楊鎧寧 楊芳 邸貴鑫 林庶茹 陳晨

遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)以骨量減少、骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，最終導(dǎo)致骨脆性增加并易于發(fā)生骨折[1]。隸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范疇。

相關(guān)研究表明，骨骼和肌肉的協(xié)調(diào)性可能與SDF-1的相關(guān)表達(dá)有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)采用中醫(yī)不同治法(補(bǔ)腎陰法、補(bǔ)腎陽法、健脾法、補(bǔ)腎健脾法)對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠進(jìn)行預(yù)防治療，通過觀察不同治法下，大鼠骨代謝生化指標(biāo)血清ALP、TRACP及骨骼、肌肉中SDF-1的表達(dá)情況，以中醫(yī)基礎(chǔ)理論“脾腎相關(guān)”“骨肉不相親”為指導(dǎo)，探討骨骼和肌肉的協(xié)調(diào)性對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥形成的影響，以求為中醫(yī)防治骨質(zhì)疏松癥提供進(jìn)一步依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

Wistar雌性大鼠91只，SPF級，體質(zhì)量(200±20)g，3月齡。從遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司購入，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證：211002300050643。飼養(yǎng)溫度維持在24 ℃，相對濕度50 %，自由攝水。大鼠墊料和飼料從沈陽茂華生物科技有限公司購入，使用前均輻射消毒。

1.2 試劑與儀器

1.2.1主要試劑：Rat ALP ELISA kit批號：201911(AMEKO)；Rat TRACP ELISA kit批號：201911(AMEKO)；Rat SDF-1 ELISA kit批號：201911(AMEKO)。

1.2.2儀器：MR1822低溫高速離心機(jī)(法國Jouan SA)；MM400高通量組織研磨機(jī)(Retsch)；INFINITE M200多功能酶標(biāo)儀(瑞士TECAN)。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

補(bǔ)腎陰組采用左歸丸，藥物組成有熟地黃、山萸肉、山藥、牛膝、枸杞、菟絲子、龜甲膠、鹿角膠；補(bǔ)腎陽組采用右歸丸，有熟地黃、山萸肉、山藥、杜仲、枸杞、菟絲子、當(dāng)歸、鹿角膠、制附子、肉桂；健脾組采用補(bǔ)中益氣湯，由黃芪、人參、白術(shù)、炙甘草、當(dāng)歸、升麻、柴胡、陳皮、生姜、大棗組成；補(bǔ)腎健脾組中藥由鹿角膠、熟地黃、淫羊藿、黃芪、黨參、甘草組成；福善美組用藥出自杭州默沙東制藥有限公司。以上用藥均購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院。

1.4 造模及分組

1.4.1造模：各組大鼠(正常組除外)給予10 %水合氯醛溶液(3 mL/kg)，實(shí)施肌肉注射麻醉，于腰背部脊柱旁做縱行切口，暴露兩側(cè)卵巢將其結(jié)扎切除，最后縫合各層切口。

1.4.2分組：術(shù)前先將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為正常組(10只)和手術(shù)組。術(shù)后除正常組外，將手術(shù)組的大鼠隨機(jī)分為6組，即模型對照組(模型組)、補(bǔ)腎陰中藥組(補(bǔ)腎陰組)、補(bǔ)腎陽中藥組(補(bǔ)腎陽組)、健脾中藥組(健脾組)、補(bǔ)腎健脾中藥組(補(bǔ)腎健脾組)和福善美對照藥組(福善美組)。

1.5 給藥

術(shù)后第2天開始灌胃給藥，每日1次，共計(jì)灌胃10周。大鼠胃容積為1 mL/100 g，以此為大鼠配藥及灌胃。其中正常組、模型組灌胃給予0.9 %氯化鈉溶液，補(bǔ)腎陰組、補(bǔ)腎陽組、健脾組、補(bǔ)腎健脾組、福善美組均按成人每公斤體重所用生藥量的6.3倍灌胃(成人體重按60 kg計(jì)算)；每周二早9:00稱量大鼠體重，以此調(diào)整用藥量。

1.6 取材及指標(biāo)檢測

實(shí)驗(yàn)大鼠經(jīng)過相應(yīng)藥物防治10周，末次給藥后，禁食不禁水24 h，進(jìn)行標(biāo)本采集。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)相關(guān)要求，每只大鼠稱重后實(shí)施麻醉，以3 mL/kg注射10 %水合氯醛溶液。用碘伏將手術(shù)處擦拭消毒，開腹抽取腹主動(dòng)脈血5～8 mL/只。取出右后肢股骨和左后肢腓腸肌白肌部分，放入高壓滅菌的EP管內(nèi)并予以標(biāo)記，放入-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。將骨骼和肌肉分別放入約其體積量5倍的MSH 緩沖液中洗擦干凈，稱重后用剪刀剪碎放入勻漿管中，向每個(gè)管中加入小鋼珠，用高通量組織研磨機(jī)以30 Hz研磨5 min。將腹主動(dòng)脈血和勻漿后的骨骼和肌肉放入離心機(jī)，以3 000 r/min離心15 min，然后將離心后取得的上清液放入新的EP管中。各檢測步驟按ELISA試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠血清ALP、TRACP及骨骼、骨骼肌中SDF-1的水平，用EXCEL計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程，以此計(jì)算各指標(biāo)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清ALP、TRACP水平

