汪東 楊媛 張崢 田天 周家寧 譚榮 周雪峰 王蒙

解放軍戰(zhàn)略支援部隊特色醫(yī)學(xué)中心骨科，北京 100101

人體骨骼的形成和重塑需要多種細(xì)胞的協(xié)作，其中成骨細(xì)胞發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。成骨細(xì)胞可調(diào)節(jié)骨的礦化，其與破骨細(xì)胞的動態(tài)平衡直接影響骨的生物學(xué)特性[1]。維生素D作為一種脂溶性維生素，在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和骨形成中起著至關(guān)重要的作用[2-3]。人體中的維生素D主要是維生素D3(VD3)，其代謝產(chǎn)物25-羥基維生素D3[25(OH)VD3]在血清中的濃度是體內(nèi)維生素D的最可靠指標(biāo)，有研究證實骨質(zhì)疏松和骨折與25(OH)VD3的血清濃度不達(dá)標(biāo)狀態(tài)密切相關(guān)[4]，25(OH)VD3在腎中通過1α羥基化作用產(chǎn)生活性形式的1α,25-二羥基維生素D3[1α,25(OH)2VD3]，作為VD3最活躍的形式，它通過維生素D受體(VDR)發(fā)揮作用。許多研究報道，維生素D3的代謝產(chǎn)物25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3可以在體外和體內(nèi)調(diào)節(jié)不同類型細(xì)胞的功能[5-7]。例如，Lou等[5]的研究表明25(OH)VD3在較高的生理濃度下作為一種活性激素參與VD3應(yīng)答基因調(diào)控和抑制細(xì)胞增殖。亦有研究證實VD3代謝物可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的成骨分化[7]。然而目前VD3及其代謝物對成骨細(xì)胞分化的影響尚不清楚。基于推測VD3及其代謝物可能對成骨細(xì)胞的分化和生物礦化起促進(jìn)作用。本研究通過檢測細(xì)胞增殖、成骨相關(guān)基因表達(dá)、蛋白分泌和生物礦化等研究VD3、25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3對成骨細(xì)胞的影響，以期進(jìn)一步了解VD3及其代謝物在促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和生物礦化中的作用和關(guān)系，為其在臨床骨質(zhì)疏松癥和骨組織工程中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及試劑

DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清(美國Gibco公司)；碳酸氫鈉、L-谷氨酰胺、胰蛋白酶、EDTA、PBS、VD3、25(OH)VD3、1α,25(OH)2VD3(美國Sigma公司)；堿性磷酸酶測定試劑盒、總RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑盒(中國Beyotime生物技術(shù)公司)；CCK-8檢測試劑盒 (日本Takara公司)；骨鈣素ELISA檢測試劑盒(美國Zymed公司)

1.2 儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱 (美國Thermo公司)；分光光度計(美國 Beckman公司)；凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；定量PCR儀(美國Stratgenes 公司)；臺式低溫高速離心機(jī)(美國Thermo公司)；Millipore純水系統(tǒng)(美國 Millipore 公司)。

1.3 成骨細(xì)胞培養(yǎng)

采用膠原酶消化法分離成骨細(xì)胞，取1 d齡新生大鼠顱骨，制成 1～3 mm3的骨粒，0.25 % 的胰蛋白酶消化清除纖維組織細(xì)胞，在0.1 % 膠原酶Ⅱ、37 ℃環(huán)境下振蕩消化50 min，收集消化液，室溫下以1 200 r/min離心10 min，去除上清液，接種于培養(yǎng)瓶中，對靜置后沉淀部分可再重復(fù)以膠原酶消化20 min、磁力攪拌消化15 min、離心10 min，添加含10 %胎牛血清、0.1 mg/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素、1.5 mg/mL碳酸氫鈉和0.33 mg/mL L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基。將獲得的細(xì)胞放置于二氧化碳培養(yǎng)箱，在5 % CO2，95 %空氣，37 ℃溫度下培養(yǎng)，24 h后可見細(xì)胞貼壁生長，胞質(zhì)開始伸展，換新鮮培養(yǎng)液，以后每隔48 h換培養(yǎng)液。當(dāng)細(xì)胞聚集度達(dá)到90 %左右時，用0.25 %胰蛋白酶消化傳代。第三代細(xì)胞被用于體外研究。

