治骨質疏松癥者[7]。

1.1.2主要儀器和試劑：Discovery W 雙能 X 線骨密度儀(變異系數(shù)1.0 %，精度0.25 %，美國Hologic 公司)；微量核酸檢測儀 Nanodrop ND-2000 (美國 Thermo scientific公司)；實時熒光定量 PCR 儀(7500 fast美國 ABI公司)；人外周血淋巴細胞分離液(北京索萊寶科技有限公司)；Trizol 試劑 (美國Invitrogen 公司)；引物合成、反轉錄試劑盒、SYBR定量PCR試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]。

1.2 方法

1.2.1LncRNA 靶基因預測：在lncRNA-mRNA 共表達分析的基礎上，利用blat工具對 lncRNA和mRNA(3'UTR)序列進行比對。序列相似的 lncRNA與mRNA(相關系數(shù)大于0.85且P值小于0.05)預測為具有靶向調節(jié)關系。

1.2.2LncRNA二級結構預測：打開RNAfold(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi)網(wǎng)址，分別輸入lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1全長序列，分別對其二級結構進行預測分析。

1.2.3總RNA抽提及反轉錄：抗凝采血管采集受試者空腹外周血2 mL，逐滴加入到淋巴細胞分離液，1 500 r/min離心15 min，小心吸出中間白色細胞層，并用生理鹽水重懸、離心；Trizol法抽提細胞中的總RNA；微量核酸檢測儀檢測吸光度值，分析RNA的純度并計算濃度。采用兩步法進行反轉錄，每個樣品取1 μg總RNA用于反轉錄合成cDNA，并于-80 ℃保存。

1.2.4實時熒光定量PCR驗證：定量PCR采用 20 μL反應體系：SYBR mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，ROX dye II 0.4 μL，稀釋10倍的cDNA 2 μL，dd H2O 6.8 μL；一個樣品中的一個基因做3個重復孔；PCR反應步驟及相對表達量2-△△Ct法參照前期發(fā)表文獻[7]。上下游引物序列及擴展產物大小見表1。

表1 定量PCR上下游引物序列Table 1 Upstream and downstream primer sequences for RT-PCR

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)±標準差描述。根據(jù)數(shù)據(jù)是否正態(tài)分布，選擇非參數(shù)檢驗或t檢驗比較組間差異，以P<0.05 判斷為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 LncRNA 靶基因預測結果

LncRNA 靶基因預測結果見表2。

表2 LncRNA靶基因預測Table 2 Prediction of target genes of lncRNAs

2.2 LncRNA二級結構預測

由于堿基數(shù)較長，研究表明LncRNA能形成保守的二級結構，對于它們參與復雜的調控作用起著重要作用。RNAfold 軟件進行 lncRNAs結構預測，結果表明，lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1均含有多個莖環(huán)及多分枝內部環(huán)結構(見圖 1)。lncRNA 系列越長，如linc-FAM126B-1包含更多的環(huán)形結構(圖 1C)，其二級結構越復雜，可能參與更多的生物學功能。

注：1 A：lncRNA TTC28-AS1；1B：linc-IRF2BP2-1；1C：linc-FAM126B-1。圖1 RNAfold 預測 lncRNAs MEF 二級結構圖Fig.1 MEF secondary structure of lincRNAs predicted with RNAfold software

2.3 兩組人群基礎資料及骨密度比較

骨質疏松癥組及對照組人群基礎資料見表2，兩組人群在年齡、初潮年齡、懷孕次數(shù)、絕經(jīng)年齡及BMI指數(shù)等方面差異均無統(tǒng)計學意義，結果具有可比性。與對照組相比，骨質疏松癥組在腰椎及Ward區(qū)骨密度顯著下降(P值均小于0.05)，兩組骨密度比較見表4。

表3 受試者基礎資料比較Table 2 Comparison of basic data of the

表4 受試者骨密度比較Table 3 Comparison of bone mineral density of the g/cm2)

2.4 定量PCR檢測抑瘤素M及l(fā)ncRNAs在兩組人群中的表達

定量PCR結果表明，OSM在骨質疏松癥組人群外周血中表達顯著降低，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1等在骨質疏松癥組人群中表達水平顯著降低，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學意義(P值均小于0.05)，見圖2。

注：與對照組比較，*P<0.05。圖2 定量PCR檢測基因表達水平Fig.2 Expression level of the genes detected with real-time PCR