骨形成指標(biāo)血清ALP測定：模型組大鼠血清ALP水平比正常組顯著升高(P<0.01)；各治療組大鼠血清ALP水平與模型組比均顯著降低(P<0.01)，以福善美組降低最為明顯，補(bǔ)腎健脾組次之，見表1。

骨吸收指標(biāo)血清TRACP測定：與正常組相比，模型組大鼠血清TRACP水平顯著升高(P<0.01)；而各治療組大鼠血清TRACP水平均比模型組顯著降低(P<0.01)，其中以福善美組降低最為明顯，其次為補(bǔ)腎健脾組，見表1。

表1 各組大鼠血清ALP、TRACP水平的比較Table 1 Comparison of serum ALP and TRACP levels among rats in each

2.2 各組大鼠骨組織、骨骼肌SDF-1水平

檢測結(jié)果顯示：模型組大鼠的骨組織SDF-1水平比正常組顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，補(bǔ)腎陽組、福善美組大鼠骨組織SDF-1水平均顯著降低(P<0.01)，健脾組、補(bǔ)腎陰組也明顯降低(P<0.05)；補(bǔ)腎健脾組也有很大程度降低，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

模型組大鼠的骨骼肌SDF-1水平比正常組顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，福善美組、健脾組大鼠的骨骼肌SDF-1水平顯著降低(P<0.01)，其余治療組也有所降低，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組大鼠骨組織、骨骼肌SDF-1水平的比較Table 2 Comparison of bone and skeletal muscle SDF-1 levels among rats in each

3 討論

3.1 “脾腎相關(guān)”與骨痿“骨肉不相親”

《素問·五運(yùn)行大論》曰：“腎生骨髓?！蹦I藏精而精生髓，髓充于骨。腎精是否充足直接決定骨骼是否強(qiáng)壯，若腎精充盛則骨髓充盈，則表現(xiàn)為骨骼強(qiáng)健，壯實(shí)有力。《素問·五臟生成》：“脾之合肉也?！薄端貑枴ぬ庩柮髡摗费裕骸敖衿⒉〔荒転槲感衅浣蛞?。四肢不得稟水谷氣，氣日以衰，脈道不利，筋骨肌肉，皆無氣以生，故不用焉?！逼⒅鬟\(yùn)化，脾作為后天之精的化生之臟，其健運(yùn)如常可確保肌肉充分得到水谷精微的滋養(yǎng)，健壯有力?！端貑枴ゐ粽摗罚骸捌⒅魃碇∪?，腎主身之骨髓?！蹦I屬先天之本，脾乃后天之本，先天生后天，后天養(yǎng)先天，脾和腎的功能發(fā)揮相互影響。腎中陽氣可以溫煦助力脾之運(yùn)化，脾運(yùn)化的后天之精亦可滋養(yǎng)腎中先天之精。當(dāng)后天水谷精微不足，無法充養(yǎng)腎精骨髓、生養(yǎng)肌肉，則致筋骨失養(yǎng)，肌肉骨骼痿弱不用。

《素問·五臟生成》曰:“腎之合骨也，其榮發(fā)也，其主脾也?！惫堑纳L發(fā)育除了受腎的直接影響，還與脾息息相關(guān)?！镀⑽刚摗て⑽竸偎フ摗分杏醒裕骸按蟮制⑽柑撊?，陽氣不能生長，是春夏之令不行，五臟之氣不生。脾病則下流乘腎，……則骨乏無力，是為骨痿。令人骨髓空虛，足不能履地，是陰氣重迭，此陰盛陽虛之癥。”可見，脾虛也是骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病關(guān)鍵?！鹅`樞·經(jīng)脈》又言：“足少陰氣絕，則骨枯。少陰者，冬脈也，伏行而濡骨髓者也，故骨不濡，則肉不能著也；骨肉不相親，則肉軟卻；肉軟卻，故齒長而垢，發(fā)無澤；發(fā)無澤者，骨先死。戊篤己死，土勝水也?！闭f明骨痿者骨不得腎氣濡養(yǎng)，骨骼肌肉不相親和，運(yùn)動(dòng)不相協(xié)調(diào)，可致肌肉痿軟，甚至齒發(fā)枯槁無澤。這也是中醫(yī)對骨骼與肌肉關(guān)系最早的概括。