1.4 實驗分組

分為正常細(xì)胞對照組，VD3藥物處理組，25(OH)VD3藥物處理組和1α,25(OH)2VD3藥物處理組，我們以50～200 nmol/L作為維生素D3和25(OH)VD3的實驗濃度，1α,25(OH)2VD3的實驗濃度為0.01～0.2 nmol/L。成骨細(xì)胞接種密度為3 000細(xì)胞/cm2，培養(yǎng)1 d，細(xì)胞貼壁后更換含VD3、25(OH)VD3或1α,25(OH)2VD3的藥物處理培養(yǎng)基，每周換液3次，常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。

1.5 CCK-8細(xì)胞增殖檢測

成骨細(xì)胞接種于24孔板，初始密度為1*104細(xì)胞/cm2，藥物處理第7天用PBS沖洗3次，配置含10 %CCK-8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入，37 °C孵育2 h，用分光光度法測定波長450 nm處的吸光值。

1.6 堿性磷酸酶活性測定

成骨細(xì)胞接種于24孔板，接種密度為1*104細(xì)胞/cm2，藥物處理7 d，收集細(xì)胞用1 %TritonX-100進(jìn)行3次凍融處理，經(jīng)離心后，按ALP 試劑盒說明，采用對硝基苯磷酸二鈉基質(zhì)動力學(xué)法 (PNPP 法) 測定ALP 活性，Bradford 法測定細(xì)胞液蛋白濃度，ALP 活性用細(xì)胞內(nèi)總蛋白濃度校正。

1.7 鈣含量測定

將成骨細(xì)胞接種于24孔板中，初始密度為1*104細(xì)胞/cm2。培養(yǎng)21 d后，細(xì)胞用4 %多聚甲醛固定并在室溫下用茜素紅S(ARS) (40 mmol/L，pH=4.1)染色，收集細(xì)胞，在85 °C下加熱10 min，離心15 min后，收集上清液，加入10 %氫氧化銨中和酸，測量450 nm波長處吸光度值。

1.8 ELISA測定骨鈣素濃度

收集藥物處理21 d的細(xì)胞，PBS洗滌一次，用含有蛋白酶抑制劑的放射免疫沉淀分析緩沖液進(jìn)行裂解。使用Gla型骨鈣素EIA試劑盒檢測，稀釋細(xì)胞裂解物，確保ELISA測定的樣品讀數(shù)在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)(0～16 ng/mL)。細(xì)胞裂解液中的蛋白質(zhì)濃度用 BCA蛋白分析試劑盒測定。450 nm波長處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品吸光度曲線測定骨鈣素濃度(以pg/mL表示)。

1.9 成骨細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)

收集藥物處理7 d的細(xì)胞，用EZNATM總RNA試劑盒II提取總RNA。用PrimeScriptTMRT試劑盒去除基因組DNA和cDNA合成。采用real-time PCR法檢測OCN、Runx2、CYP27B1、CYP24A1表達(dá)，β-actin為參照基因。β-actin引物序列為：上游引物5’-GGAGATCTCTGCTCTTA-3‘和下游引物5’用ACTCATCGCTCCTCTTCTGCTG-3’。CYP24A1：上游引物5’-GCCGCCGGGAACTC-3‘和下游引物5’-AAATACCACC。CYP27 B1：上游引物5’-TTGCGAGCGCGACTGTAT-3‘和下游引物5’-TGTGTGATAGCTGGCCACAA-3’；Runx 2：上游引物5’-GCCG TAGAGGGGAAGAC-3‘和下游引物5’-CTGCTTG GATTAGGAGTCAC-3’；OCN：上游引物5’-GAGGGTAAGGGGGGAA-3‘和下游引物5’-TCCTCGTGGAAGCCAATGTG-3’。

反應(yīng)條件：98 °C 3 min，45個循環(huán)的 98 °C 10 s，58 °C 15 s和72 °C 30 s。real-time PCR采用Beyotime生物工程有限公司的 SYBR 染料法試劑盒在美國 ABI公司的 7500 型熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行，采用 2-ΔΔCt 計算基因表達(dá)的倍數(shù)差異。