3 討論

隨著測序技術的迅速發(fā)展，越來越多的基因組轉錄本得到研究，從而產生了大量的長鏈非編碼(long chain non-coding RNA,lncRNA)。雖然科學家已經(jīng)掌握了許多DNA調節(jié)元件(如增強子、啟動子)的調控特點，但是，鑒定及功能性研究仍然是當前l(fā)ncRNA研究的首要任務[8-9]。從2018年開始，日益增長的研究表明，lncRNA在骨代謝中起著重要作用，許多長鏈非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)參與多種骨代謝疾病的發(fā)生、發(fā)展及轉歸過程[10-13]。在骨質疏松癥，長鏈非編碼RNA主要參與了成骨細胞分化[14-16]、破骨細胞分化[17]及細胞信號通路激活[2,16]等調節(jié)過程，在骨生成與骨吸收動態(tài)平衡中起著重要調節(jié)作用。

本研究在獲得絕經(jīng)后骨質疏松癥差異性lncRNA及mRNA的基礎上[5]，進行l(wèi)ncRNA-mRNA共表達分析，利用blat 工具預測lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1的靶基因可能為抑瘤素M(OSM)。目前國內尚沒有OSM與骨代謝的相關報道，但在國外已有相關研究。OSM作為白細胞介素-6(interleukin 6，IL-6)家族成員，是具有調節(jié)基因活性、抑制腫瘤增殖等生物學活性的分泌性糖蛋白[18-19]。骨細胞、成骨細胞和巨噬細胞均能以旁分泌的形式產生OSM。研究表明，OSM既可促進成骨細胞成骨分化，又能間接促進破骨細胞生成，是具有雙向調節(jié)作用獨特細胞因子[20-22]。OSM與受體(oncostatin M,OSMR)結合后可啟動下游的廣泛的信號通路[22]。OSM基因敲除小鼠具有成骨細胞數(shù)量降低、骨小梁減少的特征，表明OSM具有促進成骨細胞分化的功能[23]；OSMR敲除小鼠實驗表明OSM可能通過影響成骨細胞的RANKL (receptor activator of nuclear factor κB ligand)表達，負向調節(jié)破骨細胞功能[24]。本研究中，樣品來自人的外周血，OSM在絕經(jīng)后骨質疏松癥組表達水平下降，這可能與吞噬細胞、破骨細胞分化能力相關，表明外周血OSM的表達與PMOP具有相關性。在前期六味地黃丸治療絕經(jīng)后骨質疏松癥患者的臨床試驗中，課題組發(fā)現(xiàn)患者治療3個月后，外周血OSM的表達具有上升趨勢，表明OSM可能是六味地黃丸治療POP的靶標之一[25]。

生物體內RNA較少單獨存在，它們往往與具有特定功能的蛋白質特異性結合從而發(fā)揮生物學功能，特異性結合就要求RNA具有一定的結構特征。RNA的二級結構會影響到RNA的生物學功能[26]。通過在線預測RNAfold預測得到lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1的二級結構，它們均具有多個莖環(huán)、多分枝內部環(huán)，系列最長的linc-FAM126B-1其結構也最復雜，具有最多的莖環(huán)結構，說明它可能參與更多的生物學功能。LncRNA二級結構預測結合LncRNA功能研究，對于預測具有某種功能的結構單元、尋找藥物治療靶標具有重要意義。

在前期芯片檢測中，我們發(fā)現(xiàn)，lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1及OSM在絕經(jīng)后骨質疏松癥組表達均出現(xiàn)下調。本研究結果表明，與對照組相比，骨質疏松癥組lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1及其靶基因OSM表達水平均顯著下降，與芯片檢測結果一致。外周血lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1及其靶基因OSM的表達下調，可能與絕經(jīng)后骨質疏松癥相關。

本文不足之處在于本研究中臨床例數(shù)還偏少，LncRNAs與OSM的靶向調節(jié)關系還需要進一步的實驗驗證，我們也將開展lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1相關功能性實驗。

綜上所述，本實驗結果證明lncRNA TTC28-AS1、linc-IRF2BP2-1、linc-FAM126B-1 及其靶基因 OSM 基因在絕經(jīng)后骨質疏松癥中表達顯著下調，它們可能為絕經(jīng)后骨質疏松癥的重要關聯(lián)基因。本文從調控 PMOP的關聯(lián)長鏈非編碼RNAs及其靶基因OSM 入手，為闡明 PMOP的分子機制提供新的研究思路。