3.2 SDF-1水平的變化對骨質(zhì)疏松癥影響

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)是最初由骨髓基質(zhì)細(xì)胞分離出來的CXC類趨化蛋白，被命名為CXCL12。SDF-1的趨化作用由其受體CXCR4介導(dǎo)，SDF-1與CXCR4結(jié)合從而啟動(dòng)下游信號通路。實(shí)驗(yàn)表明，SDF-1在包括成骨細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞中存在，SDF-1/CXCR4軸可能參與白細(xì)胞浸潤、炎癥反應(yīng)和器官發(fā)育等一系列重要的生理和病理過程[2]。

林劍彪等[3]發(fā)現(xiàn)軸向應(yīng)力刺激，可以促進(jìn)骨缺損區(qū)組織SDF-1α信號通路高表達(dá)，激活CXCR4信號，以此促進(jìn)骨再生?；⒓蜗榈萚4]通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SDF-1α通過與脛骨軟骨下骨中的CXCR4結(jié)合來促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成，進(jìn)而得出抑制SDF-1α/CXCR4信號通路能預(yù)防創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎骨小梁丟失，還能減緩軟骨退化的結(jié)論。Yang等[5]將91名絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者、88名絕經(jīng)后非骨質(zhì)疏松患者與90名健康女性作對比，發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者血漿CXCL12水平顯著升高。從以上實(shí)驗(yàn)不難看出，SDF-1/CXCR4信號通路的相關(guān)表達(dá)對骨骼的生長發(fā)育產(chǎn)生明顯影響。由此可以推斷，該通路可以作為骨質(zhì)疏松癥在中醫(yī)領(lǐng)域病機(jī)研究的新方向。而本研究中，模型組大鼠骨組織和骨骼肌的SDF-1水平與正常組比較均顯著升高，也恰恰說明去卵巢骨質(zhì)疏松癥大鼠的骨骼發(fā)育受到抑制。

3.3 中醫(yī)不同治法治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的效果

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清ALP和TRACP水平均比正常組顯著升高，說明骨形成和骨吸收均處于較高水平，骨代謝增強(qiáng)，去卵巢致骨質(zhì)疏松癥大鼠造模成功；與模型組比較，各治療組藥物降低大鼠血清ALP和TRACP水平，抑制骨吸收，降低骨轉(zhuǎn)換率，有效防治骨質(zhì)疏松癥，與以往研究結(jié)果一致[6-7]。

補(bǔ)腎陰法在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的研究中，如用六味地黃湯[8]、二至丸[9]等可有效提升去卵巢大鼠雌激素水平，減緩骨代謝失調(diào)；應(yīng)用左歸丸滋補(bǔ)腎陰者在基礎(chǔ)和臨床上也都取得了良好的療效[10-11]。應(yīng)用補(bǔ)腎陽法的研究，如右歸丸[12]、溫腎固疏方[13]等都能改善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的骨密度和相關(guān)通路的表達(dá)。以往也有研究將補(bǔ)腎陰法和補(bǔ)腎陽法治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的效果進(jìn)行比較，二者均有療效，但對比結(jié)果有所不同[14-16]。本研究結(jié)果顯示，此二法均可降低骨骼和肌肉中SDF-1的水平，但補(bǔ)腎陽法對于降低SDF-1水平的效果上要優(yōu)于補(bǔ)腎陰法，能更有效地防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。后續(xù)研究也將對此結(jié)果加以佐證。健脾法的治療經(jīng)常與補(bǔ)腎法合用，運(yùn)用補(bǔ)腎健脾方法對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的療效甚好[17]。

本研究中的補(bǔ)腎二法采用能滋陰補(bǔ)腎、填精益髓的左歸丸和溫補(bǔ)腎陽、填精止遺的右歸丸，均是張景岳的經(jīng)典名方。健脾法使用李東垣的補(bǔ)中益氣湯，具有補(bǔ)中益氣、升陽舉陷之功。補(bǔ)腎健脾法采用鹿角膠、熟地黃、淫羊藿、黃芪、黨參、甘草等補(bǔ)腎健脾的中藥。

結(jié)合以上研究和本研究結(jié)果，補(bǔ)腎陰法、補(bǔ)腎陽法、健脾法和補(bǔ)腎健脾法均可以通過降低骨骼和骨骼肌中SDF-1的水平促進(jìn)二者再生和發(fā)育，增強(qiáng)肌肉收縮力，增加骨骼與肌肉的協(xié)調(diào)性，得以對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥進(jìn)行有效防治；也進(jìn)一步印證了“脾腎相關(guān)”的中醫(yī)基礎(chǔ)理論在骨質(zhì)疏松癥治療上的充分應(yīng)用，“補(bǔ)腎為主，健脾為輔”，為中醫(yī)臨床治療骨質(zhì)疏松癥提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)根據(jù)。