1.10 圖像與統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間差異顯著性檢驗使用非配對Studentt檢驗，兩組以上數(shù)據(jù)比較時使用單因素方差分析(One-way ANOVA)檢驗顯著性差異。使用OriginPro 2016進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗統(tǒng)計分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞增殖

采用CCK-8法定量評價VD3、25(OH)VD3或1α,25(OH)2VD3對成骨細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明200 nmol/L VD3處理組的細(xì)胞增殖顯著高于50 nmol/L VD3處理組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3濃度的增加，成骨細(xì)胞增殖活性有所增強(qiáng)，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義 (圖1)。結(jié)果表明，VD3、25(OH)VD3或1α,25(OH)2VD3對成骨細(xì)胞均無細(xì)胞毒性，只有200 nmol/L VD3對成骨細(xì)胞有顯著的促進(jìn)增殖作用。

注：*P<0.05。圖1 CCK-8法檢測VD3、25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3處理7 d的成骨細(xì)胞增殖情況Fig.1 The proliferation of osteoblasts treated with VD3,25(OH)D3,or 1α,25(OH)2VD3 for 7 days was detected with CCK-8 method

2.2 成骨細(xì)胞24-羥化酶和1α-羥基化反應(yīng)

在本研究中，我們首先研究成骨細(xì)胞是否對VD3、25(OH)VD3或1α,25(OH)2VD3有反應(yīng)。24-羥化酶由CYP24A1編碼，受配體結(jié)合VDR調(diào)節(jié)。既往研究表明，CYP24A1是1α,25(OH)2VD3上調(diào)最多的基因，是公認(rèn)的VDR 敏感靶基因[8-9]。如圖2所示，隨著VD3濃度的增加，CYP24A1的mRNA表達(dá)無明顯變化。200 nmol/L 25(OH)VD3處理細(xì)胞后，CYP24A1 mRNA水平明顯升高，與100 nmol/L和50 nmol/L相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001；圖2)。0.2 nmol/L 1α,25(OH)2VD3與0.01 nmol/L和0.05 nmol/L 相比，CYP24A1的mRNA水平顯著升高(P<0.001)。低濃度VD3、25(OH)VD3或1α,25(OH)2VD3對成骨細(xì)胞CYP24A1 mRNA表達(dá)水平無明顯影響。

注：***P<0.001。圖2 qRT-PCR法檢測CYP24A1基因的表達(dá)Fig.2 CYP24A1 mRNA expression was detected with qRT-PCR

在體內(nèi)，25(OH)VD3經(jīng)25-羥基維生素D-1α-羥化酶(CYP27B1)轉(zhuǎn)化為1α,25(OH)2VD3[9]。因此，我們在培養(yǎng)第7天測定了CYP27B1的mRNA表達(dá)，以確定25(OH)VD3是否在成骨細(xì)胞中代謝為1α,25(OH)2VD3。如圖3所示，VD3和25(OH)VD3濃度的增加不影響成骨細(xì)胞CYP27B1 mRNA的表達(dá)。結(jié)合圖2的結(jié)果，我們可以得出結(jié)論：成骨細(xì)胞對25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3有反應(yīng)，但不能直接代謝VD3和25(OH)VD3。

圖3 qRT-PCR法檢測CYP27B1 mRNA表達(dá)Fig.3 CYP27B1 mRNA expression was detected with qRT-PCR

2.3 堿性磷酸酶活性測定

ALP的表達(dá)是成骨分化的標(biāo)志[2-3]。定量測定結(jié)果顯示(圖4)，與對照組相比，VD3處理組ALP活性無明顯提高。100 nmol/L 25(OH)VD3處理組ALP活性顯著高于50 nmol/L處理組(P<0.05)，200 nmol/L 25(OH)VD3處理組ALP活性最高(P<0.05或P<0.001)。與第7天的其他濃度相比，0.2 nmol/L 1α,25(OH)2VD3處理組ALP活性顯著升高(P<0.01或P<0.001)。結(jié)果表明，一定濃度的25(OH)VD3或1α,25(OH)2VD3能促進(jìn)成骨細(xì)胞早期分化。

2.4 鈣含量測定

ARS法檢測細(xì)胞外鈣沉積，是晚期成骨分化指標(biāo)[11]。定量測定結(jié)果(圖5)表明，VD3和1α,25(OH)2VD3在任何濃度下都不能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞的生物礦化。僅25(OH)VD3可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的生物礦化，當(dāng)25(OH)VD3濃度增加到200 nmol/L時，細(xì)胞的生物礦化水平最高(P<0.01或P<0.001)。

2.5 成骨細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)

Runx2是成骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)下游成骨基因的轉(zhuǎn)錄，如ALP、OCN等[12-13]。OCN是最豐富的骨特異性非膠原蛋白，也是反映成骨成熟和骨形成的標(biāo)志物之一[14-15]。所有實驗組中VD3對Runx2和OCN的表達(dá)無明顯影響。與對照組相比，25(OH)VD3處理組可顯著上調(diào)Runx2和OCN的表達(dá)水平(P<0.01或P<0.001)。1α,25(OH)2VD3處理組對Runx2表達(dá)的影響趨勢相似(P<0.05或P<0.001)。但是，1α,25(OH)2VD3處理組成骨細(xì)胞的OCN表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖6)。

注：*P<0.05，**P<0.01,***P<0.001。圖4 VD3、25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3處理后，成骨細(xì)胞的堿性磷酸酶活性測定Fig.4 ALP activity of osteoblasts after treatment with VD3,25(OH)VD3 and 1α,25(OH)2VD3

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖5 VD3、25(OH)VD3、1α,25(OH)2VD3處理成骨細(xì)胞21 d鈣含量測定Fig.5 Determination of calcium in osteoblasts treated with VD3,25(OH)VD3,or 1α,25(OH)2VD3 for 21 days

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖6 qRT-PCR法檢測Runx 2和OCN相關(guān)mRNA的表達(dá)Fig.6 Runx 2 and OCN mRNA expressions were detected with qRT-PCR

2.6 ELISA測定骨鈣素濃度

ELISA檢測結(jié)果顯示，VD3和1α,25(OH)2VD3在任何濃度下都不能顯著促進(jìn)OCN的分泌(圖7)。200 nmol/L 25(OH)VD3處理組OCN的分泌顯著高于其他各組(P<0.0 1或P<0.00 1)。

注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖7 ELISA法測定骨鈣素濃度Fig.7 The concentration of osteocalcin was measured with ELISA method

3 討論

骨的形成和重塑需要多種細(xì)胞的協(xié)作，其中成骨細(xì)胞在骨骼發(fā)育和骨損傷修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用。成骨細(xì)胞不僅調(diào)節(jié)骨的礦化，還間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的骨吸收功能，它的數(shù)量和功能變化直接影響骨的生物學(xué)特性。長期以來，藥物治療被認(rèn)為是最簡單和可靠地促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和生物礦化的方式。維生素D作為在骨骼發(fā)育上起重要作用的營養(yǎng)物質(zhì)[2]，除了可以通過飲食獲得，更主要是依賴于紫外照射通過皮膚合成。人體中的維生素D主要是維生素D3，其作為一種脂溶性維生素，本身沒有生物活性，維生素D3的代謝產(chǎn)物是體內(nèi)的主要活性形式，其在體內(nèi)的作用是多種多樣的，與鈣平衡和骨骼發(fā)育密切相關(guān)[1-2]。維生素D及其代謝物在血清中結(jié)合維生素D結(jié)合蛋白后轉(zhuǎn)運(yùn)至肝臟，在肝臟中，維生素D的C-25 端被羥化產(chǎn)生 25-羥基維生素D3[25(OH)VD3]，25(OH)VD3在血中的濃度是體內(nèi)維生素D狀態(tài)的最可靠指標(biāo)，25(OH)VD3在腎臟中進(jìn)一步通過1α羥基化作用產(chǎn)生活性形式的1α,25(OH)2VD3，1α,25(OH)2VD3通過與其高親和力維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)的相互作用調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄來發(fā)揮其大部分的生物學(xué)效應(yīng)。1α,25(OH)2VD3具有調(diào)節(jié)鈣、磷代謝的活性，其機(jī)制已得到廣泛研究[10]。

我們的研究證實VD3對成骨細(xì)胞的分化和生物礦化幾乎無幫助，與VD3和1α,25(OH)2VD3相比，僅25(OH)VD3處理后的成骨細(xì)胞胞外基質(zhì)鈣沉積明顯增加。25(OH)VD3作為一種活性激素，在一些類型的細(xì)胞[5-6]中不轉(zhuǎn)化為1α,25(OH)2VD3，二者具有不同的生物學(xué)作用。由此，我們推測，25(OH)VD3對成骨細(xì)胞分化和生物礦化的積極影響不是由1α,25(OH)2VD3介導(dǎo)的，因為成骨細(xì)胞中CYP27B1的mRNA表達(dá)幾乎不隨25(OH)VD3濃度的增加而改變。同樣地，VD3也不能使成骨細(xì)胞中CYP24A1的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)，因此，基于上述的研究結(jié)果推測VD3不可被成骨細(xì)胞代謝，不能對成骨細(xì)胞的分化和生物礦化產(chǎn)生明顯的刺激作用。

盡管25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3在誘導(dǎo)hMSCs成骨譜系標(biāo)志物(Runx2、ALP、OCN等)方面已被證實有效[12-15]，但VD3，25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3對成骨細(xì)胞分化的潛在作用仍不清楚。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3可以劑量依賴性的方式促使早期成骨標(biāo)志物(Runx2、ALP等)的表達(dá)，而只有25(OH)VD3能促進(jìn)成骨細(xì)胞OCN基因和蛋白的表達(dá)，提高成骨細(xì)胞的生物礦化水平。25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3可以促進(jìn)Runx2和ALP的表達(dá)，這與已報道的部分研究略有不同[16-17]。差異的產(chǎn)生可能是由于1α,25(OH)2VD3對成骨細(xì)胞分化的影響是通過不同的信號途徑進(jìn)行的[18]。

在本研究中，我們根據(jù)VD3、25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3的血清生理濃度選擇了藥物處理濃度。目前對于理想的25(OH)VD3血清水平，國際、國內(nèi)多數(shù)機(jī)構(gòu)和專家認(rèn)為，25(OH)VD3的血清濃度范圍為75～150 nmol/L,血清濃度低于 50 nmol /L為維生素 D 缺乏，若血清25(OH)VD3濃度超過375 nmol /L則可能出現(xiàn)維生素 D 中毒[19-22]。美國國立衛(wèi)生研究院NIH的MedlinePlus醫(yī)學(xué)信息網(wǎng)和美國國家醫(yī)學(xué)院 IOM食品與營養(yǎng)委員會向公眾推薦25(OH)VD3的最佳濃度分別為75～185 nmol/L和50 nmol/L[23]。因此，我們使用50～200 nmol/L VD3和25(OH)VD3作為研究濃度。我們的研究發(fā)現(xiàn)，只有200 nmol/L VD3能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，而25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3不能顯著促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。體外在該濃度下VD3、25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3對成骨細(xì)胞無細(xì)胞毒性，該結(jié)果與既往的相關(guān)研究結(jié)果是一致的，即血清中25(OH)VD3低于500 nmol/L沒有細(xì)胞毒性發(fā)生[24-25]。此外，我們發(fā)現(xiàn)100～200 nmol/L的25(OH)VD3是誘導(dǎo)成骨的最佳濃度，考慮到成骨是一個長期的生理過程，理化性質(zhì)更穩(wěn)定的VD3代謝物更好。既往研究表明，25(OH)VD3和1α,25(OH)2VD3的半衰期分別為2～3周和4 h[26]，這說明25(OH)VD3比1α,25(OH)2VD3更穩(wěn)定。另外，25(OH)VD3本身的疏水性高于1α,25(OH)2VD3，更易被細(xì)胞攝取。

綜上所述，與VD3和1α,25(OH)2VD3相比，25(OH)VD3具有諸多優(yōu)點，其在成骨分化和骨損傷修復(fù)中具有不可或缺的重要作用。進(jìn)一步探索更精確的25(OH)VD3使用濃度范圍和促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的可能機(jī)制是十分必要的。我們的研究結(jié)果證實25(OH)VD3在100～200 nmol/L范圍內(nèi)可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化及生物礦化，為其在臨床骨質(zhì)疏松癥和骨組織工程中的應(yīng)用提供了依據(jù)。